Le syndrome de Li-Fraumeni (LFS) résulte d’une altération délétère constitutionnelle du gène TP53 et prédispose à un large spectre tumoral. Le gène TP53 est régulé par plusieurs promoteurs et est soumis à un épissage alternatif complexe à l’origine d’isoformes capables de se réguler entre elles, mais le diagnostic moléculaire repose à ce jour uniquement sur l’interprétation des conséquences des variants sur la forme canonique de p53 (FLp53alpha). Nous souhaitons tester l’hypothèse d’un impact des variations de TP53 sur le taux des différentes isoformes et qu’un déséquilibre de ces isoformes pourrait moduler l’activité de p53 et expliquer une partie de la variabilité phénotypique.

Nous avons mis au point une RT-ddPCR (Droplet Digital RT-PCR) pour évaluer l’expression de l’ensemble des transcrits de TP53 comparée à l’expression d’un gène contrôle, ainsi que 2 longues RT-ddPCR permettant d’analyser en parallèle l’expression de 6 transcrits. À l’aide de cette approche, nous avons analysé l’expression des isoformes de TP53 dans plusieurs lignées lymphoblastoïdes de patients avec variation hétérozygote de TP53. Nous avons pu détecter les isoformes longues (FL) et courtes (DeltaN) en version alpha, beta et gamma, bien que les isoformes alternatives soient très peu représentées dans ce tissu.

Nous avons testé l’impact d’une délétion complète de TP53 et d’une délétion emportant le promoteur P1 et l’exon 1. Ces 2 délétions entraînent une diminution d’expression de TP53 de 50 %, en comparaison au génotype wt.

La délétion P1-ex1 entraîne une diminution de moitié des formes longues et des formes courtes. Ce résultat est similaire à celui observé avec la délétion totale. Le manque de sensibilité ne nous permet néanmoins pas de conclure à l’absence d’utilisation du promoteur P2 en cas de délétion du promoteur P1.

Nous avons ensuite évalué l’impact d’une variation d’épissage c.375G > A, détruisant le site donneur d’épissage, à l’origine d’une délétion de 200 nucléotides sur l’ARNm par utilisation d’un site cryptique dans l’exon 4. Cette variation entraîne également une diminution d’expression de TP53 de 50 % mettant en évidence une dégradation par le système NMD. De façon intéressante, cette variation est localisée dans le promoteur P2 au niveau d’un élément de réponse à p53 et pourrait donc potentiellement affecter la production des isoformes courtes DeltaN. À l’aide de notre essai, nous avons détecté 100 fois plus de ces isoformes que dans les autres lignées. Nous avons alors entrepris de déterminer s’il s’agit réellement de formes courtes ou d’une rétention totale de l’intron 4. Nous avons ainsi mis en évidence un épissage plus complexe avec des transcrits additionnels détectés à faible taux (rétention intronique partielle…).

Ces premiers résultats illustrent la complexité de la régulation des différentes isoformes de p53 et montrent qu’il est possible d’appréhender l’impact des variants sur leur niveau d’expression à l’aide d’un test simple basé sur la ddPCR.

Le positionnement du séquençage de génome dans la démarche diagnostique après une étude ciblée des gènes connus pour être impliqués dans la pathologie suspectée pose la question de son apport dans le cadre du diagnostic/soin. Les patients négatifs pour les investigations ciblées peuvent être présentés à une RCP d’amont en vue de la réalisation d’un séquençage de génome par SeqOIA ou AURAGEN. Nous attendons donc que le séquençage de génome détecte des variations inaccessibles aux précédentes techniques, ce résumé se concentre sur les variations introniques profondes.

            Un séquençage de génome identifie en moyenne 5.2 millions de variations ponctuelles et petites insertions-délétions, quasiment toutes introniques ou intergéniques. Les connaissances actuelles se concentrent sur la mesure ou la prédiction d’impact sur l’épissage de variations ponctuelles introniques. Très peu de connaissances sont disponibles sur la qualification ou la quantification de l’impact de variations intergéniques. A partir des variations interprétées de ClinVar, nous avons évalué l’intérêt de deux scores actuels (SpliceAI et CADDv1.6) pour discriminer systématiquement les variations introniques pathogènes ou probablement pathogènes, des variations bénignes ou probablement bénignes.

SpliceAI permet de catégoriser une variation pathogène ou probablemnet pathogène avec une sensibilité de 47% et une spécificité de 98%. En particulier, la prédiction juste de gain de site accepteur ou donneur est plus complexe que les pertes. Nous avons complété ce score par l’usage du CADDv1.6 pour améliorer la sensibilité de prédiction. Après une période d’évaluation par le groupe de praticiens AURAGEN, des seuils ont été proposé pour que les variations figurent dans le rapport de synthèse. En moyenne, 5-10 variations par examen sont rapportées. A l’échelle génomique, les annotations restent disponibles pour chaque variation dans l’interface de tri de variations.

Cette approche a permis dès les premiers mois d’identifier des variations introniques d’intérêt diagnostic.

-       Variation en trans d’une variation codante d’une pathologie récessive probable (PKHD1, c.8643-597A>G ; RTTN, c.1802+47G>A ; SETX, c.5549-107A>G ; VAMP1, c.341-24_341-9delinsAGAAAA ;

-       Variation récurrente pathogène (UFM1, c.-273_-271delTCA) ;

-       Variations profondes dans un gène déjà connu pour être impliqué dans la pathologie suspectée (COL4A5, c.2918-244A>G, et c.3809-1066A>G ; IKBKG, c.519-23A>C).

L’interprétation diagnostique de variations introniques reste difficile mais devient possible. Les cas rapportés ici soulignent l’apport diagnostic de tels variants. Il est important de considérer systématiquement certaines variations, mais aussi de fouiller l’interprétation de variations candidates. Afin de conclure sur la pathogénicité ou non de ces variations introniques profondes des analyses complémentaires réalisées dans les laboratoires experts de diagnostic ou de recherche.

Le logiciel SpliceAI apparait comme l’un des meilleurs prédicteurs d’épissage à ce jour (PMID:30661751;32123317;34289339). Il a rapidement conquis la communauté des généticiens moléculaires et son application à l’échelle génomique implique une utilisation simple et une visualisation intuitive. Cependant, l’interprétation des résultats de SpliceAI présente plusieurs limites. Premièrement, l’annotation standard de SpliceAI pour un variant donné se présente sous la forme peu intuitive de 8 nombres : 4 valeurs indiquant la différence de score (delta score) d’un site d’épissage entre l’allèle de référence (REF) et l’allèle alternatif (ALT), associées aux 4 positions nucléotidiques respectives sur l’ARN prémessager des sites altérés. Deuxièmement, les valeurs obtenues correspondent à des données relatives (delta score), ne permettant pas de connaître les valeurs absolues des prédictions de SpliceAI ; ces valeurs absolues sont nécessaires, par exemple, pour présumer du résultat de la compétition de deux sites proches. Troisièmement, les variants de type delins complexe ne sont pas annotés par la version standard de SpliceAI.

Pour remédier à ces limitations, nous avons développé SpliceAI-visual, un outil qui permet de visualiser les prédictions absolues de SpliceAI dans un navigateur génomique. L’utilisation de cet outil est gratuite et s’effectue en ligne sans aucune installation. Cet outil permet d’obtenir les prédictions de SpliceAI pour chaque nucléotide sur l’ensemble du gène, une fois avec la séquence de référence, une fois avec la séquence alternative, où le variant désiré a été introduit. Deux fichiers sont générés (REF, ALT) qui sont compatibles avec les navigateurs génomiques UCSC Genome Browser et IGV. Outre le remplacement des 8 nombres de la sortie analytique de SpliceAI par une visualisation graphique dynamique, cet outil permet (i) d’accéder aux valeurs absolues des prédictions de SpliceAI, facilitant l’interprétation des variants qui altèrent deux sites compétitifs proches, et (ii) de connaître les prédictions de SpliceAI pour des variants non annotés par la version standard de SpliceAI (e.g. deux substitutions en cis, delins complexes, insertions ou délétions de plusieurs kb).

L’utilisation en routine de SpliceAI-visual a facilité l’interprétation de nombreux variants ; il a notamment permis de classer des variants complexes, de guider la position d’amorces de validation fonctionnelle, de visualiser les altérations d’épissage touchant plusieurs exons à la fois, ou de connaître facilement la phase de sites d’épissages prédits.

The Van der Woude syndrome (VWS, MIM 119300), is an autosomal dominant disorder characterized by cleft lip with or without cleft palate, or isolated cleft palate, due to loss-of-function mutations in IRF6 (Interferon Regulatory Factor-6) or GRHL3 (Grainyhead-Like Transcription Factor 3). Most patients show pits on their lower lips. In VWS, most IRF6 alterations are premature stop codons or missense mutations. Pathogenic upstream open reading frame (uORF) mutations are characterized by an out-of-frame upstream start codon (uAUG) located in the 5’UTR and leading to a premature stop codon. uORFs overlap the usual ATG start codon and have a minimum length of 9 nucleotides. We assessed the main features of six uORF-creating mutations identified in VWS patients (two in the lab and four previously described). We also determined all the theoritical SNVs located in IRF6 5’UTR (NM_006147.4) that could create an uORFs and we assessed their potential pathogenicity based on Kozak site in silico prediction.

Only four uORF-creating mutations in IRF6 have been previously associated with VWS to date. We report here two novel mutations creating out-of-frame uAUGs (c.-141C > T p.? and c.-162C > T p.?) that probably reduce IRF6 expression. In our lab, IRF6 mutations are found in about 80% of families with VWS and uORFs-creating mutations represent of 3.2% of them (2/63). Previous studies identifying uORFs-creating mutations did not provide detailed phenotypic data. In our group, in the 6 heterozygotes for c.-141C > T, three had a cleft lip with or without cleft palate and three had only a bifid uvula. The patient heterozygote for c.-162C > T had a posterior cleft with an ankyloblepharon.

Most genes naturally have uORFs in their 5’UTR region, nonetheless we observed that there were no physiological uORF in IRF6. All 6 uORFs identified in VWS had the same termination codon that occurs in exon 3 (56 nucleotides after the usual ATG). To go further, we searched for all potential uAUG-creating SNV in IRF6 5’UTR. We identified 41 of them, including the 6 identified in patients. Except one, none of them is present in the gnomAD control population.  Using a machine-learning-based tool (TIS Predictor, biorxiv.org/content/10.1101/2021.08.17.456657v1, 0 to 1 score range), we then assessed each Kozak similarity score. All 6 uORFs identified in patients had high scores comprised between 0.71 and 0.83, compared to 0.81 for the usual ATG. Among the 35 theoritical SNVs creating an uAUG, 10 may create a potential but weak Kozak site (score range: 0.50-0.71).

In conclusion, uORF-creating mutations can thus be responsible for typical VWS. As untranslated regions are not included in most captured regions in high throughput sequencing strategies, this category of variants may be underdiagnosed in VWS and in human pathology in general.

Contexte. Les diabètes MODY sont des diabètes monogéniques (DM) de transmission autosomique dominante représentant 2 à 3% de tous les diabètes. L’identification du gène impliqué a des conséquences pronostiques et thérapeutiques pour le patient et sa famille. 70% des diabètes MODY sont dus à des variants des gènes GCK, HNF1A et HNF4A, et environ 9% de ces variants sont susceptibles d’altérer l’épissage. Ces gènes étant non exprimés dans le sang et les fibroblastes et le tissu d’intérêt (pancréas) étant difficile d’accès, une analyse par RT-PCR n’est pas envisageable pour déterminer leur impact sur l’épissage. Par ailleurs, les prédictions bioinformatiques d’impact sur l’épissage ne sont pas toujours concordantes et demeurent parfois non conclusives. Par conséquent, les minigènes offrent une approche alternative en permettant d’étudier l’épissage sans recourir au transcrit du patient.

Objectif. Mise en place d’un test minigène pour caractériser l’impact sur l’épissage des variants identifiés au laboratoire dans les 3 principaux gènes du MODY.

Méthodes. 1) Sélection des variants d’intérêt : variants exoniques faux-sens, variants au site consensus d’épissage (site accepteur : -20 à +3 ; site donneur : -3 à +6 ; à l’exclusion des variants aux sites canoniques ± 1 et 2) et variants introniques plus profonds. 2) Analyse bioinformatique basée sur 3 algorithmes de prédiction d’épissage ([MES+SSFL], SPiP et SpliceAI) et priorisation des variants avec un impact sur l’épissage prédit ≥ 1 algorithme. 3) Test minigène : clonage de la région d’intérêt (exon ± 150 pb) dans le vecteur d’expression (pCAS2), transfection dans la lignée cellulaire HeLa, RT-PCR des transcrits minigène, analyse du profil d’épissage sur gel d’agarose et séquençage Sanger.

Résultats. Parmi 87 variants d’intérêt identifiés dans les gènes GCK, HNF1A et HNF4A, 48 (29 GCK, 11 HNF1A et 8 HNF4A) ont été prédits avec un potentiel impact sur l’épissage par ≥ 1 algorithme. Les résultats préliminaires pour 25 variants (22 GCK et 3 HNF1A) montrent que 22/25 (88%) conduisent à une anomalie d’épissage. Les 22 variants avec un impact sur l’épissage confirmé ont tous été prédits par SPiP et SpliceAI et seulement 16/22 étaient prédits par [MES+SSFL]. Parmi les 3 variants sans impact révélé par le test minigène, 2 étaient prédits comme impactés par SPiP et 1 par SpliceAI ; aucun ne l’était par [MES+SSFL].

Les 22 altérations identifiées sont des sauts d’exons (3 en phase et 1 hors phase) ; des rétentions introniques (9), des pertes de portions exoniques (6) ou des altérations multiples (3) qui altèrent le cadre de lecture.

Conclusion. Les résultats ont permis de confirmer le diagnostic moléculaire de DM chez 61 patients de 37 familles. L’objectif du projet est d’intégrer le test fonctionnel minigène de façon prospective dans le diagnostic moléculaire des 3 gènes majeurs impliqués dans les DM.

L’épissage est un mécanisme dynamique complexe qui implique de multiples signaux d’épissage, introniques ou exoniques, présents au niveau des pré-ARNm ainsi que de nombreux facteurs trans régulateurs. Au niveau exonique, toute variation, quel que soit son effet prédit sur la protéine, peut potentiellement altérer ce mécanisme d’horlogerie. Parmi eux, les variants dits synonymes, localisés à distance des sites d’épissage, non prédits comme créateurs de sites d’épissage AG/GT, mais pouvant modifier des motifs cis régulateurs, ne sont pas encore suffisamment pris en compte dans le diagnostic moléculaire.

Nous présentons ici le variant c.627C > T ; p.(Leu209=) du gène TMC1 en exemple d’une analyse moléculaire exhaustive d’un variant synonyme.

La variation c.627C > T, à l’état homozygote, a déjà été décrite dans la littérature internationale chez deux familles Iraniennes dans lesquelles ségrège une surdité non-syndromique récessive liée au gène TMC1. Dans ces publications, ce variant n’avait pas retenu l’attention des auteurs et la transversion c.-258A > C, en cis de cette altération, avait alors été considérée comme étant probablement pathogène avec effet fondateur. A ce stade d’étude, la substitution c.627C > T pouvait être considérée comme probablement bénigne selon les critères ACMG-AMP : PM2, BP4 et BP7.

Ayant identifié le même allèle complexe chez un de nos patients d’origine turque, présentant le même type de surdité, nous avons décidé d’approfondir l’analyse de ce variant c.627C > T. Des études in silico ont prédit une modification d’éléments régulateurs par le variant induisant un saut d’exon, ce qui a ensuite été validé par une analyse minigène. Nous avons également proposé une explication quant à la présence d’une thymine chez plusieurs orthologues qui semblait, a priori, être en désaccord avec un effet délétère de la variation car non conservé. En prenant en compte l’ensemble des données recueillies nous avons pu reclasser cette substitution comme étant une variation causale (classe V) modifiant des éléments régulateurs d’épissage selon les critères ACMG-AMP :PS3, PM2, PM7, PP3 et PP6.

Ce travail, qui aura inéluctablement un impact sur la prise en charge des patients, souligne l’importance de réaliser des analyses exhaustives pour tout type de variation.

Les techniques de séquençage nouvelle génération, (panels, WES, WGS) permettent d’identifier de nouveaux variants pour de nombreux gènes et dans de nombreuses pathologies.

Certains de ces variants sont difficiles à classer et restent de signification inconnue, classe 3 ou VUS.

Parmi ces variants, certains peuvent générer des perturbations de l’épissage et requièrent des études spécifiques afin de déterminer leur réelle répercussion sur l’épissage des transcrits.

Deux approches sont alors possibles : les études de transcrits réalisées à partir de l’ARN du patient et les tests d’épissage faisant intervenir des constructions appelées minigènes permettent d’étudier in vitro ces variants identifiés in silico comme pouvant impacter l’épissage.

Nous souhaitons attirer l’attention sur l’importance des deux approches simultanées dans l’interprétation de(s) l’effet(s) observé(s).

Pour cette étude nous avons considéré deux variants introniques identifiés dans les gènes EFTUD2 et STXBP1 impliqués dans des pathologies du développement et dans les gènes CDH1 et MLH1 impliqués dans certains cancers digestifs héréditaires.

Pour 3 des 4 variants les premiers tests réalisés sur transcrits sanguins n’avaient pas donné d’informations spécifiques alors que le minigène indiquait un effet partiel ou total sur l’épissage. Un design de primers en fonction des résultats obtenus in vitro avec les constructions minigènes, a ensuite permis de mettre en évidence chez les patients l’existence de transcrits spécifiques aux variants étudiés, dus à l’altération de l’épissage. Pour le variant EFTUD2, au vu des résultats non contributifs obtenus par la technique minigène, l’étude des transcrits a permis d’éclaircir le contexte et d’apporter une réponse.

Cette double approche transcrits sanguins et minigènes avec les avantages et limites de chaque technique, permet d’améliorer la détection de l’impact sur l’épissage de nouveaux variants et ainsi de classer ces variants inconnus permettant d’améliorer la prise en charge du patient et des apparentés.

En combinant les données issues d'une méta-analyse des variants d’épissage impliqués dans des maladies génétiques humaines et les résultats d’une analyse fonctionnelle par gène complet (full-length gene splicing assay (FLGSA)), nous avons récemment estimé que 15-18% des variants du site d’épissage 5' GT > GC (c.-à-d. +2T > C) peuvent générer jusqu'à 84% de transcrits de type sauvage (Lin et al. Hum Mutat 2019).

Pour cette étude, nous avons sélectionné 20 variants +2T > C pour lesquels des transcrits de type sauvage ont été observés dans une analyse gène complet, et réalisé pour chacun de ces variants deux analyses minigène en utilisant deux vecteurs différents.

Dans le vecteur pET01, les 20 constructions minigène de type sauvage ont toutes permis de générer les transcrits de type sauvage; En revanche pour les 20 variants +2T > C correspondants, seuls 14 (70%) ont permis de générer des transcrits de type sauvage. Dans le vecteur pSPL3, les transcrits de type sauvage ont été observés pour 18 (90%) des 20 constructions minigène de type sauvage, et pour seulement 8 (44%) des variants +2T > C correspondants.

Ainsi, nous avons mis en évidence une forte discordance en terme de génération de transcrits de type sauvage, non seulement entre les analyses FLGSA et minigène, mais aussi entre les différentes approches minigène.

En conclusion, dans le contexte particulier d’un type de variant (+2T > C), nous avons montré les limites des analyses fonctionnelles par minigène, et soulignons l'importance d’étudier la régulation de l’épissage dans le contexte de la séquence entière. Il reste à déterminer si ces résultats peuvent se transposer à d’autres types de variants altérant l'épissage.

Les laboratoires de génétique sont régulièrement confrontés à des impasses diagnostiques : variants de signification incertaine (VSI) pouvant impacter l’épissage, variant unique dans un gène impliqué dans une pathologie récessive, forte suspicion clinique sans cause identifiée. L’étude des ARN constitue alors une approche complémentaire au séquençage de l’ADN génomique (DNAseq). L’objectif de ce projet est la réalisation d’un séquençage haut débit (NGS) de l’ARN après capture des régions d’intérêt (RNAseq ciblé) sur une cohorte collaborative regroupant 4 secteurs du laboratoire, afin d’en évaluer la faisabilité et l’utilité en diagnostic, par comparaison au séquençage non ciblé (RNAseq total).

La cohorte est composée de 32 patients préalablement étudiés par NGS dans les secteurs déficience intellectuelle (DI), rétinites pigmentaires, myopathies et maladies de la réparation de l’ADN. Elle regroupe 9 témoins positifs porteurs de variations affectant l’ARN, 15 patients porteurs de VSI et 8 patients sans cause moléculaire identifiée. Les ARN totaux ont été extraits de sangs, de fibroblastes cutanés ou de biopsies musculaires. Les librairies ont été préparées à l’aide du kit Agilent Sureselect XT-HS2 RNA en utilisant les sondes de capture SureSelect utilisées pour le DNAseq (panels de 210 à 550 gènes). Les données de séquençage obtenues sur HiSeq4000 ont été analysées à la recherche de variants, de transcrits anormaux et de modification du niveau d’expression. En parallèle, 8 des 32 patients ont été analysés par RNAseq total.

En moyenne, 95% des 40 millions de reads par échantillon obtenus en RNAseq ciblé sont localisés sur les gènes ciblés, à l’exception des 8 ARN issus de muscle (échec d’extraction). Pour les 24 échantillons restants, 83% des gènes ciblés sont exprimés dans les tissus étudiés (ratio d’expression normalisé RPKM > 5), une valeur similaire à celle obtenue en RNAseq total. Les différentes anomalies présentes chez les témoins positifs (saut d’exon, rétention d’intron, dégradation des ARNm non-sens ou NMD) sont identifiées dans les deux techniques, à l’exception d’une duplication hémizygote de deux exons du gène OPHN1. Les conséquences de plusieurs VSI ont pu être précisées : le variant hétérozygote, NM_001356.4:c.543+3_543+6del du gène DDX3X, apparu de novo chez une patiente atteinte de DI, conduit à un saut hors phase de l’exon 6. Un saut hors phase de l’exon 4 du gène ERCC3 a également été mis en évidence chez une patiente atteinte de Xeroderma pigmentosum et porteuse de la variation silencieuse NM_000122.1:c.483C > T p.(Val161=). Les résultats détaillés pour l’ensemble de la cohorte seront présentés.

En conclusion, la majorité des gènes d’intérêt s’est révélée suffisamment exprimée dans les tissus à notre disposition pour étudier la représentativité des variants, l’analyse du taux d’expression et la recherche d’anomalies d’épissage. Le RNAseq ciblé a montré son intérêt pour l’exploration des VSI, à un cout moindre que le RNAseq total.

Près d’un quart des variants introniques et exoniques associés à des phénotypes d’intérêt clinique pourraient conduire à un défaut d’épissage, avec un retentissement plus ou moins important à l’échelle de la protéine et une conséquence plus ou moins marquée au niveau phénotypique. Cette estimation est difficile à vérifier car elle repose sur le croisement de données génétiques et cliniques qui ne sont généralement pas exhaustives. Quoique très importante, elle pourrait en réalité être sous-évaluée. Au-delà de l’exhaustivité de bases de données spécialisées ou de méta-analyses, il faut en effet considérer que les données généralement analysées ne prennent pas en compte l’ensemble des séquences qui participent au processus d’épissage et à sa régulation (sites 5’ et 3’, point de branchement, séquences auxiliaires). L’amélioration très sensible des outils de prédiction in silico ces dernières années ouvre des perspectives intéressantes en terme d’étude systématique de variants susceptibles de modifier l’épissage d’un transcrit d’intérêt. Mais le manque de données expérimentales constitue un frein majeur à la possibilité d’une amélioration plus significative et, surtout, plus globale des prédictions, en particulier pour les variants situés dans des séquences régulatrices. Par ailleurs, les différents algorithmes n’adressent pas la question de la stabilité des différents isoformes, ni celle de l’utilisation possible de sites cryptiques. L’information est qualitative et directement liée à la localisation du variant. Ces différents éléments nous ont conduits à développer une stratégie d’étude multi-parallèle de variants d’épissage basée sur le séquençage d’ARNm pleine longueur.

            Notre stratégie repose sur l’utilisation : i) d’un plasmide optimisé pour le clonage et la transfection de structures géniques (exons codants et intron entiers) allant jusqu’à 8 kb, ii) d’un promoteur non-viral, issu d’un gène d’expression ubiquitaire (POLR2G), iii) de sites de restriction uniques permettant l’insertion modulaire de différentes séquences mutées (produites par synthèse d’ADN) par recombinaison homologue, iv) de code-barres permettant le multiplexage d’une centaine de constructions différentes et l’analyse des transcrits produits dans une phase unique de séquençage, v) de la technologie de séquençage « long-read » PacBio (Sequel) et vi) d’une solution informatique dédiée permettant de caractériser et de quantifier les différents isoformes produits (pipeline snakemake utilisant lima et minimap2).

            Les résultats obtenus au travers de l’étude de quatre gènes modèles (ACKR1, SMIM1, HBB, HFE2) et d’un total de 123 variants, dont une majorité avec un effet connu, permettent de valider l’ensemble de la méthodologie. Ils permettent d’envisager de nouveaux développements tels qu’une analyse fonctionnelle plus approfondie de la variabilité allélique à un locus donné, ou le criblage moléculaire de séquences d’ADN associées au fonctionnement du splicéosome.

Introduction : Les mutations du gène CDH1 sont associées à la prédisposition héréditaire au carcinome lobulaire du sein et au cancer gastrique diffus. L’approche diagnostique par panel de gènes a permis d’augmenter le diagnostic des mutations du gène CDH1, principalement en l’absence d’une présentation familiale de cancer du sein ou de l’estomac. Les principales mutations sont de type faux-sens. Les grands réarrangements sont rares et ceux décrits sont des délétions. Une unique duplication de l’exon 9 du gène CDH1 a été rapportée par Moridnia et al, en 2018.

Méthodes: Nous rapportons le cas d’une patiente qui a présenté un carcinome lobulaire infiltrant du sein bilatéral diagnostiqué à l’âge de 47 ans. Aucun antécédent de cancer n’a été retrouvé dans la famille. Elle a été explorée par un panel de gènes de prédisposition au cancer du sein. Une duplication des exons 4 à 11 du gène CDH1 a été mise en évidence et confirmée par MLPA. Dans ce travail, nous nous proposons de détailler la stratégie adoptée pour la caractérisation de la duplication et sa classification en variant pathogène. Pour cela, nous avons utilisé une approche combinant l’étude ARN et la cartographie optique par le système Bionano.

Résultats : Une étude ARN a été réalisée par RT-PCR puis séquençage Sanger à partir d’une lignée lymphoblastoïde traitée à la puromycine. Grâce à un premier couple d’amorces spécifique du transcrit pathologique (amorce forward sur l’exon 11 et amorce reverse sur l’exon 5), nous avons pu amplifier une jonction reliant l’exon 11 à l’exon 4, confirmant ainsi qu’il s’agit d’une duplication directe en tandem. Etant donné que le gène CDH1 a une isoforme physiologique avec un saut de l’exon 11 à un taux moyen de 20%, nous avons continué l’étude par un deuxième couple d’amorces ciblant l’exon 9 en forward et l’exon 5 en reverse. Nous avons retrouvé deux jonctions pathologiques : une attendue, reliant l’exon 11 à l’exon 4 et une deuxième reliant l’exon 10 à l’exon 4, témoin du saut physiologique de l’exon 11 au sein de la duplication. Quatre types de transcrits sont possibles : duplication en tandem des exons 4 à 11, duplication en tandem des exons 4 à 10 (absence totale d’exon 11), saut de l’exon 11 au niveau de la première copie de la duplication ou saut de l’exon 11 au niveau de la deuxième copie. Sur le plan protéique, ces schémas donnent deux types de protéines CDH1 tronquées : CDH1 p.Ser572fs ou CDH1 p.Tyr523fs. Ceci conclue au caractère pathogène de la duplication.  L’étude par cartographie optique par le système Bionano a confirmé que la duplication était directe et en tandem et a permis de situer les points de cassures au niveau des régions génomiques Chr16 :68841756 à 688553114 (hg19) sur 15kb.

Conclusion : La duplication des exons 4 à 11 est la première duplication multi-exonique décrite du gène CDH1. Notre stratégie a permis de la classer en variant pathogène. Un conseil génétique et une prise en charge adaptés ont pu être proposés à la patiente.

Les short tandem repeats (STR) sont des séquences composées d’unités de 1 à 9 paires de bases répétées en tandem. Des variations de longueur de certains STR sont associées à plus de 50 maladies génétiques. Lorsque le nombre de répétitions excède une valeur seuil donnée, variable selon le locus, la maladie peut se déclarer.

Il est compliqué de mettre en évidence avec précision les variations de longueur des STR à partir de données de séquençage de génomes short read (srGS). Ceci résulte notamment de la difficulté de séquençage de ces régions répétées et du problème d’alignement multiple des séquences. Ces dernières années, plusieurs outils ont été développés par la communauté pour détecter les STR à partir de données de séquençage short read.

L’objectif de notre étude était d’identifier les meilleurs outils et de les tester sur notre cohorte dans le but d’établir de nouveaux diagnostics et de déterminer les paramètres qui font varier la précision des outils.

Nous avons testé les 11 principaux outils de la littérature de détection de STR à partir de données de srGS. Nous avons évalué la facilité d’installation et d’utilisation, la maintenance, le délai d’exécution et les résultats sur 8 contrôles positifs. Nous avons conservé 4 outils, testés sur 23 locus impliqués en pathologie humaine sur notre cohorte de 323 génomes de sujets atteints de troubles du neurodéveloppement. Pour mettre en évidence un nombre de répétitions anormal chez les patients, nous avons identifié les cas avec des valeurs extrêmes (ou outliers) : un nombre de répétitions à un locus donné 1) supérieur à la normale (en zone grise ou en zone pathologique), 2) supérieur au 99^e percentile ou 3) supérieur à 4 écarts types au-dessus de la moyenne (Z-score > 4). Les variations candidates, retenues sur la base d’une concordance génotype-phénotype ou lorsque le nombre de répétitions était supérieur au seuil pathologique, ont été vérifiées par des techniques de référence. Nous avons également étudié l’impact de plusieurs paramètres sur les résultats, tels que la longueur de l’expansion, la profondeur de couverture et la longueur des reads.

L’analyse des 323 génomes a mené à l’identification de 299 outliers, dont 25 candidats, parmi lesquels 1 STR pathologique a été confirmé. L’outil avec les meilleurs résultats sur l’ensemble des critères était ExpansionHunter. Les 4 outils testés sous-estimaient largement le nombre de répétitions de grande taille, ce qui souligne l’intérêt de l’identification des valeurs extrêmes plutôt que des valeurs supérieures au seuil pathologique. Plus la profondeur de couverture était élevée, plus les résultats étaient précis, avec une stabilisation des résultats à environ 15X. La précision des résultats était plus importante lorsque la longueur des reads était supérieure à la longueur de la répétition.

Notre étude montre l’efficacité d’une stratégie de détection des expansions de STR impliqués en pathologie humaine, pour améliorer le rendement diagnostique du srGS.

Les variations structurales du génome sont capables de perturber l'organisation 3D de la chromatine et plus particulièrement les domaines d'association topologique (TAD), centres d'interactions chromatiniennes modulant l'expression des gènes. Un nombre croissant d'études identifient des mécanismes de réorganisation des TADs à l'origine de pathologies humaines. Au sein du laboratoire GAD, nous avons identifié une cohorte de patients présentant des remaniements susceptibles de restructurer les TADs et qui nécessitent d’analyser l’agencement spatial de la chromatine. La capture de conformation de chromosomes à haut débit (Hi-C) permet d'investiguer le paysage chromatinien en visualisant les contacts ADN-ADN à l'échelle pangénomique.

Le protocole de Hi-C ainsi que le processus bioinformatique d’analyse des données de séquençage sont en cours de développement au laboratoire. Des données de Hi-C ont été produites à partir d’une lignée de fibroblastes contrôle et d’une lignée dérivée d’un patient présentant un chromothripsis. Pour cette dernière lignée utilisée comme contrôle positif, nous avons déjà à disposition des données de séquençage de génome en « short read » (Illumina NovaSeq6000), long reads (PacBio Sequel) et des données issues de l'expérience de Hi-C. En recoupant ces informations, nous pourrons valider le protocole et la pertinence des données produites. Le processus d'analyse des données de séquençage requiert de nombreuses étapes pour extraire les informations biologiques à commencer par le pré-traitement des lectures brutes qui génère une liste d'interactions valides jusqu'à la recherche de celles significatives et d'intérêt. Puisque de nombreux outils sont disponibles, nous avons sélectionné un panel de logiciels à tester dont juicer, HiCExplorer, fanc, HOMER, et HiC-Pro, en se basant, d’une part sur la possibilité de les installer sur le serveur de calcul et d’autre part, sur la production des informations dont nous avons besoin en résultats. Les objectifs sont de valider la qualité des librairies produites grâce aux différentes métriques évaluant la complexité de la librairie et de procéder à l’annotation des matrices de contact. Les résultats des différents outils seront confrontés pour sélectionner les méthodes de normalisation, de visualisation ou encore de comparaison des cartes Hi-C obtenues à partir de données contrôles ou de patients.

Le pipeline mis en place, la technique de Hi-C sera appliquée au reste de la cohorte pour aider à la caractérisation des points de cassure et pour fournir des preuves quant aux interactions régulatrices absentes et/ou aberrantes impliquées dans le mécanisme étiologique. A terme, l’analyse des données de Hi-C est destinée à faire partie d’un projet plus vaste d’intégration de données multi-omiques pour caractériser et interpréter les variations de signification inconnue et contribuer à l’effort de lutte contre l’impasse diagnostique dans le cadre des anomalies de développement.

Introduction: La mise en place de plans nationaux de séquençage a entraîné une augmentation sans précédent de la quantité de variations à interpréter en maladies mendéliennes. L'interprétation rétrospective de ces données séquencées à la lumière des nouvelles connaissances de la littérature est un des principaux challenges en génétique médicale. Cette réinterprétation est actuellement manuelle, le manque de ressources humaines ainsi que l’absence de méthodes standardisées rendent difficile son application en routine diagnostique.

Méthodes: Genome Alert! est une méthode open-source qui détecte automatiquement les changements de classifications de variants ayant un potentiel impact clinique entre deux versions de ClinVar. En analysant chaque soumission de toutes les versions disponibles de ClinVar, cette méthode assigne des critères de validité d’associations génotypes-phénotypes. Genome Alert! a été évalué sur une cohorte multicentrique rétrospective de 29 mois portant sur 5 959 individus consécutifs analysés par séquençage de panel ou exome.

Résultats: Entre juillet 2017 et décembre 2019, l'analyse rétrospective des soumissions ClinVar a révélé une médiane mensuelle de 1 247 changements de classification ayant un potentiel impact clinique et 23 nouvelles associations génotypes-phénotypes. Le réinterprétation de 4 929 séquençage panel a mis en évidence 45 changements, dont 89 % des classifications ont été validées par des experts, et a conduit à quatre diagnostics supplémentaires. Le catalogue d'associations génotypes-phénotypes de Genome Alert! a présenté 75 associations de haute confiance non disponibles dans la liste morbide OMIM, dont 20 % sont devenues morbides OMIM 8 mois plus tard. 356 séquençage d'exome négatif ont été réanalysés sur ces 75 gènes. Cette approche restreinte a conduit à un nouveau diagnostic.

Conclusion: Genome Alert! (https://genomealert.univ-grenoble-alpes.fr/) permet la réinterprétation systématique et reproductible des données de séquençage acquises dans une routine clinique avec un impact limité sur les ressources humaines. Un préprint est disponible sur medRxiv (https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2021.07.13.21260422v1).

L’arrivée du séquençage à haut débit à visée diagnostique dans les laboratoires de génétique a augmenté drastiquement le nombre de variants génétiques identifiés par chaque analyse. L’interprétation de la signification clinique de ces variants est devenue un véritable défi pour les laboratoires, surtout pour les variants non décrits précédemment ou pour les variants dans des gènes dont les laboratoires n’avaient pas encore d’expertise spécifique. Afin de limiter la variabilité inter- et intra-laboratoire dans l’interprétation des variants en génétique moléculaire et d’aboutir à un consensus national, les recommandations nationales françaises ont été émises par le Groupe de Travail du Réseau NGS-Diag en 2018, en collaboration avec l’ANPGM, l’ACLF, l’AchroPuce et le GGC, ainsi que plusieurs Filières des Maladies Rares. Ces recommandations, basées en partie sur les recommandations ACMG-AMP, ont été adoptées par la grande majorité des laboratoires diagnostiques en France. Depuis la diffusion de ce document, un certain nombre de mises à jours et de précisions ont été publiés par les groupes de travail sur l’interprétation des variants au sein de ClinGen ainsi que par les groupes internationaux d’experts dans différents domaines de la génétique médicale, nécessitant une nouvelle mise à jour des recommandations françaises initiales.

Pour rechercher les récentes mises à jour des recommandations pour l’interprétation des variants issus des tests par séquençage à haut débit, un travail bibliographique extensif a été effectué. Les données de PubMed, ainsi que tous les documents disponibles sur le site de ClinGen ont été étudiés. Au total, dix publications décrivant des recommandations spécifiques à un gène ou un groupe de pathologies ont été identifiées (MYH7, Rasopathies, PAH, Surdités, CDH1, PTEN, MEN1, RUNX1, GAA, TP53). De plus, six nouvelles recommandations et précisions pour les arguments des critères ACMG-AMP ont été étudiées (PVS1, PS2/PM6, PS3/BS3, PM3, PP5/BP6 ou BA1). Tous les 28 arguments des recommandations ACMG-AMP ont été analysés. Les mises à jour ou des précisions ont été proposées pour 11 arguments suivants : PVS1, PS4, PM2/BS1/BA1, PM3, PS2/PM6, PP1, PP5, BP6. Les modifications proposées ont été ensuite discutées et travaillées au sein du groupe NGS-Diag permettant d’élaborer un document avec des modifications importantes par rapport à la première version des Recommandations. Ce nouveau document a été validé par les réseaux NGS-Diag et ANPGM avant d’être publiée et diffusée aux laboratoires de diagnostic génétique en France en mars 2021 (https://anpgm.fr/media/documents/BP-NGSDiag_001_Interpretation_Variants_v2.pdf). Ce travail facilitera l’homogénéisation de l’interprétation de variants de séquence générés par les analyses de séquençage à haut débit et aidera à diminuer l’errance diagnostique pour les patients atteints des maladies rares.

Le séquençage par nanopores (Oxford Nanopore Technologies) présente un potentiel certain en diagnostic. Cette technologie s’appuie sur les variations séquence-dépendantes d’un courant électrique produites par le passage d’une molécule d’ADN à travers un pore protéique pour en déterminer sa séquence. Elle a pour atouts la simplicité et rapidité de la préparation des échantillons, la détection des bases modifiées, notamment les cytosines méthylées, et surtout la longueur des lectures générées —plusieurs dizaines à centaines de milliers de bases — permettant une détection fiable des variants de structure et la détermination de la phase des variants. Son utilisation en clinique est cependant limitée par la faible quantité de donnée produite par réaction comparée aux tailles des régions étudiées en génétique humaine, nécessitant de multiplier les réactions—et donc les coûts et la quantité de matériel nécessaire—pour atteindre des profondeurs de lecture suffisantes. L’enrichissement contrôlé informatiquement par échantillonnage adaptatif permet de s’affranchir de cette limite. Dans ce mode de séquençage novateur, des régions cibles sont spécifiées par leurs coordonnées génomiques sur un génome de référence et, durant la réaction, la séquence de chaque brin d’ADN analysé est déterminée en temps réel. Si celle-ci s’aligne sur les régions cibles, le brin est entièrement séquencé ; dans le cas contraire, il est éjecté du pore par inversion de la polarité de la membrane. Les données produites sont donc enrichies en séquence issues des régions d’intérêt sans préparation spécifique des librairies de type capture ou amplification. Cette méthode permet d’atteindre, en 48h à partir de deux microgrammes d’ADN et une unique cellule de séquençage, des profondeurs de 20X sur une sélection de 570 gènes d’intérêt en oncologie et tout en produisant un profil pangénomique de méthylation et de variations du nombre de copies. La longueur des lectures obtenues, avec une médiane entre 10 et 30kb, permet la détermination à la base près de variants de structure complexes dans des régions difficilement accessibles avec les méthodes en lectures courtes. La flexibilité dans la détermination des régions cibles permet d’adapter celles-ci à chaque cas, d’un panel de gènes jusqu’au chromosome entier dans l’étude d’évènements de grande taille. Dans cette étude pilote, le séquençage par nanopores couplé à l’échantillonnage adaptatif a permis d’identifier les points de cassure à la base près pour tous les cas testés d’une série de quinze tumeurs rhabdoïdes avec perte partielle ou totale du gène SMARCB1. Il a également révélé un réarrangement complexe d’ATRXsur un neuroblastome initialement vu comme simple délétion en NGS classique. Cette méthode d’enrichissement modulable à l’infini permet la détection des variants de structures par séquençage lectures longues en routine clinique, et pourrait compléter les techniques de NGS dans des indications qui doivent être définies.

La caractérisation de remaniements de structures apparemment équilibrés revêt un intérêt certain pour les corrélations génotype-phénotype. La technique de référence pour leur détection reste aujourd’hui le caryotype standard mais qui présente une résolution bien trop faible (7-10Mb) ne permettant pas ce type de corrélation. Le séquençage génome entier à lectures courtes (srWGS) est de plus en plus utilisé en pratique clinique pour détecter les variations de séquence nucléotidiques mais il a également fait ses preuves dans la caractérisation de remaniements équilibrés (1). Or, des publications récentes montrent les limites du srWGS avec ~10% d’échecs d’identification de SVs connus (1,2). Nous avons récemment montré que la cartographie optique du génome (OGM) est très performante dans la détection d’anomalies chromosomiques de divers types (3). La présente étude vise à comparer les capacités de détection et de caractérisation de variations de structure entre l’OGM et le srWGS.

Nous avons réalisé ces deux analyses à partir d’échantillons de 15 patients, adressés pour troubles du développement/déficience intellectuelle, et chez qui une anomalie chromosomique avait été identifiée par caryotype. Le srWGS a été réalisé en paired-end selon un protocole Illumina. Les outils Breakdancer v 1.4.5 et Svagga ont été utilisés pour l’analyse bioinformatique des variations de structure. L’OGM a été réalisée selon le protocole Bionano en utilisant un instrument Saphyr et les logiciels Bionano Solve et Access.

Parmi les 15 patients étudiés, dix avaient des translocations réciproques simples, un avait une inversion, un autre une insertion et trois patients portaient des réarrangements complexes. L’OGM a permis de détecter et caractériser les remaniements dans 13 cas sur 15 contre 10 cas sur 15 pour le srWGS. La résolution était quant à elle de l’ordre de la paire de base pour le srWGS contre 4 Kb en moyenne pour l’OGM, mais les points de cassure étaient concordants entre les deux techniques. Pour les trois cas caractérisés uniquement par OGM, les points de cassure interrompaient des gènes expliquant le phénotype des patients.

Au total, notre étude suggère que l’OGM permet un diagnostic moléculaire dans plus de cas que le srWGS. La résolution est néanmoins moindre comparée à celle du WGS mais elle ne change pas le diagnostic moléculaire et la corrélation génotype-phénotype. Avec la diminution du coût de l’OGM, cette technique pourrait être utilisée en complément du srWGS dans les pathologies du développement afin de permettre une analyse la plus complète possible du génome.

L’infertilité masculine regroupe de nombreux phénotypes en lien avec des défauts quantitatifs ou qualitatifs de la spermatogénèse affectant la production et/ou la fonction normale des spermatozoïdes. Le spermatozoïde est une cellule hautement spécialisée composé d’un flagelle indispensable à sa mobilité dans le tractus génital féminin. La fonction flagellaire est critique pour le spermatozoïde et tout défaut de cette organelle entraine irrémédiablement une infertilité. Le phénotype d’anomalies morphologiques multiples du flagelle (MMAF) est un phénotype spécifique entrainant une infertilité due à une absence de mobilité et des défauts morphologiques sévères (asthéno-tératozoospermie). Bien que plusieurs causes génétiques aient été déjà identifiées, la moitié des cas reste encore inexpliquée.

L’analyse exomique d’une large cohorte de 167 patients MMAF nous a permis d’identifier 3 patients avec des mutations tronquantes (2 stop et 1 délétion exonique) dans le gène ZMYND12 dont la fonction était inconnue. Un patient supplémentaire avec une mutation pathogène de ZMYND12 issu d’une cohorte chinoise indépendante de patients MMAF a aussi été inclus. Les analyses par immunofluorescence (IF) avec un anticorps anti-ZMYND12 ont montré un marquage spécifique au niveau du flagelle sur des spermatozoïdes contrôles et une disparition complète du signal chez les patients mutés. Des IF complémentaires ont révélé la disparition d’autres protéines axonémales et notamment des protéines du complexe calmodulin-associated and spoke-associated complex (CSC) mais aussi de la protéine TTC29 impliquée dans le transport intra-flagellaire (IFT). Pour valider l’implication de ce gène dans le phénotype, des souris inactivées pour le gène Zmynd12 ont été produites par CRISPR/Cas9. Les souris males Zmynd12^-/- sont infertiles et présentent des spermatozoïdes avec des anomalies similaires à celles observées chez nos patients MMAF mutés. L’étude de l’orthologue de ZMYND12 chez le Trypanosome (TbTAX1) a confirmé la localisation axonémale de la protéine. De plus, l’inactivation de TbTAX1 par RNAi entraine des défauts majeurs de mobilité flagellaire identiques à ceux observés chez l’homme. Enfin, l’analyse de coupes testiculaires humaines par IF ont mis en évidence un signal de la protéine ZMYND12 dans les cellules de Sertoli suggérant une fonction de la protéine autre que purement flagellaire durant la spermatogénèse.

Au final, nous avons pu mettre en évidence pour la première fois des mutations pathogènes dans le gène ZMYND12 chez 4 patients infertiles avec un phénotype MMAF et confirmer son rôle critique dans la fonction flagellaire chez différentes espèces. La localisation flagellaire et testiculaire ainsi que les potentiels interactions avec des protéines du CSC et de l’IFT ouvrent des hypothèses intéressantes pour élucider la fonction de la protéine ZMYND12 dans la biogénèse du flagelle du spermatozoïde et la spermatogénèse.

L'azoospermie non obstructive (ANO), définie par l’absence totale de spermatozoïdes dans l’éjaculat liée à une altération de la spermatogenèse, est une cause fréquente et sévère d'infertilité masculine. Dans certains cas, l’extraction de spermatozoïdes testiculaires est possible et offre au couple une chance de conception intra-conjugale par fécondation in vitro assistée par micro-injection intra-ovocytaire de ces spermatozoïdes. Cependant, en l’absence de facteurs prédictifs, les chances de succès de la biopsie testiculaire sont imprévisibles et de nombreuses chirurgies sont réalisées inutilement. Comme l’ANO repose sur une base génétique solide et très hétérogène, l’identification de nouvelles causes génétiques et la caractérisation de la physiopathologie associée permettraient d’établir une corrélation génotype-phénotype et de prédire les chances de succès d’extraction de spermatozoïdes testiculaires. Dans cette étude, nous avons recruté une cohorte de 96 sujets infertiles atteints d’ANO idiopathique. Tous les sujets avaient bénéficié d’une biopsie testiculaire à visée thérapeutique et d’une étude histologique pour caractériser l’anomalie spermatogénique responsable du phénotype spermatique (aplasie germinale, blocage de la maturation ou hypospermatogenèse). Un séquençage exomique a été réalisé pour l’ensemble des sujets de la cohorte. L'analyse bioinformatique a été limitée à un panel de 151 gènes sélectionnés comme gènes causaux ou candidats connus pour l’ANO. Seuls les variants homozygotes ou hémizygotes hautement délétères ont été retenus comme candidats. Une cause génétique probable a été identifiée dans 16 gènes chez un total de 22 sujets (23%). Sept gènes n'avaient pas été décrits auparavant chez l'homme (DDX25, HENMT1, HFM1, MCMDC2, MSH5, REC8, TDRKH) et 9 avaient déjà été rapportés dans la littérature (C14orf39, DMC1, FANCM, GCNA, MCM8, MEIOB, PDHA2, TDRD9, TERB1). Il est intéressant de noter que 7 sujets présentaient des défauts dans des gènes codants pour des protéines importantes pour le maintien de la stabilité génomique des cellules germinales, 12 dans des gènes de la méiose et trois dans des gènes impliqués dans la maturation post-méiotique. Comme attendu, tous les sujets présentant des défauts dans des gènes méiotiques ont subi un échec d’extraction de spermatozoïdes testiculaires. Dans cette cohorte, le séquençage exomique a donc permis d’obtenir un diagnostic pour 23% des patients analysés. Dans plus de la moitié des cas, un pronostic défavorable fiable de l’extraction spermatique était obtenu, qui pourrait permettre d’éviter un certain nombre de gestes chirurgicaux.

La protéine BRME1 (break repair meiotic recombinase recruitment factor 1) a été décrite très récemment comme étant un facteur important  dans le processus de recombinaison homologues pendant la méiose des cellules germinales testiculaires. Les souris mâles déficientes en BRME1 sont infertiles et présentent une azoospermie liée à un blocage méiotique de la spermatogenèse. Dans cette étude, nous avons étudié par séquençage exomique une cohorte de patients  infertiles présentant une azoospermie non-obstructive (ANO) idiopathique et non syndromique. L’analyse bio-informatique des données d’exome nous a permis d’identifier un variant homozygote dans l’exon 6/8 du gène BRME1 (c.1498C>T ; p.Gln500Ter) chez un sujet issu de parents consanguins et présentant un arrêt méiotique de la spermatogenèse. Le variant identifié est un variant rare (fréquence allélique <1% dans gnomAD), absent de notre  cohorte locale de sujets contrôles (n=445). Après avoir vérifié la présence de ce variant à l’état homozygote par séquençage Sanger, nous avons utilisé la technique CRISPR/Cas9 pour induire une délétion frameshift dans l’exon 6/8 de l’orthologue murin mimant ainsi le variant identifié chez notre patient. Après avoir produit une lignée stable, nous avons montré par RT-PCR et séquençage Sanger que les souris homozygotes produisent un transcrit unique codant pour une protéine tronquée et dépourvue de son domaine C-terminal. L’analyse phénotypique des souris mâles homozygotes adultes a confirmé que celles-ci étaient infertiles et présentaient une azoospermie liée à un arrêt méiotique. Ces résultats confirment donc le caractère délétère du variant BRME1 identifié par séquençage exomique et l’importance du domaine C-terminal de la protéine. Il s’agit ici du premier rapport montrant l’implication de ce gène dans l’infertilité masculine et l’ANO chez l’homme. Comme le phénotype testiculaire associé est homogène, les chances de récupération des spermatozoïdes par biopsie testiculaire sont quasi-nulles, contre-indiquant ainsi cette procédure chez les futurs patients présentant des variants BRME1 bi-alleliques perte de fonction.

L’infertilité se définit comme l’impossibilité de concevoir une grossesse après 12 mois de rapports sexuels réguliers non protégés. Elle est principalement due à un défaut qualitatif ou quantitatif des gamètes. Chez les femmes, une origine ovarienne est observée dans 35% des cas d’infertilité ; une des causes majeures est l’insuffisance ovarienne prématurée (IOP). Plusieurs mécanismes ont été proposés pour expliquer l’insuffisance ovarienne : une formation anormale du stock folliculaire ou sa déplétion accélérée, une augmentation de l’atrésie folliculaire, un défaut de recrutement folliculaire et un arrêt de maturation folliculaire ou ovocytaire. L’arrêt méiotique, impliqué dans la dernière situation, est aussi observée chez des hommes infertiles présentant une azoospermie non obstructive (ANO). Une collaboration a été mise en place entre le CHU de Rennes ayant développé une plateforme régionale pour la prise en charge des IOP et le CHI de Poissy Saint-Germain-en-Laye impliqué dans la prise en charge des NOA, afin de mettre en évidence des origines génétiques communes aux situations d’arrêt méiotique chez la femme et chez l’homme, à partir de données de séquençage massif en parallèle. Ce travail a permis de mettre en évidence de nouveaux variants dans des gènes récemment associés aux arrêts méiotiques. L’implication d’un même variant homozygote du gène STAG3 dans une fratrie comprenant une sœur avec IOP et un frère avec ANO a été décrite. Il s’agit du premier cas de variant faux-sens homozygote décrit pour ce gène ainsi que du premier cas familial. Chez une patiente avec IOP, l’implication du gène ZSWIM7 est suspectée. Un variant homozygote de ce gène a été observé chez 2 patients avec ANO en 2021 et encore plus récemment chez une patiente avec IOP. De nouveaux variants du gène PSMC3IP ont également été observés en cas d’IOP ou d’ANO. L’implication d’autres gènes comme REC8 qui n’ont pas encore été décrits dans des situations d’arrêt méiotique est en cours d’évaluation. Ces résultats confortent l’implication des gènes « méiotiques »  dans les IOP et ANO et montrent l’existence de voies moléculaires communes à ces situations d’infertilité masculine et féminine. L’ensemble de ces résultats sont en accord avec les données observées chez l’animal et en particulier la souris, où l’inactivation de gènes impliqués dans la méiose est à l’origine d’une infertilité dans les 2 sexes.

Bien qu’une majorité des insuffisances ovariennes prématurées (IOP) soient idiopathiques, des causes génétiques telles que les anomalies de structure chromosomiques impliquant notamment le chromosome X ont été mises en évidence. Le mécanisme physiopathologique des anomalies équilibrées est difficile à caractériser et outre la possible perturbation de la méiose, il fait également intervenir l’interruption ou la dérégulation de gènes au niveau ou à proximité du point de cassure. Les techniques actuelles de WGS permettent une analyse fine des variants structuraux (SV), révélant une architecture complexe des points de cassures (BP).

Afin d’essayer caractériser au mieux les réarrangements équilibrés associés à des IOP, nous avons analysé une cohorte de 7 patientes. Pour l’ensemble d’entre elles, un caryotype, une ACPA ainsi qu’une analyse des points de cassure par WGS ont été réalisés. En l’absence d’interruption génique ou en cas d’interruption d’un gène sans lien avec le phénotype, les gènes situés à 1 Mb de chaque côté des points de cassure ont été analysés, en s’appuyant sur les bases de données OMIM (online mendelian inheritance in man), OKdb (ovarian kaleidoscope database) et GeneHancer pour les éléments régulateurs. 6/7 présentaient une translocation impliquant le chromosome X et 1/7 une translocation impliquant des autosomes (préciser laquelle). Un réarrangement complexe comprenant une translocation t(X ;4) ainsi qu’une inversion sur le chromosome X a été mise en évidence. Les points de cassure observés sur le chromosome X étaient concordants avec les données de la littérature : 3/6 étaient retrouvés en Xq21 (région POF2) et 3/6 en Xq26 (région POF1). Les phénotypes associés étaient cohérents avec les données précédemment décrites de la littérature, les patientes porteuses d’un BP en Xq21 ayant un phénotype plus sévère.

Plusieurs gènes candidats ont été retenus. Le gène EIF2AK4 était interrompu chez la patiente porteuse d’une translocation autosomique. La famille des EIF a été décrite comme impliquée dans la maturation de l’ovocyte. EIF2AK4 est fortement exprimé au niveau des ovocytes murins et des variants délétères d’EIF2AK1 ont été décrits dans des cas d’IOP syndromiques. Chez une autre patiente, Genehancer a de mettre en évidence un effet longue distance sur le gène INHBA. Les inhibines et activines sont des hormones sécrétées par les cellules de la granulosa, essentielles pour la sécrétion de FSH. Le dosage de l’inhibine A chez la patiente retrouvait un taux effondré.

Cette analyse a ainsi permis de mettre en évidence de nouveaux gènes candidats à proximité ou au niveau des BP (EIF, RAD, NUP, INHBA), de confirmer les données phénotypiques de la littérature associées aux régions POF1 et POF2, ainsi que de finement caractériser les SV impliqués.

La chromatine est organisée dans le noyau interphasique selon une architecture tridimensionnelle hiérarchique, dont l’organisation de base est le territoire chromosomique. Cette architecture joue un rôle critique dans la régulation transcriptionnelle. La périphérie nucléaire est un environnement particulier, répressif pour la transcription, alors que l’intérieur du noyau est plus favorable à l’activité transcriptionnelle.

Les remaniements de structure chromosomique équilibrés peuvent être associés à un phénotype anormal par interruption de gène ou effet de position. Leur impact sur l’architecture nucléaire a cependant été peu étudié.

Nous avons étudié par 3D-FISH le positionnement nucléaire radial de loci impliqués dans des remaniements chromosomiques équilibrés chez huit patients atteints de déficience intellectuelle et/ou malformations congénitales. Ces remaniements, six translocations réciproques et deux inversions péricentriques, ont été préalablement caractérisés par séquençage génome entier. Suite à l’hybridation de sondes localisées à proximité des points de cassure chez les patients et des contrôles, la reconstruction et l’analyse de 50 à 100 noyaux a été réalisée à l’aide du logiciel Arivis, permettant de calculer le ratio de position radiale. 

Les loci impliqués dans un même remaniement occupent des positions nucléaires radiales proches, ce qui a très probablement favorisé la survenue du réarrangement entre ces loci. Une relocalisation nucléaire radiale significative a été observée pour quatre des huit remaniements, du centre vers la périphérie pour trois d’entre eux et de la périphérie vers le centre pour un autre. Parmi ces remaniements, une translocation X-autosome t(X;1) présente une relocalisation du centre vers la périphérie du noyau pour le locus RP11-958E2 (1p36.31) sur le dérivé X. De façon intéressante, le phénotype de la patiente porteuse de cette translocation est très évocateur d’une monosomie 1p36. L’étude de l’inactivation de l’X a montré un biais en faveur du chromosome X normal. La relocalisation en périphérie du bras court du chromosome 1 pourrait être à l’origine d’un silence transcriptionnel et d’une monosomie 1p36 fonctionnelle, permettant d’expliquer le phénotype malgré le biais d’inactivation favorable.

En conclusion, ce travail montre que les remaniements chromosomiques peuvent être associés à un repositionnement nucléaire de régions chromosomiques qui pourraient ainsi jouer un rôle dans l’apparition d’un phénotype anormal.

Six cent millions de personnes présentent une insuffisance rénale chronique dans le monde, dont plus de 3 millions en France. Malgré l’importance d’un diagnostic étiologique, 10 à 20% des néphropathies restent d’origine indéterminée. Une plus grande accessibilité des examens pangénomiques, tels que le séquençage complet de l’exome et du génome entier, pourrait permettre de reclasser de nombreux cas de néphropathies indéterminées. L’indication d’analyses pangénomiques en néphrologie est loin d’être formellement définie. Nous souhaitons ici rapporter la plus grande cohorte française de séquençage complet de l’exome en néphrologie adulte, son rendement diagnostique (comprenant une analyse performante des Copy Number Variation (CNV)), ainsi que les conséquences de ces diagnostics.

                Entre septembre 2018 et février 2021, dans le cadre du soin courant, 538 cas-index non apparentés ont été prélevés. Après extraction de l’ADN génomique, les régions codantes de l'exome (37 mégabases) ont été enrichies avec le kit Twist Human Core Exome, puis séquencées en paired-end sur NextSeq500 (Illumina). La ségrégation des variants a été étudiée par technique ciblée chez les apparentés, le cas échéant. La recherche de CNV a été faite à partir de l’exome et est basé sur GATK4.

                Sur 538 cas-index non apparentés, le séquençage de l’exome a permis de poser un diagnostic de certitude chez 135 patients, soit un rendement diagnostique de 25%. L’âge moyen des patients était de 43 ans [± 13]. 80% des patients ont été analysés en exome « solo», Une étude de ségrégation à des fins d’interprétation a été nécessaire chez 22% des patients positifs (n=29) et 9% de l’ensemble des patients testés (n=49).

Les principaux diagnostics génétiques posés appartiennent aux groupes des basalopathies (n=34, 25%) et des ciliopathies (n=37, 27,5%). Les résultats étaient le plus souvent inattendus, avec des phénotypes relativement pauvres ou atypiques. Sept patients ont eu un résultat concluant avec identification d’un CNV pathogène, soit 5,2% des diagnostics positifs.

Le diagnostic génétique a eu diverses conséquences pour les 135 patients avec diagnostics positifs : clarifier le mode de transmission (n=104, 77%), proposer un diagnostic pré-symptomatique ou dépister des apparentés (n=85, 63%), aider à la sélection d’un potentiel donneur vivant apparenté (n=10, 7,5%), ne pas envisager ou arrêter un traitement immunosuppresseur (n=15, 11%), éliminer une potentielle récidive sur le greffon (n=27, 20%), prescrire des examens complémentaires dans le cadre du rétro-phénotypage (n=48, 35,5%). 

Avec un rendement diagnostique important, des conséquences cliniques et thérapeutiques majeures et un coût mesuré, notre étude montre l'intérêt du séquençage de l’exome complet avec analyse intégrant la détection des CNV dans les néphropathies indéterminées de l’adulte. Les diagnostics posés ont souvent été inattendus, validant l'intérêt d'une approche pangénomique en première intention.

Contexte : Les SK et les nHHC sont des maladies rares responsables d’altération du développement pubertaire et d’infertilité. Leurs physiopathologies sont distinctes, liées à des anomalies du développement neuronal ou de l’homéostasie gonadotrope.

But du travail/méthodes : Etude mono-centrique, par exome ciblé (EC) incluant 49 gènes, comparant l’architecture génétique et le « gene-burden » chez 169 KS versus 231 nCHH. Deux approches: 1) analyse supervisée (AS) diagnostique. 2) Analyse non supervisée (ANS) de l’ensemble des données génotypiques de notre cohorte.

Résultats : L’EC a identifié 9769 variants chez les KS et 13390 variants chez les nCHH, dans les régions codantes±2bp. L’AS permet de détecter des variants pathogènes (classes 4, 5) chez 42% des SK contre seulement 21% des nCHH. Chez les SK et les nCHH 2 gènes (FGFR1 et PROKR2) étaient prépondérants (50% des cas élucidés). En revanche ANOS1 était exclusif du SK et GNRHR/GNRH1, KISS1R, TACR3/TAC3 exclusifs des nCHH. L’ANS/gene burden (ensemble des données NGS) a montré qu’un seuil de MAF < 0.5% permettait de discriminer deux architectures génétiques distinctes : Le SK associé significativement aux gènes impliqués dans le développement neuronal (ANOS1, PROKR2, PROK2, FGF8, FGF17, IL17RD, CHD7, SEMA3A) versus le nCHH associé significativement aux gènes de l’homéostasie gonadotrope (GNRHR/GNRH1, KISS1R, TACR3).

Conclusion : Vue la concordance constatée entre les AS et ANS il semble raisonnable de limiter pour le diagnostic de première intention un EC ciblée incluant les 14 gènes prévalents. Dans les cas non élucidés, une analyse par WES ou WGS semble pertinente en deuxième intention.

Objectifs. La découverte de la première époxyde hydrolase (EH), EPHX1, remonte à plus de 40 ans et on connaît aujourd’hui 5 gènes codant des EHs. Les EHs sont des enzymes régulant l'homéostasie cellulaire par l'hydrolyse de divers substrats époxydes en diols moins réactifs. Les fonctions des EHs restent en partie inconnues et aucun variant pathogène n'a été rapporté à ce jour chez l'homme dans cette classe de gènes.

Patients et méthodes. Deux familles indépendantes ont fait l’objet d’analyses d’exomes en trio. L’effet des variants d’EPHX1 identifiés a été modélisé dans différents systèmes cellulaires : des cellules HEK293 exprimant les formes normales et mutées de la protéine, des cellules pré-adipocytaires murines 3T3-L1 et des cellules souches adipocytaires humaines (ASC) dans lesquelles EPHX1 a été inactivé par un système CRISPR-Cas9, ainsi que des fibroblastes de patients.

Résultats. Nous avons identifié deux variants pathogènes de novo situés dans le site catalytique d'EPHX1 chez des patients atteints d'un diabète lipoatrophique complexe caractérisé par une perte de tissu adipeux, une insulino-résistance, et des atteintes multiples d’autres organes. L’analyse des cellules HEK293 a révélé que ces variants conduisaient à l'agrégation de la protéine dans le réticulum endoplasmique et à une perte de son activité d'hydrolyse des époxydes. Le knockout (KO) d'Ephx1 dans les 3T3-L1 et les ASC abolit la différenciation adipocytaire et inhibe la réponse à l'insuline. L’étude de ces deux types cellulaires révèle également un stress oxydatif majeur et une sénescence cellulaire, des observations confirmées sur les fibroblastes de patients. Enfin, un effet bénéfique du traitement par la metreleptine a été observé chez les patients.

Discussion. Cette étude translationnelle souligne l'importance de la régulation des époxydes dans le fonctionnement adipocytaire et la résistance à l’insuline, et apporte de nouvelles connaissances sur les rôles physiologiques des EHs chez l'homme.

L’alpha-mannosidose est une pathologie rare, autosomique récessive associant des signes dysmorphiques, une surdité, des anomalies squelettiques, des infections récurrentes et une déficience intellectuelle. Elle est secondaire à des mutations bialléliques faux-sens ou perte de fonction du gène MAN2B1 et plusieurs formes, de sévérité variable, sont décrites. 

Nous rapportons ici le cas d’un patient de 30 ans, suivi pour une déficience intellectuelle, une maladie de Verneuil, une dysmorphie (sourcils épais, macroglossie, arête nasale aplatie, raideur articulaire) et une rétinopathie. L’analyse par séquençage d’exome a mis en évidence une première variation faux-sens rare à l’état hétérozygote dans le gène MAN2B1 (p.Gly726Ser) héritée du père. L’analyse de CNVs sur l’exome n’a pas retrouvé de variation dans ce gène. En revanche, l’algorithme  AluMEI (Seqone) a identifié une insertion Alu à l’extrémité 5’ de l’exon 22 du gène MAN2B1, héritée de la mère. L’analyse approfondie de cette région sur IGV a montré que cette insertion était en réalité une délétion de 1556 paires de bases (pb) emportant la totalité de l’exon 21 et 52 pb de l’exon 22 du gène MAN2B1. Le point de cassure en 5’ intronique de cette délétion étant situé dans une séquence Alu, elle a été identifiée comme une insertion d’élément mobile. Cette délétion a été confirmée par PCR digitale et entraîne donc une perte de fonction sur l’allèle maternel.

Un reverse phenotyping a permis de retrouver des signes évocateurs d’alpha-mannosidose, avec une atteinte rétinienne, peu décrite dans cette pathologie mais évoquant une maladie de surcharge lysosomale, et une dysmorphie concordante. L’analyse biochimique a confirmé le diagnostic chez le patient.

Nous décrivons donc un cas d’alpha-mannosidase de diagnostic tardif, avec une atteinte rétinienne rare mais spécifique, et dont l’une des variations responsables est une délétion de petite taille non identifiée par les algorithmes de recherche de CNVs mais rattrapée grâce à la présence d’une séquence Alu. Cet exemple illustre les difficultés d’identification de petits CNVs par séquençage d’exome et démontre la nécessité d’une lecture attentive des fichiers de séquençage, étape déterminante dans l’interprétation et la validation des variations du génome, et plus particulièrement des variations de structure.

Objectif : Évaluer l'efficacité de la triheptanoïne, un triglycéride à chaîne moyenne avec un nombre impair de carbones qui cible le cycle de Krebs, sur l'imagerie cérébrale et l’atteinte motrice dans la maladie de Huntington (MH).

Contexte : Nous avons précédemment montré que le déficit énergétique dans la MH est associé à des besoins accrus en substrats pour le cycle de Krebs. À l'aide de la spectroscopie IRM cérébrale au phosphore 31, nous avons ensuite démontré que la triheptanoïne peut restaurer un profil énergétique cérébral normal chez les patients MH.

Méthodes : Nous avons mené une étude bicentrique (Paris et Leiden) contrôlée randomisée de 6 mois (NCT02453061) comparant la triheptanoïne 1g/kg/jour versus placebo chez 100 patients (ratio 1/1) à un stade précoce de la MH, suivi d'une phase en ouvert de 6 mois. Après un an, les patients pouvaient choisir une extension d'un an. Le critère de jugement principal était l'atrophie du noyau caudé à 6 mois. Les critères de jugement secondaires étaient l’atrophie caudée à 12 et 24 mois, le score moteur total (TMS) de l'UHDRS (United Huntington Disease rating Scale) et l'imagerie microstructurale par tenseur de diffusion (DTI) et par la méthode FBA (Fixel-Based Analysis, qui permet l'analyse des croisements de fibres) à 6, 12 et 24 mois. Pour effectuer une analyse comparative de la triheptanoïne versus placebo sur un an, nous avons par ailleurs utilisé le bras placebo d'un essai contrôlé randomisé d'un an (NCT02336633), mené en parallèle, et avec des méthodes identiques, chez des patients MH présentant les mêmes caractéristiques (âge, durée de la maladie, TMS, répétitions CAG).

Résultats : 86 patients ont terminé l'étude d'un an et 42 patients l'extension de 12 mois. La triheptanoïne a été bien tolérée. Les effets secondaires étaient principalement des problèmes gastro-intestinaux, résolutifs après intervention diététique. L’atrophie caudée n’était pas différente à 6 mois entre les groupes triheptanoïne et placebo. Cependant, nous avons observé une stabilisation de l’atteinte motrice (TMS) à 12 mois chez les patients traités par triheptanoïne (moyenne 0,6 ± 5,1) par rapport aux patients traités pendant 6 mois seulement (2,5 ± 4,5) (p = 0,072), avec une différence significative entre 6 et 12 mois ( -0,7 ± 3,9 vs 1,9 ± 4,7, p= 0,024). Les analyses DTI ont montré moins d'altérations microstructurales chez les patients traités par triheptanoïne pendant 24 mois, et les analyses FBA ont montré une amélioration de la trophicité de certaines fibres à 24 mois. La comparaison à 12 mois avec le bras placebo externe a confirmé la stabilité motrice des patients traités par triheptanoïne (2,6 ± 4,6 vs 0,6 ± 5,1, p = 0,057) et a révélé une diminution de 50% de l’atrophie caudée sous triheptanoïne (-3 % vs -6,7 %, p < 0,001) (Figure 1).

Conclusions: Ces résultats montrent que le traitement par triheptanoïne permet une stabilité de l'atteinte motrice et une diminution de l'atrophie caudée chez les patients MH.

Les syndromes hypertrophiques liés au gène PIK3CA (PROS) regroupent diverses présentations cliniques en fonction de la localisation de l’atteinte principale. Lorsque l’hypertrophie prédomine au niveau cérébral (mégalencéphalie), on parle de syndrome MCAP (Megalencephaly-CApillary malformation Polymicrogyria syndrome). Des malformations vasculaires cutanées, et des anomalies des structures cérébrales, et des troubles cognitifs au cours de la croissance de l’enfant, de type épilepsie ou déficience intellectuelle, peuvent s’associer de façon inconstante au tableau. Il n’existe actuellement aucun médicament autorisé dans cette maladie.

L’alpelisib (BYL719, Novartis®) est un inhibiteur spécifique de la sous-unité α de PIK3CA, autorisé dans le traitement du cancer du sein métastatique, et en cours d’évaluation chez les patients PROS (NCT04589650). Mais les critères de jugement ne sont pas tous adaptés à l’évaluation spécifique des atteintes neuro-cognitives, justifiant la conduite d’un essai dédié au syndrome MCAP.

L’essai ESA-MCAP est un essai collaboratif, initié par le CHU Dijon Bourgogne, et co-financé par le laboratoire Novartis. Il s’agit d’un essai national de phase II multicentrique en 2 périodes : i) une période randomisée de 6 mois à dose fixe en double aveugle versus placebo suivie ii) d’une période en ouvert (alpelisib pour tous les patients) avec possibilité d’escalade de dose, pour obtenir une durée totale de traitement par alpelisib de 24 mois.

L’objectif principal sera d’évaluer l’efficacité à 24 mois d’un traitement par alpelisib sur les comportements adaptatifs des patients entre 2 et 40 ans avec syndrome MCAP, mesurée par une amélioration ≥4 points sur l’échelle de comportement adaptatif de Vineland-2^nde édition. L’efficacité précoce à 6 mois versus placebo, ainsi que l’efficacité sur les paramètres neuropsychologiques (échelles de performance neuropsychologiques adaptées à l’âge), le volume cérébral (IRM), l’épilepsie (nombre d’épisodes convulsifs), la qualité de vie (questionnaires) et sur les autres atteintes non cérébrales seront secondairement évaluées. Les patients seront suivis au maximum 34 mois, avec au maximum 15 visites, alternées entres le centre coordinateur pour les visites d’évaluation (à l’initiation du traitement, à 6, 12 et 24 mois) et leur centre local pour les visites de suivi de sécurité. Un total de 16 patients est prévu dans l’essai pour une durée d’inclusion d’un an, avec un début prévu au premier trimestre 2022.

 Cette étude s’inscrit dans un programme d’essais thérapeutiques initiés depuis plusieurs années par la FHU TRANSLAD (TRANSLAD-Treat), les centres de référence AnDDI-Rares, Déficience et FIMARAD, dans le but d’identifier des thérapies ciblées dans les pathologies liées à PIK3CA. Ce projet permettra également d’apporter une nouvelle expérience sur la conduite des essais thérapeutiques encore insuffisants dans les troubles du neurodéveloppement.