On estime que 50 % des variants pathogènes ou probablement pathogènes ont un effet sur le mécanisme d'épissage. Dans la base de données HGMD (variants pathogènes publiés), seuls 10% des variants ont un effet sur l’épissage (n=29207). Les raisons de cette différence résident très probablement dans notre capacité récente à identifier des variations introniques profondes par l’utilisation facilitée du génome complet et dans le manque de prédictions bioinformatiques fiables pour certaines catégories de variants. En effet, plusieurs éléments codés dans l’ADN sont responsables de la bonne reconnaissance par la machinerie d’épissage des limites exon-intron telles que le site d’épissage canonique incluant le site donneur (5’) et accepteur (3’). Les variations dans ces régions peuvent altérer considérablement le mécanisme d'épissage, provoquant par exemple un saut d'exon ou une intégration totale ou partielle d'intron. Ces régions ont été très bien caractérisées et leurs prédictions sont fiables. D'autres régions, plus difficiles à reconnaître comme le point de branchement ou les éléments de régulation d'épissage tels que les enhancer introniques/exoniques (ISE et ESE) ou les silencer (ISS et ESS), sont plus complexes à prédire. Plusieurs outils bioinformatiques ont été développés au fil du temps, allant d'outils plus anciens tels que MaxEntScan ou plus récents tels que SpliceAI à certains outils dédiés comme Branchpointer pour les points de branchement, et enfin des agrégateurs d’outils tels que SPiP. Plusieurs comparaisons d’outils ont déjà été rapportées sur des gènes en particulier mais rarement de manière compréhensive, ce que nous proposons dans cette étude.

Notre jeu de données d’évaluation est composé d’une part de variants pathogènes ou possiblement pathogènes extraits de HGMD (n=29 207) et ClinVar (n=17 251) et d’autre part de variants bénins ou possiblement bénins extraits de ClinVar (n=176 959) et gnomAD v2 (28 538 des génomes et 121 504 des exomes, avec une fréquence allélique > 3%). Au total, 638 219 variants non redondants sont considérés dont 41 341 pathogènes et 596 878 comme bénins. L'examen de la distribution des variants pathogène sur le gène révèle que la majorité d'entre eux sont situés sur les sites d'épissage consensus (n=38 710, 94,1 %).

L'ensemble de données a été utilisé pour évaluer 7 programmes dont MaxEntScan, MMSplice, NNSplice, SPiP, SpliceAI (2 paramétrages), SQUIRLS, SSF-like. D’autres algorithmes ou score sont encore en cours de traitement (par exemple CADD). Les résultats de cette étude sont exprimés sous la forme de courbes ROC et l'analyse de l’aire sous la courbe (AUC) révèlent des performances proches pour les sites consensus et des différences notables avec 3 outils plus performants pour les autres types de variants (SpliceAI, SQUIRLS et SPiP). Les résultats détaillés seront présentés permettant de définir un pipeline bioinformatique efficace pour l’évaluation des variations affectant l’épissage.

L’avènement du séquençage de génome lors des plans nationaux ont permis la mise en évidence de nombreux variant intronique ayant un effet potentiel sur l’épissage. Par ailleurs, certaines études suggèrent que jusqu’à 20% des variants affectant les régions codantes pourraient avoir un effet sur l’épissage. Les scores de prédictions développés ces dernières années sont insuffisamment efficace, en particulier pour l’analyse des variants introniques profonds. Dans un papier récent, nous avons montré dans une cohorte de patients avec un syndrome d’Alport lié à l’X, que seuls 60% des variants introniques profonds identifiés chez les patients, et dont l’effet sur l’épissage avait été prouvé, étaient décrit comme altérant probablement l’épissage par les scores de prédictions.  Ces éléments prouvent que l’obtention d’une preuve fonctionnelle est indispensable avant de conclure à la pathogénicité d’un variant impliquant l’épissage. Dans ce contexte, nous avons développé une approche de séquençage d’ARN basée sur la capture d’ADN complémentaire issu de tissus d’intérêt des patients. Cette approche pouvant être réalisée avant ou en parallèle des études génomique permet la mise en évidence de nombreux évènements d’épissage. L’objectif de ce travail était de développer une interface bio-informatique permettant la caractérisation, le tri et la présentation des évènements d’épissage identifiés chez un patient.

 A partir des données issues du séquençage du cDNA de patients après capture par les différents panels utilisés dans le service de génétique moléculaire, nous avons aligné (Hisat2), puis annoté chaque évènement d’épissage (Sambamba) pour isoler les évènements non canoniques. Ces derniers ont ensuite été triés selon leur effet sur l’épissage (saut d’exon / rétention d’intron), et la probabilité de leur pathogénicité basée sur différents critères : (1) qualité de l’évènement, (2) profondeur de séquençage, (3) caractère déjà vu de cet évènement dans notre base de données et (4) le « bruit de fond » au niveau des jonctions proches. Les évènements dans les gènes incriminés sont ainsi classés et présentés à l’utilisateur associé à un visuel direct du sashimi plot correspondant à l’évènement. L’accès de l’utilisateur à ces évènements triés, et au paramétrage de ces différents filtres a été proposé dans le cadre d’une nouvelle interface appelée PolySplice.

L’utilisation de cette interface permet ainsi l’identification des évènements d’épissage issus du séquençage d’ARN des patients, et confirmer la pathogénicité des variants identifiés en comparant ces évènements à une base de données interne alimentée continuellement. A l’avenir, il est prévu que cet outil soit relié au pipeline d’identification des variants génomiques (Polyviewer) afin d’intégrer les données issues des analyses génomiques et transcriptomiques.

L'identification précise des anomalies d'épissage génétique est un enjeu essentiel en génétique constitutionnelle puisqu’environ 15 à 30 % des variants délétères responsables de maladies héréditaires entraînent des modifications dans l'épissage des gènes. Bien que des solutions de séquençage d'ARN existent depuis des années pour quantifier l'expression génique et détecter des gènes de fusion dans les tumeurs, l'utilisation du RNAseq pour l'analyse de l'épissage reste limitée dans le diagnostic moléculaire de routine.

Le RNASeq développé dans notre laboratoire a deux objectifs principaux : offrir une analyse complémentaire aux patients pour lesquels le diagnostic reste suspect malgré des tests constitutionnels négatifs, et aider à interpréter les variants de classe 3 en recherchant leurs conséquences fonctionnelles sur l'épissage. Notre panel de 160 gènes d'intérêt en oncologie, médecine interne et neurologie est analysé avec l’ARN extrait à partir de de tubes Paxgene. Le séquençage de 16 échantillons est fait avec un séquenceur Illumina NextSeq 500.

La détection et la quantification des épissages alternatifs, tels que les sauts d'exon, les troncatures ou les élongations d'exon, ainsi que la rétention d'introns ou la création de néo-exons, présentent un défi. Actuellement, il existe peu d'outils performants répondant à ces besoins. Pour pallier ce manque, l'équipe de bioinformatique des Hospices Civils de Lyon a développé le pipeline SAMI, qui peut détecter, annoter et quantifier des jonctions d'épissage physiologiques et aberrantes à partir de données de séquençage RNAseq.

Ce pipeline, basé sur Nextflow et tirant partie des UMI pour éliminer les duplicats de PCR, classe chaque jonction détectée en quatre catégories : Annotated (jonction physiologique), Plausible (jonction anormale entre deux sites d’épissage connus : saut d’exon), Anchored (jonction avec un site d’épissage connu : rétention ou élongation d’exon) et Unknown (jonction sans site d’épissage connu : néo-exon). L'analyse des données est comparative entre les échantillons d’un même run, en utilisant des critères tels que la profondeur de séquençage (Reads > 5), le nombre de récurrences ( < ou = 2) et un index PSI (Percent Spliced In > 1%) pour sélectionner les jonctions d'intérêt. Les anomalies d'épissage sont visualisées via des Sashimi plots générés par SAMI et IGV.

Les résultats obtenus avec SAMI sont prometteurs, détectant les anomalies d'épissage attendues et en y ajoutant parfois des anomalies complémentaires. Malgré des difficultés persistantes dans la détection des néo-exons introniques profonds, le pipeline montre une bonne reproductibilité et répétabilité pour les gènes suffisamment exprimés dans le sang.

Nous envisageons une mise en production du RNAseq au laboratoire comme analyse de seconde intention et nous n’écartons pas d’utiliser en parallèle d’autres pipelines (Splice-Laucher par exemple de nos collègues de Caen) pour une analyse complémentaire.

Bien que ces 15 dernières années aient vu le séquençage d’ARN à haut débit remplacer progressivement les puces transcriptomiques, l’informativité supplémentaire de cette technique concernant l’épissage reste à exploiter en clinique. De nombreux outils ont été développés pour quantifier des isoformes connues a priori (RSEM, kallisto) ou comparer des groupes d’échantillons (rMATS, MAJIQ), mais peu de solutions sont adaptées au contexte clinique le plus fréquent : retrouver des événements d’épissage uniques dans des échantillons isolés.

C’est dans cette optique que nous avons développé SAMI (Splicing Analysis with Molecular Indexes), un pipeline Nextflow capable d’identifier et représenter graphiquement de tels événements en prenant en charge l’analyse complète d’un séquençage d’ARN à haut débit (contrôles qualités, déduplication basée sur les UMI, alignement, quantification de l’expression, détection des événements d’épissage aberrants et fusions de gènes). L’utilisation des technologies Nextflow (pipeline) et Singularity (conteneurisation) en font un outil simple à diffuser et déployer, aussi bien en local que dans le cloud.

Appliqué à un contrôle commercial séquencé sur un premier panel de 17.6 kb dédié au cancer de poumon, SAMI a été en mesure de détecter 13/13 sauts de l’exon 14 de MET et 12/13 sauts d’exons 2-7 correspondant au variant EGFRvIII. Bien qu’initialement développé pour l’épissage, SAMI a également démontré un potentiel pour l’identification de gènes de fusions, en retrouvant les 15 événements de fusions attendus dans l’échantillon contrôle avec une sensibilité au moins équivalente à Arriba et STAR-Fusion, des outils de référence en la matière.

Dans un second panel de 2.44 Mb dédié aux cancers hématologiques, l’application de SAMI a un plan d’expérience plus proche de la recherche (comparaison de patients atteints de syndromes myélodysplasiques avec et sans mutations de SRSF2) a également donné des résultats très satisfaisants, en retrouvant l’exon « poison » d’EZH2 décrit précédemment dans ce contexte.

L’application de SAMI et d’un outil équivalent (SpliceLauncher) à un troisième panel de 1.12 Mb fait l’objet d’une seconde soumission indépendante. Bien qu’applicable en l’état au séquençage de transcriptomes complets, ce dernier cas de figure fait encore l’objet de développements et d’optimisations à l’heure actuelle.

Le séquençage d’ARN (RNAseq) est un outil indispensable pour l’évaluation fonctionnelle post-génomique de certains variants (intronique ou non) affectant l’épissage. Son utilisation est parfois rendue difficile en cas de gène dont l’expression est limitée à un tissu spécifique et peu accessible comme c’est le cas du tissu rénal. Par ailleurs, l’étude des transcrits nécessite une profondeur de couverture importante, parfois difficile à atteindre.

Dans cette étude, nous appliquons une technologie de RNAseq ciblé par capture d’un panel de 228 gènes impliqués dans les maladies rénales monogéniques, à différents tissus (rein, sang, fibroblastes et urines) issus de patients présentant un variant affectant l’épissage identifié préalablement. Nous comparons ainsi les profils d’expression des différents gènes capturés dans chaque tissu et interprétons le retentissement de chaque variant identifié sur l’épissage de l’ARN considéré.

Nous avons pu étudier plusieurs échantillons pour chaque tissu. En moyenne, 11 176 reads s’alignaient sur les jonctions exons-exons identifiées (soit environ 354 reads/jonction) assurant une profondeur de lecture moyenne suffisante à l’interprétation des évènements d’épissage. L’analyse en cluster des différents prélèvements a permis de retrouver une homogénéité des tissus ce qui témoigne de la reproductibilité des résultats (Figure 1). A titre d’exemple, l’étude de l’ARN issu des urines totales de trois patients a permis l’analyse de l’épissage de 222/228 gènes capturés. Dans tous les cas, l’étude spécifique des transcrits d’intérêts ont permis de valider la conséquence du variant sur l’épissage pour les gènes PKHD1, NPHS2 et PODXL (tissu rénal), COL4A4 et COL4A5 (urines totales), COQ2 et NUP93 (fibroblastes), BBS9 et COQ8B (sang). L’ensemble de ces données ont été analysées grâce à une interface spécialement conçue pour cette analyse, permettant de hiérarchiser les évènements identifiés : PolyRNAseq.

Dans ce travail, nous montrons que l’étude de l’ARN total issu de différents tissus permet l’interprétation fonctionnelle des variants ayant un effet sur l’épissage. Nous montrons que dans le domaine de la néphrogénétique, l’ARN total issu des urines permet l’interprétation des évènements dans la presque totalité des 228 gènes étudiés.

Les analyses de routine par panel de gènes permettent désormais d’identifier les variants pathogènes dans les gènes cliniquement pertinents en oncogénétique. Cependant, de nombreux variants de signification incertaine (VSI) sont également mis en évidence, dont une grande partie pourrait avoir un impact sur la transcription et l’épissage des ARNm. Plusieurs logiciels tentent de prédire l'impact des variants sur l'épissage et permettent ainsi de sélectionner les variants pour lesquels il est important d'étudier l'effet sur les transcrits. L’analyse des ARNm permet également de préciser le caractère en tandem des grandes duplications et peut être utile pour la recherche de variants introniques profonds difficiles à identifier en panel ADN.

Notre étude présente ainsi l’analyse de 53 VSI par capture et séquençage ciblé d’un panel de 38 gènes, sur des ARN totaux extraits d’échantillons sanguins de patients. Des RT-PCR, du séquençage Sanger des ARNm des patients ou des analyses monoalléliques de mini-gènes ont également été réalisés en complément lorsque cela était nécessaire.

Sur les 57 VSI analysés par panel ARN, 23 variants (40%) ont montré une modification partielle ou totale des transcrits (effet sur l’épissage ou duplication d’exon en tandem). Treize variants (23%) ont pu être classés comme pathogènes ou probablement pathogènes. Sur les 34 VSI sans impact observé sur l’épissage, 21 (62%) ont pu être classés probablement neutres. Les données obtenues pour 4 variants seront présentées de manière exhaustive : PTEN c.206+6T > G, MLH1 c.791-489_791-20del, BRCA2 c.68-8_68-7delinsAA et MSH2 c.(1076+1_1077-1)_( 1276+1_1277 -1)dup.

Ces 4 exemples illustrent l’utilité du séquençage de panels ARN réalisés sur prélèvements sanguins pour aider à classer les VSI avec un effet sur l’épissage prédit. Cette technique peut également être utile pour caractériser les grandes duplications et pour rechercher l’impact de variants introniques profonds sur les transcrits exprimés.

Le séquençage à haut débit de l’ARN  (RNA-seq) constitue une approche de validation fonctionnelle complémentaire à celle du séquençage de l’ADN. Il permet la mise en évidence de jonctions aberrantes suite à un épissage alternatif ou à la présence de gènes de fusion, la détection de variants mais aussi l’expression différentielle des gènes. Plusieurs études ont montré l’intérêt majeur de cette technique qui améliore le rendement diagnostique et permet de reclassifier des variations de signification incertaine représentant un challenge pour les laboratoires de génétique en l’absence de données d’études fonctionnelles.

Nous avons mis en place dans notre laboratoire de neurogénétique moléculaire une double approche qualitative du séquençage de l’ARN messager ciblé et total dans un contexte de caractérisation de variants de signification incertaine ayant un impact prédit sur l’épissage et mis en évidence préalablement en DNA-seq panel, exome et aussi en Génome (plateformes nationales SeqOIA et AURAGEN). Les ARNs sont extraits à partir de cellules lymphocytaires (Tube Paxgene) ou de fibroblastes (Biopsie de peau), et plus rarement à partir de tissu fœtal (Muscle, Poumon) selon l’expression du gène d’intérêt. Nous procédons par la suite à la sélection des ARNm par la capture de la queue polyA puis déplétion ou non en globine et en ARN ribosomal selon l’analyse souhaitée et le type d’échantillon utilisé. Pour l’analyse mRNA ciblée, nous capturons par la suite 250 gènes impliqués dans nos pathologies d’intérêt (maladies congénitales ou très précoces du cervelet et du tronc cérébral, et mouvements anormaux à début pédiatrique). Le traitement bioinformatique des données a été initialement assuré par Génosplice lors de la mise en place de la technique, puis nous avons effectué une transition vers une utilisation en routine diagnostique sur la plateforme MOABI(APHP), Ces deux pipelines intègrent l’outil d’alignement STAR pour l’analyse qualitative des jonctions aberrantes. L’interprétation des résultats est réalisée d’une part à partir d’un fichier de comptage de jonctions présentes au niveau de l’échantillon et le calcul du ratio des jonctions d’inclusion et d’exclusion et d’autre part par la visualisation des BAMs jonctions en Sashimi Plot sur IGV. 82% des gènes panel sont analysables à partir d’ARN extrait sur Tube Paxgene contre 63 % des gènes mRNA total.

Cette approche nous a permis de reclasser à ce jour 57% des variants testés de signification incertaine en probablement pathogène ou pathogène selon la classification ACMG et confirme l’intérêt de l’implémentation de cette technique en routine dans un laboratoire de diagnostic. Plusieurs exemples de RNAseq ciblé et total seront présentés ainsi qu’un comparatif des différents processus techniques utilisés.

CONTEXTE : Les variants mono-nucléotidiques, ou « single-nucleotide variants » (SNVs), au sein des séquences codantes des gènes peuvent influencer profondément l'épissage du pré-ARNm, avec d'importantes implications en termes de diagnostic et de traitement personnalisé. L'analyse de l’effet des SNVs sur l'épissage à partir d’échantillons biologiques se heurte souvent à des contraintes pratiques. Bien que les outils in silico fournissent des prédictions de plus en plus fiables, ils ne répondent pas à eux seuls aux normes de classification clinique. Nous avons précédemment mis au point un test d'épissage in vitro dans un modèle de gène complet (FLGSA, « full-length gene splicing assay »), permettant une caractérisation fine des effets de variants codants et introniques du gène SPINK1, un gène associé à la pancréatite chronique. Cette nouvelle étude vise à exploiter les avantages du test FLGSA, en conjonction avec les capacités prédictives de SpliceAI, pour interpréter de manière prospective l'impact de tous les SNVs codants potentiels dans le gène SPINK1 sur l'épissage.

RÉSULTATS : Une corrélation rétrospective comparant les données du FLGSA avec les prédictions de SpliceAI pour un total de 62 SNVs codants (n = 27) et introniques (n = 35) connus de SPINK1 a d’abord été réalisée. Sur la base des résultats de cette corrélation croisée, 35 SNVs potentiels (score SpliceAI : 0,00 – 0,93) sur 16 positions nucléotidiques codantes ont été sélectionnés pour une analyse fonctionnelle par l’approche FLGSA. En fin de compte, nous avons obtenu des données FLGSA pour 62 SNV codants. Ces 62 SNVs représentent 8,6 % des 720 SNVs potentiels dans la séquence codante de SPINK1 (80 codons ; 3 positions/codon ; 3 variants/position), pour un total de 42 positions nucléotidiques (soit 17,5% des 240 nucléotides de l’ORF). Les tests fonctionnels ont révélé un effet délétère pour 12 SNVs, dont 9 qui conduisaient à la production du transcrit de type sauvage et de transcrits aberrants, et trois qui conduisaient uniquement à la production de transcrits aberrants. Ces 12 SNVs étaient tous localisés dans les exons 1 et 2. Nous avons réalisé une nouvelle corrélation croisée des données FLGSA et SpliceAI dans le contexte des 62 variants codants (12 variants ayant un effet délétère, et 50 variants neutres), suggérant qu’aucun des variants potentiels non-sélectionnés, donc non-testés par FLGSA, n’aura d’impact fonctionnel significatif. Cela conduit à l’estimation d’un effet sur l’épissage du pré-messager du gène SPINK1 de seulement 12 des 720 variants codants possibles, soit 1,67%.

CONCLUSIONS : En comparant les prédictions obtenues par SpliceAI et les données du test in vitro FLGSA, nous concluons que moins de 2 % (1,67 % dans cette étude) de tous les SNVs codants possibles de SPINK1 auraient un effet significatif sur l'épissage.

Le diagnostic moléculaire à haut débit est essentiel dans la prise en charge des patients en oncogénétique. La découverte d’un variant pathogène permet d’identifier les individus à risque, d’adapter la surveillance, de guider les interventions chirurgicales préventives voire thérapeutiques. Cependant, le rendement diagnostique de ces analyses n’est pas satisfaisant, seulement 10% pour la prédisposition au cancer du sein et/ou de l’ovaire et 25% pour la prédisposition aux cancers digestifs. Afin d’améliorer l’identification de ces variants il est impératif de perfectionner l’interprétation des variations de signification incertaine (VSI) largement identifiées dans nos laboratoires. Une meilleure exploration des variants d’épissage, sous explorés par manque de moyen, permettrait ainsi de reclasser un grand nombre de ces variants. Ainsi, pour élucider une partie de cette hérédité manquante, nous proposons de réaliser une étude de l’ARN, en panel à haut débit, de manière concomitante et systématique à l’analyse génomique. Ceci est rendu possible par une technique développée au sein de l’unité Inserm U1245 : SEALigHTS pour Splice and Expression Analysis by Exon Ligation and High Throughput Sequencing (Levacher et al., 2023). Cette technique permet l’exploration simultanée de toutes les jonctions exon-exon d’un panel de 44 gènes et peut être réalisée pour 64 patients en 2 jours et demi pour 30 euros par patient. En pratique, après rétrotranscription, des sondes dessinées à chaque extrémité d’exon vont s’hybrider puis se liguer si elles sont accolées, pour enfin être amplifiées et séquencées par NGS. Cette technique a été validée par l’analyse de 30 variations d’épissage documentées au titre du diagnostic. Nous avons également exploré en SEALigHTS 37 patients très évocateurs d’une prédisposition au cancer sans variation pathogène identifiée jusqu’alors, permettant de réaliser 6 nouveaux diagnostics par l’identification d’une anomalie de l’épissage puis de son altération génomique en regard. Fort de ces résultats encourageants nous avons initié le projet STRATEGIC (STRucturation de l’Analyse des Transcrits dEs Gènes Impliqués dans les Cancers héréditaires en Normandie et Nord-Pas de Calais) financé par le Cancéropôle Nord-Ouest et porté par le CHU de Rouen en collaboration avec le centre François Baclesse à Caen et le CHU de Lille dans le cadre de la FHU G4 génomique. Ce projet a pour objectif d’inclure 1000 patients vus en consultation de génétique pour prédisposition héréditaire au cancer du sein et/ou de l’ovaire ou aux cancers digestifs chez qui nous réaliserons l’analyse concomitante de l’ADN et de l’ARN par SEALigHTS. La puissance d’une interprétation conjointe se révèle être un avantage majeur pour les patient.es en diminuant l’errance diagnostique et l’incertitude liée aux VSI. L’accumulation des données d’épissage au cours de ce projet pourra également se révéler précieuse pour améliorer nos connaissances des corrélations génotype-phénotype.

Le diagnostic génétique des patients présentant une suspicion clinique d'albinisme est essentiel pour adapter les soins aux patients en fonction du type (syndromique, oculaire ou oculocutané) et offrir un conseil génétique aux familles. A ce jour, environ 30% des patients restent génétiquement non résolus avec une proportion importante d'entre eux (60%) présentant au moins un variant de signification inconnue (VSI) dans l'un des 20 gènes connus d’albinisme.

Nous nous sommes intéressés aux patients suspectés d’albinisme oculocutané de type 2 (OCA2) présentant au moins un VSI rare dans le gène OCA2. Dans cette étude, nous avons sélectionné les VSI dans et autour de l’exon 10. Cet exon est connu pour être sensible au saut lors de l’épissage conduisant, chez les sujets contrôles sains, à une fraction minoritaire de transcrits non fonctionnels délétés de l’exon 10. Par une approche fonctionnelle, nous avons cherché à savoir si les VSI dans ou autour de l’exon 10 pouvaient significativement augmenter le saut de cet exon et résulter en un défaut de production de protéine fonctionnelle suffisant pour entraîner la pathogénicité.

En combinant plusieurs approches (essai par minigène, caractérisation de transcrits issus de biopsies de peau), nous avons montré que 3 variants introniques ainsi que deux variants synonymes augmentent significativement le saut de l’exon 10 nous permettant de les classer pathogènes (Michaud et al. 2023). Nous complétons cette étude en mesurant l’effet de ces variants rares en fonction de la présence de variants bénins de la région. En particulier, l’influence du SNP c.1065G > A;p.(Ala 355=), majoritaire dans les populations européennes à peau claire, est en cours d’évaluation. Chez la souris, l’exon 10 d’Oca2 n’est pas sensible au saut. Ce constat nous permet de sélectionner les quelques nucléotides non homologues entre les deux espèces, pour tester par minigène leur capacité à contrôler l’épissage dans la perspective d’identifier les séquences critiques et donc d’améliorer les outils de prédiction.

De façon intéressante, nous montrons que les erreurs d'épissage ainsi que d'autres anomalies touchant les transcrits d’OCA2 peuvent être détectées directement à partir d'échantillons de cellules sanguines, ce qui permet d’éviter le recours à des biopsies invasives de peau. Nous recommandons donc le prélèvement systématique d'un échantillon d'ARN sanguin chez les patients suspectés d’OCA2 dont le diagnostic génétique n'est pas concluant (ex : un seul variant pathogène dans OCA2 ; 1 VSI ; 2 VSI en trans).

Michaud V, Sequeira A, Mercier E, Lasseaux E, Plaisant C, Hadj-Rabia S, Whalen S, Bonneau D, Dieux-Coeslier A, Morice-Picard F, Coursimault J, Arveiler B, Javerzat S. Unsuspected consequences of synonymous and missense variants in OCA2 can be detected in blood cell RNA samples of patients with albinism. Pigment Cell Melanoma Res. 2023 Aug 31. doi: 10.1111/pcmr.13123. Epub ahead of print. PMID: 37650133.

La voie de l'hypoxie est un mécanisme moléculaire essentiel qui permet l’adaptation au taux d’oxygène et repose sur la régulation du facteur inductible par l’hypoxie HIF alpha. En normoxie, le gène VHL contribue à la dégradation de ce facteur, inhibant ainsi l’expression de ces gènes cibles associés notamment à la survie, la prolifération et l'angiogenèse.

Les mutations germinales du gène VHL sont associées au développement de deux phénotypes distincts. Des mutations hétérozygotes entraînent le développement de tumeurs hypervascularisées : hémangioblastomes, carcinomes rénaux à cellules claires et phéochromocytomes (maladie de von Hippel-Lindau). Des mutations homozygotes sont associées à la surexpression d’érythropoïétine (EPO) qui entraîne une surproduction de globules rouges (polyglobulie). Dans le but d’améliorer le suivi et le diagnostic des patients, les mécanismes moléculaires complexes sous-jacents à ces deux phénotypes sont explorés par le laboratoire. Notre travail porte sur l’hypothèse d’un modèle d’oncogenèse en gradient qui suggère une corrélation directe entre l’importance des conséquences fonctionnelles des mutations et la gravité des symptômes cliniques observés.

Le gène VHL, constitué de trois exons, code deux transcrits majeurs. Le premier transcrit contient les trois exons et code une protéine activement impliquée dans la dégradation de HIF, tandis que le second, résultant d’un saut d'épissage de l'exon 2, code une protéine qui a perdu la propriété de réguler HIF.

Treize mutations localisées dans l'exon 2 de VHL identifiées chez des patients avec polyglobulie (n=5) ou atteints de la maladie de VHL (n=8) ont été étudiées à l'aide d'un test "minigène" rapporteur d’épissage dans différentes lignées cellulaires. Il a pu être mis en évidence que la dérégulation de l'épissage (saut de l'exon 2) causée par les mutations associées au développement de tumeurs est plus importante que l'impact des mutations associées aux polyglobulies. Cette observation est un argument en faveur de l’hypothèse d’oncogenèse en gradient.

Afin d'élucider les mécanismes moléculaires responsables du saut de l’exon 2 en présence de mutations spécifiques de VHL, les protéines de liaison à l'ARN (RNA-Binding Proteins - RBP) impliquées dans la régulation de cet épissage différentiel ont été recherchées. Les RBP liées aux sondes ARN de la séquence de l’exon 2 de VHL sauvage ou muté ont été précipitées par la technique de RNA-Protein Pull-Down puis identifiés par spectrométrie de masse. Cette étude s’est concentrée sur les mutations : c.413C>T (P138L), c.413C>G (P138R) et c.414A>G (P138P), respectivement associées aux phénotypes de polyglobulie, carcinome rénal à cellules claires sporadique et maladie de VHL.

L'identification d'acteurs protéiques spécifiques de la régulation de l'épissage de VHL pourrait constituer de nouvelles pistes de ciblage thérapeutique visant à inverser le ratio d'expression des deux transcrits VHL en faveur du transcrit correctement épissée.

Introduction : Le complexe cohésine joue un rôle critique dans la structure chromatinienne et la régulation de l'expression des gènes. Le syndrome de Cornelia de Lange (CdLS) est une transcriptomopathie liée à des altérations de ce complexe. NIPBL, le principal gène du CdLS, code le facteur de chargement de la cohésine, en lien avec son partenaire MAU2. Les conséquences de l'expression génique des variations pathogènes, nucléotidiques ou structurales, de NIPBL permettront une meilleure compréhension du syndrome et pourraient être utilisées comme des biomarqueurs potentiels.

Méthodes : Par CRISPR/Cas9, nous avons introduit, dans une lignée iPSC, les variations pathogènes de NIPBL suivantes, à l'état hétérozygote ou homozygote : p.Arg45*, p.Arg834*, p.Ser1466Lysfs*13, p.Asp2157Gly et p.Arg2298Cys, ainsi que des indels entrainant un décalage de cadre dans les exons correspondants. Nous avons évalué les niveaux d'ARNm de NIPBL et de MAU2 par RT-ddPCR et RNAseq et mesuré les niveaux protéiques de NIPBL et de MAU2 par western-blot. Nous avons ensuite utilisé les données de RNAseq pour établir une signature transcriptomique des altérations de NIPBL.

Résultats : La RT-ddPCR et le RNAseq ont montré une diminution des niveaux d'ARN de NIPBL pour toutes les cellules portant des variants tronquants, sauf pour le variant p.Arg45*, probablement à cause d’un site alternatif d’initiation de la traduction précédemment décrit entrainant un non déclenchement du Nonsense Mediated Decay (NMD). Pour toutes les conditions, y compris les variations faux-sens, une diminution d’environ 50% des niveaux de protéine de MAU2 a été observée, sans modification de l'ARNm de MAU2. L'analyse de l'expression différentielle a mis en évidence 60 gènes dérégulés dont 47 gènes sous-exprimés (FC >0.125, FDR<5%), parmi lesquels 8 gènes sont haploinsufisants (pLi>0.9) et associés à un phénotype dans OMIM Morbid dont les caractéristiques phénotypiques chevauchent celles du CdLS.

Conclusion : Nous proposons de nouveaux modèles d’iPSC édités pour le CdLS. Nos résultats confirment les données précédemment établies suggérant que les variations dans l'extrémité 5’ de la séquence codante de NIPBL échappent à la dégradation médiée par le non-sens. Nous suggérons l’intérêt d’étudier les niveaux de protéine MAU2 comme biomarqueurs potentiels du CdLS. Enfin, nous montrons que l’altération de NIPBL conduit à la diminution significative de l’expression de gènes dont plusieurs permettent de recomposer le phénotype du CdLS. Cette signature est en cours de comparaison avec des données de méthylomique.

L'épidermolyse bulleuse dystrophique récessive (EBDR) est une maladie cutanée rare à transmission autosomique récessive caractérisée par des bulles et des érosions récurrentes de la peau et des muqueuses après des traumatismes mineurs, entraînant des complications locales et systémiques majeures. Elle est dûe à des mutations du gène COL7A1 codant le collagène de type VII (C7), le principal composant des fibres d'ancrage qui forment des structures d'attache stabilisant la zone de la membrane basale cutanée. Les anomalies de structure et/ou d'expression de C7 conduisent à des fibres d'ancrage anormales, rares ou absentes, entraînant une perte d'adhérence dermo-épidermique et la formation de décollements cutanéo-muqueux. A ce jour, plus de 1200 mutations distinctes de COL7A1 ont été rapportés et 19% sont des variants délétères d'épissage. Dans cette étude, nous rapportons deux patients atteints d’EBDR présentant de nouvelles mutations introniques profondes pathogènes dans COL7A1. Le patient 1 est un homme de 45 ans atteint d’EBDR inversée, issu de parents sains non apparentés, pour lequel le séquençage de COL7A1 à partir de l'ADN génomique et de l'ADNc extrait de biopsies cutanées a révélé deux mutations récessives avec perte de fonction. Une mutation maternelle non-sens (c.6721C>T; p.Gln2241*) et une mutation paternelle intronique profonde (c.7795-97C>G), qui perturbe l'épissage du pré-ARNm COL7A1 et entraîne l'inclusion d'un pseudo-exon de 96 pb et un décalage de la phase de lecture avec l’apparition d’un codon stop prématuré (PTC). Il s’agit de la mutation intronique la plus profonde rapportée à ce jour dans COL7A1 et la première conduisant à l'inclusion d'un pseudo-exon dans l’EBDR. La patiente 2 est une femme de 32 ans atteinte d’EBDR prurigineuse, issue de parents sains consanguins, pour laquelle le NGS a révélé une mutation non-sens paternelle (c.8299G>T; p.Glu2767*),  et une mutation intronique profonde maternelle entraînant une rétention partielle ou complète de l'intron 51 (c.4899+31G>A). Les deux patients présentent une forte diminution de l’expression de C7 à la jonction dermo-épidermique et une diminution des fibres d’ancrage. La modulation de l'épissage à l'aide d'oligonucléotides antisens (ASO) ciblant les mutations introniques identifiées a permis de restaurer à plus de 94 % l'épissage normal de l'ARNm de COL7A1. Les analyses en western blot et en immunocytofluorescence ont démontré une forte ré-expression de l'expression de C7, jusqu'à 56 % du niveau normal d’expression  ex vivo, un niveau suffisant pour inverser le phénotype.  Ainsi, tout comme la maladie de Batten, l'ataxie-télangiectasie et la sclérose latérale amyotrophique pour lesquelles trois ASO spécifiques de mutations privées ont été approuvés par la FDA, la modulation d’épissage appliquée à des mutations introniques profondes de COL7A1 représente une stratégie thérapeutique prometteuse pour la médecine personnalisée de l’EBDR.

Les épidermolyses bulleuses dystrophiques (EBD) sont dues à des mutations du gène COL7A1 codant le collagène VII (C7). Elles sont transmises selon un mode autosomique récessif (EBDR) ou dominant (EBDD) selon la nature et la position de la mutation. Les patients souffrent dès la naissance de décollements bulleux cutanés et muqueux souvent étendus et sévères. Le collagène VII s’assemble en fibres d’ancrage qui forment des structures essentielles pour l’adhésion entre le derme et l’épiderme.  À ce jour, environ 1 200 variants de COL7A1 ont été rapportés (HGMD). Environ 43 % des mutations sont des mutations faux-sens, 19 % des mutations d'épissage, 22 % des petites insertions ou délétions et 10 % des mutations non-sens. Seules deux mutations régulatrices ont été identifiées dans le promoteur de COL7A1 chez deux patients atteints d’EBDR sévère. Nous décrivons six patients non apparentés atteints d'une forme d’EBDR légère ou modérée dont le second variant pathogène n'a pas pu être détecté dans les séquences codantes mais pour lesquels 4 variants différents ont pu être identifiés dans la région du promoteur de COL7A1 dont 3 étaient nouveaux. L’étude in silico de ces mutations prédit une altération de la fixation du facteur de transcription Sp1. Pour confirmer l’effet de ces variants sur la fixation du facteur de transcription Sp1, nous avons montré par test de DNA pull-down, une diminution de la fixation de Sp1 sur les séquences mutées. Sp1 est un facteur de transcription qui régule le niveau d'expression de nombreux gènes sans boîte TATA, comme COL7A1 qui contient de nombreux sites Sp1 potentiels à proximité du site d’initiation de la transcription. Nos résultats mettent donc en évidence deux nouveaux sites de fixation de Sp1 cruciaux qui sont des éléments régulateurs forts de COL7A1 dont l'intégrité est nécessaire pour l'expression basale de COL7A1. Les sites Sp1 du promoteur de COL7A1 jouant un rôle crucial dans l'expression du gène, il est essentiel, lorsque la seconde mutation n'a pu être identifiée dans les séquences codantes ou introniques chez un patient atteint d’EBDR, d'analyser les sites de liaison Sp1 de la région promotrice.

On estime que 50 % des variants pathogènes ou probablement pathogènes ont un effet sur le mécanisme d'épissage. Dans la base de données HGMD (variants pathogènes publiés), seuls 10% des variants ont un effet sur l’épissage (n=29207). Les raisons de cette différence résident très probablement dans notre capacité récente à identifier des variations introniques profondes par l’utilisation facilitée du génome complet et dans le manque de prédictions bioinformatiques fiables pour certaines catégories de variants. En effet, plusieurs éléments codés dans l’ADN sont responsables de la bonne reconnaissance par la machinerie d’épissage des limites exon-intron telles que le site d’épissage canonique incluant le site donneur (5’) et accepteur (3’). Les variations dans ces régions peuvent altérer considérablement le mécanisme d'épissage, provoquant par exemple un saut d'exon ou une intégration totale ou partielle d'intron. Ces régions ont été très bien caractérisées et leurs prédictions sont fiables. D'autres régions, plus difficiles à reconnaître comme le point de branchement ou les éléments de régulation d'épissage tels que les enhancer introniques/exoniques (ISE et ESE) ou les silencer (ISS et ESS), sont plus complexes à prédire. Plusieurs outils bioinformatiques ont été développés au fil du temps, allant d'outils plus anciens tels que MaxEntScan ou plus récents tels que SpliceAI à certains outils dédiés comme Branchpointer pour les points de branchement, et enfin des agrégateurs d’outils tels que SPiP. Plusieurs comparaisons d’outils ont déjà été rapportées sur des gènes en particulier mais rarement de manière compréhensive, ce que nous proposons dans cette étude.

Notre jeu de données d’évaluation est composé d’une part de variants pathogènes ou possiblement pathogènes extraits de HGMD (n=29 207) et ClinVar (n=17 251) et d’autre part de variants bénins ou possiblement bénins extraits de ClinVar (n=176 959) et gnomAD v2 (28 538 des génomes et 121 504 des exomes, avec une fréquence allélique > 3%). Au total, 638 219 variants non redondants sont considérés dont 41 341 pathogènes et 596 878 comme bénins. L'examen de la distribution des variants pathogène sur le gène révèle que la majorité d'entre eux sont situés sur les sites d'épissage consensus (n=38 710, 94,1 %).

L'ensemble de données a été utilisé pour évaluer 7 programmes dont MaxEntScan, MMSplice, NNSplice, SPiP, SpliceAI (2 paramétrages), SQUIRLS, SSF-like. D’autres algorithmes ou score sont encore en cours de traitement (par exemple CADD). Les résultats de cette étude sont exprimés sous la forme de courbes ROC et l'analyse de l’aire sous la courbe (AUC) révèlent des performances proches pour les sites consensus et des différences notables avec 3 outils plus performants pour les autres types de variants (SpliceAI, SQUIRLS et SPiP). Les résultats détaillés seront présentés permettant de définir un pipeline bioinformatique efficace pour l’évaluation des variations affectant l’épissage.

L’avènement du séquençage de génome lors des plans nationaux ont permis la mise en évidence de nombreux variant intronique ayant un effet potentiel sur l’épissage. Par ailleurs, certaines études suggèrent que jusqu’à 20% des variants affectant les régions codantes pourraient avoir un effet sur l’épissage. Les scores de prédictions développés ces dernières années sont insuffisamment efficace, en particulier pour l’analyse des variants introniques profonds. Dans un papier récent, nous avons montré dans une cohorte de patients avec un syndrome d’Alport lié à l’X, que seuls 60% des variants introniques profonds identifiés chez les patients, et dont l’effet sur l’épissage avait été prouvé, étaient décrit comme altérant probablement l’épissage par les scores de prédictions.  Ces éléments prouvent que l’obtention d’une preuve fonctionnelle est indispensable avant de conclure à la pathogénicité d’un variant impliquant l’épissage. Dans ce contexte, nous avons développé une approche de séquençage d’ARN basée sur la capture d’ADN complémentaire issu de tissus d’intérêt des patients. Cette approche pouvant être réalisée avant ou en parallèle des études génomique permet la mise en évidence de nombreux évènements d’épissage. L’objectif de ce travail était de développer une interface bio-informatique permettant la caractérisation, le tri et la présentation des évènements d’épissage identifiés chez un patient.

 A partir des données issues du séquençage du cDNA de patients après capture par les différents panels utilisés dans le service de génétique moléculaire, nous avons aligné (Hisat2), puis annoté chaque évènement d’épissage (Sambamba) pour isoler les évènements non canoniques. Ces derniers ont ensuite été triés selon leur effet sur l’épissage (saut d’exon / rétention d’intron), et la probabilité de leur pathogénicité basée sur différents critères : (1) qualité de l’évènement, (2) profondeur de séquençage, (3) caractère déjà vu de cet évènement dans notre base de données et (4) le « bruit de fond » au niveau des jonctions proches. Les évènements dans les gènes incriminés sont ainsi classés et présentés à l’utilisateur associé à un visuel direct du sashimi plot correspondant à l’évènement. L’accès de l’utilisateur à ces évènements triés, et au paramétrage de ces différents filtres a été proposé dans le cadre d’une nouvelle interface appelée PolySplice.

L’utilisation de cette interface permet ainsi l’identification des évènements d’épissage issus du séquençage d’ARN des patients, et confirmer la pathogénicité des variants identifiés en comparant ces évènements à une base de données interne alimentée continuellement. A l’avenir, il est prévu que cet outil soit relié au pipeline d’identification des variants génomiques (Polyviewer) afin d’intégrer les données issues des analyses génomiques et transcriptomiques.

L'identification précise des anomalies d'épissage génétique est un enjeu essentiel en génétique constitutionnelle puisqu’environ 15 à 30 % des variants délétères responsables de maladies héréditaires entraînent des modifications dans l'épissage des gènes. Bien que des solutions de séquençage d'ARN existent depuis des années pour quantifier l'expression génique et détecter des gènes de fusion dans les tumeurs, l'utilisation du RNAseq pour l'analyse de l'épissage reste limitée dans le diagnostic moléculaire de routine.

Le RNASeq développé dans notre laboratoire a deux objectifs principaux : offrir une analyse complémentaire aux patients pour lesquels le diagnostic reste suspect malgré des tests constitutionnels négatifs, et aider à interpréter les variants de classe 3 en recherchant leurs conséquences fonctionnelles sur l'épissage. Notre panel de 160 gènes d'intérêt en oncologie, médecine interne et neurologie est analysé avec l’ARN extrait à partir de de tubes Paxgene. Le séquençage de 16 échantillons est fait avec un séquenceur Illumina NextSeq 500.

La détection et la quantification des épissages alternatifs, tels que les sauts d'exon, les troncatures ou les élongations d'exon, ainsi que la rétention d'introns ou la création de néo-exons, présentent un défi. Actuellement, il existe peu d'outils performants répondant à ces besoins. Pour pallier ce manque, l'équipe de bioinformatique des Hospices Civils de Lyon a développé le pipeline SAMI, qui peut détecter, annoter et quantifier des jonctions d'épissage physiologiques et aberrantes à partir de données de séquençage RNAseq.

Ce pipeline, basé sur Nextflow et tirant partie des UMI pour éliminer les duplicats de PCR, classe chaque jonction détectée en quatre catégories : Annotated (jonction physiologique), Plausible (jonction anormale entre deux sites d’épissage connus : saut d’exon), Anchored (jonction avec un site d’épissage connu : rétention ou élongation d’exon) et Unknown (jonction sans site d’épissage connu : néo-exon). L'analyse des données est comparative entre les échantillons d’un même run, en utilisant des critères tels que la profondeur de séquençage (Reads > 5), le nombre de récurrences ( < ou = 2) et un index PSI (Percent Spliced In > 1%) pour sélectionner les jonctions d'intérêt. Les anomalies d'épissage sont visualisées via des Sashimi plots générés par SAMI et IGV.

Les résultats obtenus avec SAMI sont prometteurs, détectant les anomalies d'épissage attendues et en y ajoutant parfois des anomalies complémentaires. Malgré des difficultés persistantes dans la détection des néo-exons introniques profonds, le pipeline montre une bonne reproductibilité et répétabilité pour les gènes suffisamment exprimés dans le sang.

Nous envisageons une mise en production du RNAseq au laboratoire comme analyse de seconde intention et nous n’écartons pas d’utiliser en parallèle d’autres pipelines (Splice-Laucher par exemple de nos collègues de Caen) pour une analyse complémentaire.

Bien que ces 15 dernières années aient vu le séquençage d’ARN à haut débit remplacer progressivement les puces transcriptomiques, l’informativité supplémentaire de cette technique concernant l’épissage reste à exploiter en clinique. De nombreux outils ont été développés pour quantifier des isoformes connues a priori (RSEM, kallisto) ou comparer des groupes d’échantillons (rMATS, MAJIQ), mais peu de solutions sont adaptées au contexte clinique le plus fréquent : retrouver des événements d’épissage uniques dans des échantillons isolés.

C’est dans cette optique que nous avons développé SAMI (Splicing Analysis with Molecular Indexes), un pipeline Nextflow capable d’identifier et représenter graphiquement de tels événements en prenant en charge l’analyse complète d’un séquençage d’ARN à haut débit (contrôles qualités, déduplication basée sur les UMI, alignement, quantification de l’expression, détection des événements d’épissage aberrants et fusions de gènes). L’utilisation des technologies Nextflow (pipeline) et Singularity (conteneurisation) en font un outil simple à diffuser et déployer, aussi bien en local que dans le cloud.

Appliqué à un contrôle commercial séquencé sur un premier panel de 17.6 kb dédié au cancer de poumon, SAMI a été en mesure de détecter 13/13 sauts de l’exon 14 de MET et 12/13 sauts d’exons 2-7 correspondant au variant EGFRvIII. Bien qu’initialement développé pour l’épissage, SAMI a également démontré un potentiel pour l’identification de gènes de fusions, en retrouvant les 15 événements de fusions attendus dans l’échantillon contrôle avec une sensibilité au moins équivalente à Arriba et STAR-Fusion, des outils de référence en la matière.

Dans un second panel de 2.44 Mb dédié aux cancers hématologiques, l’application de SAMI a un plan d’expérience plus proche de la recherche (comparaison de patients atteints de syndromes myélodysplasiques avec et sans mutations de SRSF2) a également donné des résultats très satisfaisants, en retrouvant l’exon « poison » d’EZH2 décrit précédemment dans ce contexte.

L’application de SAMI et d’un outil équivalent (SpliceLauncher) à un troisième panel de 1.12 Mb fait l’objet d’une seconde soumission indépendante. Bien qu’applicable en l’état au séquençage de transcriptomes complets, ce dernier cas de figure fait encore l’objet de développements et d’optimisations à l’heure actuelle.

Le séquençage d’ARN (RNAseq) est un outil indispensable pour l’évaluation fonctionnelle post-génomique de certains variants (intronique ou non) affectant l’épissage. Son utilisation est parfois rendue difficile en cas de gène dont l’expression est limitée à un tissu spécifique et peu accessible comme c’est le cas du tissu rénal. Par ailleurs, l’étude des transcrits nécessite une profondeur de couverture importante, parfois difficile à atteindre.

Dans cette étude, nous appliquons une technologie de RNAseq ciblé par capture d’un panel de 228 gènes impliqués dans les maladies rénales monogéniques, à différents tissus (rein, sang, fibroblastes et urines) issus de patients présentant un variant affectant l’épissage identifié préalablement. Nous comparons ainsi les profils d’expression des différents gènes capturés dans chaque tissu et interprétons le retentissement de chaque variant identifié sur l’épissage de l’ARN considéré.

Nous avons pu étudier plusieurs échantillons pour chaque tissu. En moyenne, 11 176 reads s’alignaient sur les jonctions exons-exons identifiées (soit environ 354 reads/jonction) assurant une profondeur de lecture moyenne suffisante à l’interprétation des évènements d’épissage. L’analyse en cluster des différents prélèvements a permis de retrouver une homogénéité des tissus ce qui témoigne de la reproductibilité des résultats (Figure 1). A titre d’exemple, l’étude de l’ARN issu des urines totales de trois patients a permis l’analyse de l’épissage de 222/228 gènes capturés. Dans tous les cas, l’étude spécifique des transcrits d’intérêts ont permis de valider la conséquence du variant sur l’épissage pour les gènes PKHD1, NPHS2 et PODXL (tissu rénal), COL4A4 et COL4A5 (urines totales), COQ2 et NUP93 (fibroblastes), BBS9 et COQ8B (sang). L’ensemble de ces données ont été analysées grâce à une interface spécialement conçue pour cette analyse, permettant de hiérarchiser les évènements identifiés : PolyRNAseq.

Dans ce travail, nous montrons que l’étude de l’ARN total issu de différents tissus permet l’interprétation fonctionnelle des variants ayant un effet sur l’épissage. Nous montrons que dans le domaine de la néphrogénétique, l’ARN total issu des urines permet l’interprétation des évènements dans la presque totalité des 228 gènes étudiés.

Les analyses de routine par panel de gènes permettent désormais d’identifier les variants pathogènes dans les gènes cliniquement pertinents en oncogénétique. Cependant, de nombreux variants de signification incertaine (VSI) sont également mis en évidence, dont une grande partie pourrait avoir un impact sur la transcription et l’épissage des ARNm. Plusieurs logiciels tentent de prédire l'impact des variants sur l'épissage et permettent ainsi de sélectionner les variants pour lesquels il est important d'étudier l'effet sur les transcrits. L’analyse des ARNm permet également de préciser le caractère en tandem des grandes duplications et peut être utile pour la recherche de variants introniques profonds difficiles à identifier en panel ADN.

Notre étude présente ainsi l’analyse de 53 VSI par capture et séquençage ciblé d’un panel de 38 gènes, sur des ARN totaux extraits d’échantillons sanguins de patients. Des RT-PCR, du séquençage Sanger des ARNm des patients ou des analyses monoalléliques de mini-gènes ont également été réalisés en complément lorsque cela était nécessaire.

Sur les 57 VSI analysés par panel ARN, 23 variants (40%) ont montré une modification partielle ou totale des transcrits (effet sur l’épissage ou duplication d’exon en tandem). Treize variants (23%) ont pu être classés comme pathogènes ou probablement pathogènes. Sur les 34 VSI sans impact observé sur l’épissage, 21 (62%) ont pu être classés probablement neutres. Les données obtenues pour 4 variants seront présentées de manière exhaustive : PTEN c.206+6T > G, MLH1 c.791-489_791-20del, BRCA2 c.68-8_68-7delinsAA et MSH2 c.(1076+1_1077-1)_( 1276+1_1277 -1)dup.

Ces 4 exemples illustrent l’utilité du séquençage de panels ARN réalisés sur prélèvements sanguins pour aider à classer les VSI avec un effet sur l’épissage prédit. Cette technique peut également être utile pour caractériser les grandes duplications et pour rechercher l’impact de variants introniques profonds sur les transcrits exprimés.

Le séquençage à haut débit de l’ARN  (RNA-seq) constitue une approche de validation fonctionnelle complémentaire à celle du séquençage de l’ADN. Il permet la mise en évidence de jonctions aberrantes suite à un épissage alternatif ou à la présence de gènes de fusion, la détection de variants mais aussi l’expression différentielle des gènes. Plusieurs études ont montré l’intérêt majeur de cette technique qui améliore le rendement diagnostique et permet de reclassifier des variations de signification incertaine représentant un challenge pour les laboratoires de génétique en l’absence de données d’études fonctionnelles.

Nous avons mis en place dans notre laboratoire de neurogénétique moléculaire une double approche qualitative du séquençage de l’ARN messager ciblé et total dans un contexte de caractérisation de variants de signification incertaine ayant un impact prédit sur l’épissage et mis en évidence préalablement en DNA-seq panel, exome et aussi en Génome (plateformes nationales SeqOIA et AURAGEN). Les ARNs sont extraits à partir de cellules lymphocytaires (Tube Paxgene) ou de fibroblastes (Biopsie de peau), et plus rarement à partir de tissu fœtal (Muscle, Poumon) selon l’expression du gène d’intérêt. Nous procédons par la suite à la sélection des ARNm par la capture de la queue polyA puis déplétion ou non en globine et en ARN ribosomal selon l’analyse souhaitée et le type d’échantillon utilisé. Pour l’analyse mRNA ciblée, nous capturons par la suite 250 gènes impliqués dans nos pathologies d’intérêt (maladies congénitales ou très précoces du cervelet et du tronc cérébral, et mouvements anormaux à début pédiatrique). Le traitement bioinformatique des données a été initialement assuré par Génosplice lors de la mise en place de la technique, puis nous avons effectué une transition vers une utilisation en routine diagnostique sur la plateforme MOABI(APHP), Ces deux pipelines intègrent l’outil d’alignement STAR pour l’analyse qualitative des jonctions aberrantes. L’interprétation des résultats est réalisée d’une part à partir d’un fichier de comptage de jonctions présentes au niveau de l’échantillon et le calcul du ratio des jonctions d’inclusion et d’exclusion et d’autre part par la visualisation des BAMs jonctions en Sashimi Plot sur IGV. 82% des gènes panel sont analysables à partir d’ARN extrait sur Tube Paxgene contre 63 % des gènes mRNA total.

Cette approche nous a permis de reclasser à ce jour 57% des variants testés de signification incertaine en probablement pathogène ou pathogène selon la classification ACMG et confirme l’intérêt de l’implémentation de cette technique en routine dans un laboratoire de diagnostic. Plusieurs exemples de RNAseq ciblé et total seront présentés ainsi qu’un comparatif des différents processus techniques utilisés.

CONTEXTE : Les variants mono-nucléotidiques, ou « single-nucleotide variants » (SNVs), au sein des séquences codantes des gènes peuvent influencer profondément l'épissage du pré-ARNm, avec d'importantes implications en termes de diagnostic et de traitement personnalisé. L'analyse de l’effet des SNVs sur l'épissage à partir d’échantillons biologiques se heurte souvent à des contraintes pratiques. Bien que les outils in silico fournissent des prédictions de plus en plus fiables, ils ne répondent pas à eux seuls aux normes de classification clinique. Nous avons précédemment mis au point un test d'épissage in vitro dans un modèle de gène complet (FLGSA, « full-length gene splicing assay »), permettant une caractérisation fine des effets de variants codants et introniques du gène SPINK1, un gène associé à la pancréatite chronique. Cette nouvelle étude vise à exploiter les avantages du test FLGSA, en conjonction avec les capacités prédictives de SpliceAI, pour interpréter de manière prospective l'impact de tous les SNVs codants potentiels dans le gène SPINK1 sur l'épissage.

RÉSULTATS : Une corrélation rétrospective comparant les données du FLGSA avec les prédictions de SpliceAI pour un total de 62 SNVs codants (n = 27) et introniques (n = 35) connus de SPINK1 a d’abord été réalisée. Sur la base des résultats de cette corrélation croisée, 35 SNVs potentiels (score SpliceAI : 0,00 – 0,93) sur 16 positions nucléotidiques codantes ont été sélectionnés pour une analyse fonctionnelle par l’approche FLGSA. En fin de compte, nous avons obtenu des données FLGSA pour 62 SNV codants. Ces 62 SNVs représentent 8,6 % des 720 SNVs potentiels dans la séquence codante de SPINK1 (80 codons ; 3 positions/codon ; 3 variants/position), pour un total de 42 positions nucléotidiques (soit 17,5% des 240 nucléotides de l’ORF). Les tests fonctionnels ont révélé un effet délétère pour 12 SNVs, dont 9 qui conduisaient à la production du transcrit de type sauvage et de transcrits aberrants, et trois qui conduisaient uniquement à la production de transcrits aberrants. Ces 12 SNVs étaient tous localisés dans les exons 1 et 2. Nous avons réalisé une nouvelle corrélation croisée des données FLGSA et SpliceAI dans le contexte des 62 variants codants (12 variants ayant un effet délétère, et 50 variants neutres), suggérant qu’aucun des variants potentiels non-sélectionnés, donc non-testés par FLGSA, n’aura d’impact fonctionnel significatif. Cela conduit à l’estimation d’un effet sur l’épissage du pré-messager du gène SPINK1 de seulement 12 des 720 variants codants possibles, soit 1,67%.

CONCLUSIONS : En comparant les prédictions obtenues par SpliceAI et les données du test in vitro FLGSA, nous concluons que moins de 2 % (1,67 % dans cette étude) de tous les SNVs codants possibles de SPINK1 auraient un effet significatif sur l'épissage.

Le diagnostic moléculaire à haut débit est essentiel dans la prise en charge des patients en oncogénétique. La découverte d’un variant pathogène permet d’identifier les individus à risque, d’adapter la surveillance, de guider les interventions chirurgicales préventives voire thérapeutiques. Cependant, le rendement diagnostique de ces analyses n’est pas satisfaisant, seulement 10% pour la prédisposition au cancer du sein et/ou de l’ovaire et 25% pour la prédisposition aux cancers digestifs. Afin d’améliorer l’identification de ces variants il est impératif de perfectionner l’interprétation des variations de signification incertaine (VSI) largement identifiées dans nos laboratoires. Une meilleure exploration des variants d’épissage, sous explorés par manque de moyen, permettrait ainsi de reclasser un grand nombre de ces variants. Ainsi, pour élucider une partie de cette hérédité manquante, nous proposons de réaliser une étude de l’ARN, en panel à haut débit, de manière concomitante et systématique à l’analyse génomique. Ceci est rendu possible par une technique développée au sein de l’unité Inserm U1245 : SEALigHTS pour Splice and Expression Analysis by Exon Ligation and High Throughput Sequencing (Levacher et al., 2023). Cette technique permet l’exploration simultanée de toutes les jonctions exon-exon d’un panel de 44 gènes et peut être réalisée pour 64 patients en 2 jours et demi pour 30 euros par patient. En pratique, après rétrotranscription, des sondes dessinées à chaque extrémité d’exon vont s’hybrider puis se liguer si elles sont accolées, pour enfin être amplifiées et séquencées par NGS. Cette technique a été validée par l’analyse de 30 variations d’épissage documentées au titre du diagnostic. Nous avons également exploré en SEALigHTS 37 patients très évocateurs d’une prédisposition au cancer sans variation pathogène identifiée jusqu’alors, permettant de réaliser 6 nouveaux diagnostics par l’identification d’une anomalie de l’épissage puis de son altération génomique en regard. Fort de ces résultats encourageants nous avons initié le projet STRATEGIC (STRucturation de l’Analyse des Transcrits dEs Gènes Impliqués dans les Cancers héréditaires en Normandie et Nord-Pas de Calais) financé par le Cancéropôle Nord-Ouest et porté par le CHU de Rouen en collaboration avec le centre François Baclesse à Caen et le CHU de Lille dans le cadre de la FHU G4 génomique. Ce projet a pour objectif d’inclure 1000 patients vus en consultation de génétique pour prédisposition héréditaire au cancer du sein et/ou de l’ovaire ou aux cancers digestifs chez qui nous réaliserons l’analyse concomitante de l’ADN et de l’ARN par SEALigHTS. La puissance d’une interprétation conjointe se révèle être un avantage majeur pour les patient.es en diminuant l’errance diagnostique et l’incertitude liée aux VSI. L’accumulation des données d’épissage au cours de ce projet pourra également se révéler précieuse pour améliorer nos connaissances des corrélations génotype-phénotype.

Le diagnostic génétique des patients présentant une suspicion clinique d'albinisme est essentiel pour adapter les soins aux patients en fonction du type (syndromique, oculaire ou oculocutané) et offrir un conseil génétique aux familles. A ce jour, environ 30% des patients restent génétiquement non résolus avec une proportion importante d'entre eux (60%) présentant au moins un variant de signification inconnue (VSI) dans l'un des 20 gènes connus d’albinisme.

Nous nous sommes intéressés aux patients suspectés d’albinisme oculocutané de type 2 (OCA2) présentant au moins un VSI rare dans le gène OCA2. Dans cette étude, nous avons sélectionné les VSI dans et autour de l’exon 10. Cet exon est connu pour être sensible au saut lors de l’épissage conduisant, chez les sujets contrôles sains, à une fraction minoritaire de transcrits non fonctionnels délétés de l’exon 10. Par une approche fonctionnelle, nous avons cherché à savoir si les VSI dans ou autour de l’exon 10 pouvaient significativement augmenter le saut de cet exon et résulter en un défaut de production de protéine fonctionnelle suffisant pour entraîner la pathogénicité.

En combinant plusieurs approches (essai par minigène, caractérisation de transcrits issus de biopsies de peau), nous avons montré que 3 variants introniques ainsi que deux variants synonymes augmentent significativement le saut de l’exon 10 nous permettant de les classer pathogènes (Michaud et al. 2023). Nous complétons cette étude en mesurant l’effet de ces variants rares en fonction de la présence de variants bénins de la région. En particulier, l’influence du SNP c.1065G > A;p.(Ala 355=), majoritaire dans les populations européennes à peau claire, est en cours d’évaluation. Chez la souris, l’exon 10 d’Oca2 n’est pas sensible au saut. Ce constat nous permet de sélectionner les quelques nucléotides non homologues entre les deux espèces, pour tester par minigène leur capacité à contrôler l’épissage dans la perspective d’identifier les séquences critiques et donc d’améliorer les outils de prédiction.

De façon intéressante, nous montrons que les erreurs d'épissage ainsi que d'autres anomalies touchant les transcrits d’OCA2 peuvent être détectées directement à partir d'échantillons de cellules sanguines, ce qui permet d’éviter le recours à des biopsies invasives de peau. Nous recommandons donc le prélèvement systématique d'un échantillon d'ARN sanguin chez les patients suspectés d’OCA2 dont le diagnostic génétique n'est pas concluant (ex : un seul variant pathogène dans OCA2 ; 1 VSI ; 2 VSI en trans).

Michaud V, Sequeira A, Mercier E, Lasseaux E, Plaisant C, Hadj-Rabia S, Whalen S, Bonneau D, Dieux-Coeslier A, Morice-Picard F, Coursimault J, Arveiler B, Javerzat S. Unsuspected consequences of synonymous and missense variants in OCA2 can be detected in blood cell RNA samples of patients with albinism. Pigment Cell Melanoma Res. 2023 Aug 31. doi: 10.1111/pcmr.13123. Epub ahead of print. PMID: 37650133.

La voie de l'hypoxie est un mécanisme moléculaire essentiel qui permet l’adaptation au taux d’oxygène et repose sur la régulation du facteur inductible par l’hypoxie HIF alpha. En normoxie, le gène VHL contribue à la dégradation de ce facteur, inhibant ainsi l’expression de ces gènes cibles associés notamment à la survie, la prolifération et l'angiogenèse.

Les mutations germinales du gène VHL sont associées au développement de deux phénotypes distincts. Des mutations hétérozygotes entraînent le développement de tumeurs hypervascularisées : hémangioblastomes, carcinomes rénaux à cellules claires et phéochromocytomes (maladie de von Hippel-Lindau). Des mutations homozygotes sont associées à la surexpression d’érythropoïétine (EPO) qui entraîne une surproduction de globules rouges (polyglobulie). Dans le but d’améliorer le suivi et le diagnostic des patients, les mécanismes moléculaires complexes sous-jacents à ces deux phénotypes sont explorés par le laboratoire. Notre travail porte sur l’hypothèse d’un modèle d’oncogenèse en gradient qui suggère une corrélation directe entre l’importance des conséquences fonctionnelles des mutations et la gravité des symptômes cliniques observés.

Le gène VHL, constitué de trois exons, code deux transcrits majeurs. Le premier transcrit contient les trois exons et code une protéine activement impliquée dans la dégradation de HIF, tandis que le second, résultant d’un saut d'épissage de l'exon 2, code une protéine qui a perdu la propriété de réguler HIF.

Treize mutations localisées dans l'exon 2 de VHL identifiées chez des patients avec polyglobulie (n=5) ou atteints de la maladie de VHL (n=8) ont été étudiées à l'aide d'un test "minigène" rapporteur d’épissage dans différentes lignées cellulaires. Il a pu être mis en évidence que la dérégulation de l'épissage (saut de l'exon 2) causée par les mutations associées au développement de tumeurs est plus importante que l'impact des mutations associées aux polyglobulies. Cette observation est un argument en faveur de l’hypothèse d’oncogenèse en gradient.

Afin d'élucider les mécanismes moléculaires responsables du saut de l’exon 2 en présence de mutations spécifiques de VHL, les protéines de liaison à l'ARN (RNA-Binding Proteins - RBP) impliquées dans la régulation de cet épissage différentiel ont été recherchées. Les RBP liées aux sondes ARN de la séquence de l’exon 2 de VHL sauvage ou muté ont été précipitées par la technique de RNA-Protein Pull-Down puis identifiés par spectrométrie de masse. Cette étude s’est concentrée sur les mutations : c.413C>T (P138L), c.413C>G (P138R) et c.414A>G (P138P), respectivement associées aux phénotypes de polyglobulie, carcinome rénal à cellules claires sporadique et maladie de VHL.

L'identification d'acteurs protéiques spécifiques de la régulation de l'épissage de VHL pourrait constituer de nouvelles pistes de ciblage thérapeutique visant à inverser le ratio d'expression des deux transcrits VHL en faveur du transcrit correctement épissée.

Introduction : Le complexe cohésine joue un rôle critique dans la structure chromatinienne et la régulation de l'expression des gènes. Le syndrome de Cornelia de Lange (CdLS) est une transcriptomopathie liée à des altérations de ce complexe. NIPBL, le principal gène du CdLS, code le facteur de chargement de la cohésine, en lien avec son partenaire MAU2. Les conséquences de l'expression génique des variations pathogènes, nucléotidiques ou structurales, de NIPBL permettront une meilleure compréhension du syndrome et pourraient être utilisées comme des biomarqueurs potentiels.

Méthodes : Par CRISPR/Cas9, nous avons introduit, dans une lignée iPSC, les variations pathogènes de NIPBL suivantes, à l'état hétérozygote ou homozygote : p.Arg45*, p.Arg834*, p.Ser1466Lysfs*13, p.Asp2157Gly et p.Arg2298Cys, ainsi que des indels entrainant un décalage de cadre dans les exons correspondants. Nous avons évalué les niveaux d'ARNm de NIPBL et de MAU2 par RT-ddPCR et RNAseq et mesuré les niveaux protéiques de NIPBL et de MAU2 par western-blot. Nous avons ensuite utilisé les données de RNAseq pour établir une signature transcriptomique des altérations de NIPBL.

Résultats : La RT-ddPCR et le RNAseq ont montré une diminution des niveaux d'ARN de NIPBL pour toutes les cellules portant des variants tronquants, sauf pour le variant p.Arg45*, probablement à cause d’un site alternatif d’initiation de la traduction précédemment décrit entrainant un non déclenchement du Nonsense Mediated Decay (NMD). Pour toutes les conditions, y compris les variations faux-sens, une diminution d’environ 50% des niveaux de protéine de MAU2 a été observée, sans modification de l'ARNm de MAU2. L'analyse de l'expression différentielle a mis en évidence 60 gènes dérégulés dont 47 gènes sous-exprimés (FC >0.125, FDR<5%), parmi lesquels 8 gènes sont haploinsufisants (pLi>0.9) et associés à un phénotype dans OMIM Morbid dont les caractéristiques phénotypiques chevauchent celles du CdLS.

Conclusion : Nous proposons de nouveaux modèles d’iPSC édités pour le CdLS. Nos résultats confirment les données précédemment établies suggérant que les variations dans l'extrémité 5’ de la séquence codante de NIPBL échappent à la dégradation médiée par le non-sens. Nous suggérons l’intérêt d’étudier les niveaux de protéine MAU2 comme biomarqueurs potentiels du CdLS. Enfin, nous montrons que l’altération de NIPBL conduit à la diminution significative de l’expression de gènes dont plusieurs permettent de recomposer le phénotype du CdLS. Cette signature est en cours de comparaison avec des données de méthylomique.

L'épidermolyse bulleuse dystrophique récessive (EBDR) est une maladie cutanée rare à transmission autosomique récessive caractérisée par des bulles et des érosions récurrentes de la peau et des muqueuses après des traumatismes mineurs, entraînant des complications locales et systémiques majeures. Elle est dûe à des mutations du gène COL7A1 codant le collagène de type VII (C7), le principal composant des fibres d'ancrage qui forment des structures d'attache stabilisant la zone de la membrane basale cutanée. Les anomalies de structure et/ou d'expression de C7 conduisent à des fibres d'ancrage anormales, rares ou absentes, entraînant une perte d'adhérence dermo-épidermique et la formation de décollements cutanéo-muqueux. A ce jour, plus de 1200 mutations distinctes de COL7A1 ont été rapportés et 19% sont des variants délétères d'épissage. Dans cette étude, nous rapportons deux patients atteints d’EBDR présentant de nouvelles mutations introniques profondes pathogènes dans COL7A1. Le patient 1 est un homme de 45 ans atteint d’EBDR inversée, issu de parents sains non apparentés, pour lequel le séquençage de COL7A1 à partir de l'ADN génomique et de l'ADNc extrait de biopsies cutanées a révélé deux mutations récessives avec perte de fonction. Une mutation maternelle non-sens (c.6721C>T; p.Gln2241*) et une mutation paternelle intronique profonde (c.7795-97C>G), qui perturbe l'épissage du pré-ARNm COL7A1 et entraîne l'inclusion d'un pseudo-exon de 96 pb et un décalage de la phase de lecture avec l’apparition d’un codon stop prématuré (PTC). Il s’agit de la mutation intronique la plus profonde rapportée à ce jour dans COL7A1 et la première conduisant à l'inclusion d'un pseudo-exon dans l’EBDR. La patiente 2 est une femme de 32 ans atteinte d’EBDR prurigineuse, issue de parents sains consanguins, pour laquelle le NGS a révélé une mutation non-sens paternelle (c.8299G>T; p.Glu2767*),  et une mutation intronique profonde maternelle entraînant une rétention partielle ou complète de l'intron 51 (c.4899+31G>A). Les deux patients présentent une forte diminution de l’expression de C7 à la jonction dermo-épidermique et une diminution des fibres d’ancrage. La modulation de l'épissage à l'aide d'oligonucléotides antisens (ASO) ciblant les mutations introniques identifiées a permis de restaurer à plus de 94 % l'épissage normal de l'ARNm de COL7A1. Les analyses en western blot et en immunocytofluorescence ont démontré une forte ré-expression de l'expression de C7, jusqu'à 56 % du niveau normal d’expression  ex vivo, un niveau suffisant pour inverser le phénotype.  Ainsi, tout comme la maladie de Batten, l'ataxie-télangiectasie et la sclérose latérale amyotrophique pour lesquelles trois ASO spécifiques de mutations privées ont été approuvés par la FDA, la modulation d’épissage appliquée à des mutations introniques profondes de COL7A1 représente une stratégie thérapeutique prometteuse pour la médecine personnalisée de l’EBDR.

Les épidermolyses bulleuses dystrophiques (EBD) sont dues à des mutations du gène COL7A1 codant le collagène VII (C7). Elles sont transmises selon un mode autosomique récessif (EBDR) ou dominant (EBDD) selon la nature et la position de la mutation. Les patients souffrent dès la naissance de décollements bulleux cutanés et muqueux souvent étendus et sévères. Le collagène VII s’assemble en fibres d’ancrage qui forment des structures essentielles pour l’adhésion entre le derme et l’épiderme.  À ce jour, environ 1 200 variants de COL7A1 ont été rapportés (HGMD). Environ 43 % des mutations sont des mutations faux-sens, 19 % des mutations d'épissage, 22 % des petites insertions ou délétions et 10 % des mutations non-sens. Seules deux mutations régulatrices ont été identifiées dans le promoteur de COL7A1 chez deux patients atteints d’EBDR sévère. Nous décrivons six patients non apparentés atteints d'une forme d’EBDR légère ou modérée dont le second variant pathogène n'a pas pu être détecté dans les séquences codantes mais pour lesquels 4 variants différents ont pu être identifiés dans la région du promoteur de COL7A1 dont 3 étaient nouveaux. L’étude in silico de ces mutations prédit une altération de la fixation du facteur de transcription Sp1. Pour confirmer l’effet de ces variants sur la fixation du facteur de transcription Sp1, nous avons montré par test de DNA pull-down, une diminution de la fixation de Sp1 sur les séquences mutées. Sp1 est un facteur de transcription qui régule le niveau d'expression de nombreux gènes sans boîte TATA, comme COL7A1 qui contient de nombreux sites Sp1 potentiels à proximité du site d’initiation de la transcription. Nos résultats mettent donc en évidence deux nouveaux sites de fixation de Sp1 cruciaux qui sont des éléments régulateurs forts de COL7A1 dont l'intégrité est nécessaire pour l'expression basale de COL7A1. Les sites Sp1 du promoteur de COL7A1 jouant un rôle crucial dans l'expression du gène, il est essentiel, lorsque la seconde mutation n'a pu être identifiée dans les séquences codantes ou introniques chez un patient atteint d’EBDR, d'analyser les sites de liaison Sp1 de la région promotrice.