SLITRK2 est une protéine transmembranaire exprimée au niveau des neurones postsynaptiques qui régule la croissance des neurites et le maintien des synapses excitatrices. Dans cette étude, nous rapportons des variations rares de SLITRK2, localisé sur le chromosome X, identifiées en exome chez des patients atteints de troubles du neuro-développement (TND). Ces variants comprenaient un variant non-sens (p.Glu461*) et six variants faux-sens qui n'ont pas été rapportés précédemment à l'état hémizygote dans les populations de la base de données gnomAD. Quatre variants sont apparus de novo chez les patients ou chez la mère de l’un d’entre eux, et trois variants ont été hérités de mères asymptomatiques. Les individus porteurs de ces variants présentaient une déficience intellectuelle de sévérité variable, un retard de langage, une démarche instable pouvant s’associer à une spasticité des membres inférieurs, une épilepsie et des manifestations neuropsychiatriques, notamment une anxiété majeure et un trouble du spectre de l’autisme. Des études fonctionnelles ont montré que les variants Leu74Ser, Pro374Arg, Arg426Cys et Glu461* induisaient, dans des cellules HEK293, une altération de la localisation des protéines SLITRK2 mutantes à la membrane et de leur capacité à interagir avec leur ligand extracellulaire, PTPδ. L’analyse de neurones d’hippocampe issus de souris knock-out conditionnelles (cKO), chez lesquelles Slitrk2 a été inactivé dans le système nerveux central, a révélé une altération de la transmission synaptique. Cette altération, caractérisée par une diminution de l’amplitude des courants synaptiques excitateurs, est reversée par l’expression de la protéine SLITRK2 humaine mais pas par celle des protéines mutantes Leu74Ser, Pro374Arg, Arg426Cys, Thr312Ala et Glu461*. De plus, nous avons pu montrer que les souris Slitrk2 cKO pour Slitrk2 présentaient une altération de la mémoire à long terme et une démarche anormale, récapitulant un sous-ensemble de caractéristiques cliniques des patients porteurs de variations du gène SLITRK2. Collectivement, ces données suggèrent que le gène SLITRK2 est impliqué dans une nouvelle forme de TND lié à l'X causée par la perturbation de diverses facettes de la fonction de SLITRK2.

L’évolution rapide des connaissances scientifiques dans le domaine des maladies rares et en particulier pour les troubles du neurodéveloppement ainsi que l’amélioration continue des outils bioinformatiques  rendent indispensables la réanalyse périodique des études pangénomiques telles que le séquençage d’exome et de génome.

Nous avons réanalysé les données de séquençage d’exome de 49 patients atteints d’une trouble du neurodéveloppement pour lesquels un résultat négatif ou un variant de signification inconnue avait été rendu. Le taux diagnostic initial était de 39% (31/80). La réanalyse a été réalisée entre 18 et 36 mois après la première analyse. Ceci a permis d’identifier 5 nouveaux diagnostics ce qui représente 10% des dossiers réanalysés. Pour 3 d’entre eux, il s’agissait de gènes décrits après la première analyse (FOXP4 : +10 mois, AP2M1 : +13 mois, AGO2 : +22 mois). Les 2 autres ont été identifiés grâce à une amélioration du logiciel utilisé permettant de mettre en évidence une délétion hétérozygote de plusieurs exons dans le gène CNOT2 et un variant hérité d’un parent dans le gène MAGEL2. Cette réanalyse a donc permis de passer d’un rendement diagnostic de 39% à 45%.

La réanalyse régulière pose des problèmes en termes de temps puisque le nombre d’exomes à réanalyser est croissant, notre plateforme de bioinformatique a donc développé un outil (PolyBTF) permettant de rechercher automatiquement tous les 3 mois, les patients porteurs de variants nouvellement décrits dans les bases de données de patients HGMD et ClinVar. Ceci est particulièrement utile pour les variants en dehors des régions codantes des gènes déjà connus et pour les variants récurrents des nouveaux gènes ce qui était le cas pour les variants des gènes FOXP4 et AP2M1. La plateforme a également développé un outil (PolyDejaVu) permettant de rechercher dans un gène donné tous les variants présents dans notre base de données, nous permettant de rechercher des patients éventuellement porteurs de variants dans des gènes nouvellement décrits.

Avec la montée en puissance des études pangénomiques, il devient indispensable de développer des outils informatiques d’aide à la réanalyse afin d’optimiser au maximum les données génomiques de nos patients.

Le gène RTTN (OMIM 614833) code pour la protéine rotatine, cruciale pour l’établissement de l’asymétrie droite-gauche et la rotation axiale de l’embryon. Cette protéine est requise lors des premières étapes d’élongation et maturation des centrioles, régule le cycle cellulaire et participe à la formation du cil primaire, organelle à la surface des cellules qui fonctionne comme une antenne relais de nombreux signaux essentiels au développement et à l’homéostasie tissulaire.

Les variants pathogènes de RTTN sont associés à un syndrome autosomique récessif associant une petite taille, un retard de développement, une microcéphalie avec anomalies de gyration et une épilepsie. Ici, nous rapportons deux cas, celui d’un fœtus présentant une micro-lissencéphalie, et celui d’une patiente présentant un phénotype fortement chevauchant avec le syndrome de Taybi-Linder (TALS/MOPD1, OMIM 210710). Dans les traits caractéristiques de la patiente : un retard de croissance sévère, un retard d’ossification, une microcéphalie avec une pachygyrie et un corps calleux fin, une dysmorphie faciale marquée avec des yeux proéminents et un menton fuyant, des cheveux épars et de l’eczéma. Les deux cas portent le même variant pathogène c.2953A > G du gène RTTN, qui affecte un site donneur d’épissage. TALS est une pathologie très rare causée par des mutations récessives dans le gène RNU4ATAC, qui est transcrit en un petit ARN nucléaire non-codant, U4atac, composant du splicéosome mineur impliqué dans l’épissage des 850 introns mineurs du génome humain.

Afin d’élucider les causes physiopathologiques du TALS, restées inconnues à ce jour, nous avons choisi d’étudier la mutation RTTN dans différents modèles. Tout d’abord, nous avons confirmé que le variant entraîne un défaut d’épissage de RTTN comme décrit précédemment, dans les fibroblastes de nos deux patients, et ce sans affecter le niveau d’expression des transcrits. Par la méthode de super-résolution appelée microscopie à expansion, nous avons montré une légère réduction de la localisation de rotatine aux centrioles, accompagnée d’une diminution de leur taille. Enfin, nous avons observé une diminution de la longueur des cils dans les fibroblastes du fœtus seulement, et aucun défaut concernant le désassemblage du cil.

Pour étudier plus spécifiquement les processus de neurogenèse, nous avons introduit par CRISPR-Cas9 la mutation c.2953A > G dans des cellules souches pluripotentes induites (iPSC), et réalisé des différenciations en monocouche de neurones et en organoïdes corticaux. Les données préliminaires montrent de manière surprenante une augmentation de la taille des cils dans les progéniteurs neuronaux mutés pour RTTN, ainsi qu’un défaut de différenciation en organoïdes observable dès J32. Nous poursuivrons notre étude par l’analyse morphologique des organoïdes et des processus de ciliogenèse, prolifération, apoptose et migration, qui seront par la suite appliqués aux modèles iPSC mutés RNU4ATAC que nous avons générés.

The evolutionarily conserved transport protein particle (TRAPP) complexes (TRAPP II and III) perform fundamental roles in subcellular trafficking pathways. Here we identified biallelic sequence alterations in TRAPPC10 , a component of the TRAPP II complex, in individuals with a severe microcephalic neurodevelopmental disorder. Molecular studies revealed a weakened interaction between mutant TRAPPC10 and its putative adaptor protein TRAPPC2L. Studies of patient lymphoblastoid cells revealed an absence of TRAPPC10 alongside a concomitant absence of TRAPPC9, another key TRAPP II complex component associated with a clinically overlapping neurodevelopmental disorder. The TRAPPC9/10 reduction phenotype was recapitulated in TRAPPC10^-/- knockout cells, which also displayed a membrane trafficking defect. Notably, both the reduction in TRAPPC9 levels and the trafficking defect in these cells could be rescued by wild type but not mutant TRAPPC10 gene constructs. Moreover, studies of Trappc10^-/- knockout mice revealed neuroanatomical brain defects and microcephaly, paralleling findings seen in the human condition as well as in a Trappc9^-/- mouse model. Together these studies confirm TRAPPC10 gene mutation as a cause of human disease and define TRAPP-mediated pathomolecular outcomes of importance to TRAPPC9 and TRAPPC10 mediated neurodevelopmental disorders in humans and mice.

La maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) est la neuropathie périphérique héréditaire la plus fréquente résultante de lésions des nerfs moteurs et sensoriels. PMP22 a été le premier gène décrit comme étant impliqué dans la CMT via une variation structurelle (SV ; Structural Variation) de type duplication, expliquant environ 15% des cas globaux de CMT dans notre cohorte. À ce jour, plus de 90 gènes sont connus pour être impliqués dans la CMT, sur lesquels principalement des variants ponctuels (SNV ; Single Nucleotide Variants) et des courts insertions ou délétions ont été décrits, tandis que les SVs sont souvent sous-diagnostiqués. Dans notre étude, nous avons utilisé du NGS ciblé et l'outil bioinformatique CovCopCan pour analyser les données NGS de deux familles non apparentées présentant des symptômes de CMT associés à un syndrome pyramidal. Nous avons alors découvert deux grands SVs dans le gène KIF5A, un gène associé à des formes axonales de CMT (CMT2), dans lequel aucun SV n'a encore été décrit. Dans la première famille, le patient présentait une large délétion de 12 kb dans KIF5A incluant les exons 2-15. Dans la seconde famille, deux cas présentaient une large délétion de 3 kb dans KIF5A incluant les exons 24-28. De plus, l'analyse bioinformatique de la séquence de la région du point de cassure a révélé que le mécanisme de NAHR (Non-Allelic-Homologous-Recombination), similaire à celui impliqué dans la duplication du PMP22, pourrait être responsable de l'un de ces SVs de KIF5A et pourrait potentiellement être présent chez plusieurs autres patients. Cette étude établit un nouveau concept de mécanisme impliqué dans les maladies neurologiques, puisque de grandes délétions de KIF5A peuvent causer le CMT2. En outre, nous soulignons l'importance d'analyser non seulement les SNVs mais aussi les SVs lors du diagnostic des neuropathies, car elles pourraient être impliquées dans les neuropathies périphériques plus fréquemment que suspecté actuellement.

Nous rapportons le cas d’un patient et de sa sœur présentant tous deux une paraparésie spastique ayant débutée vers l’âge de deux ans avec une atteinte modérée des membres supérieurs sans autre signe associé.

La réalisation d’un exome, dans cette fratrie, issue de parents cousins germains, a mis en évidence un variant d’épissage à l’état homozygote, absent de gnomAD, dans le gène COQ9 : Chr16(GRCh37):g.57481490G > A, NM_020312.3(COQ9):c.73G > A, p.(Val25Met). Les logiciels de prédictions d’effet sur l’épissage montrent que ce variant situé sur la dernière base de l’exon 1 diminue la force du site donneur.

L’analyse des ARNm extraits de différents tissus (lignée lymphoblastoïde, myoblastes, fibroblastes et muscle) montre la présence du transcrit attendu ainsi que la présence de trois transcrits additionnels de taille supérieure à celle de l’amplicon attendu. Ces trois transcrits additionnels sont absents chez des contrôles. Le séquençage du transcrit additionnel majoritaire a montré la rétention de 113 pb de l’intron 1 de COQ9 conduisant à un frameshift. Ce transcrit illégitime représente entre 10 et 60% des transcrits totaux en fonction du tissu. C’est au niveau des lignées lymphoblastoïdes qu’il est le plus retrouvé (60% versus 8-9% du transcrit normal) ; dans les myoblastes et le muscle les rapports s’inversent avec 50 à 60% du transcrit attendu contre 10 à 20 % du transcrit contenant l’insertion de 113 pb. Les deux autres transcrits additionnels n’ont pas été séquencés; ils représentent 5 à 30% du total des transcrits en fonction du tissu.

Bien que sa fonction précise ne soit pas encore complètement élucidée, la protéine mitochondriale COQ9 est impliquée dans la biosynthèse du Coenzyme Q10 (CoQ10) et les variants pathogènes de COQ9 entraînent un déficit de la molécule. L’analyse des complexes de la chaîne respiratoire sur la biopsie musculaire du patient a retrouvé de façon cohérente un déficit partiel des complexes CoQ10-dépendants (complexes I+III et II+III), corrigé par l’ajout de CoQ10. Ces résultats ont été confirmés par la mise en évidence d’un déficit musculaire et plasmatique en CoQ10.

Sept patients ont été décrits dans la littérature, avec un phénotype beaucoup plus sévère que celui de nos deux patients. L’atteinte était caractérisée par une encéphalopathie néonatale associée à une atteinte cardiaque et/ou rénale, conduisant pour 6 à un décès dans les premiers mois ou premières années de vie.

Une supplémentation en Coenzyme Q10 a pu être proposée à cette famille. Nous n’avons que peu de recul pour décrire son effet ; mais aucune aggravation du phénotype n’est constatée.

Nous rapportons donc, un variant d’épissage homozygote du gène COQ9 conduisant à une paraparésie spastique isolée ; élargissant le spectre phénotypique des mutations dans ce gène. La moindre sévérité du phénotype de nos patients par rapport à ceux publiés pourrait s’expliquer par des taux résiduels en CoQ10 plus importants dans cette famille.

Les ciliopathies sont des maladies génétiques rares, très hétérogènes génétiquement et à spectre phénotypique très large et chevauchant. Elles résultent d’anomalies ciliaires, secondaires à des mutations de gènes codant des protéines centrosomales ou ciliaires. A l’inverse des cils motiles, le cil primaire (CP) est quasi ubiquitaire expliquant la pléiotropie des atteintes. En particulier, des malformations cérébrales sont fréquemment associées aux ciliopathies, de même que des troubles cognitifs ou comportementaux sans base neuro-anatomique, soulignant l'importance de la fonction ciliaire pour le développement et le fonctionnement du cerveau. Avec l'avènement du séquençage haut débit, les études génomiques ont largement accéléré notre compréhension des bases moléculaires des anomalies neuro-développementales. Cependant, les mécanismes sous-jacents sont restés largement inexplorés en raison de l'absence de modèles récapitulant les processus clés spécifiques au développement du cortex cérébral humain. La possibilité de reprogrammer des cellules somatiques de patients en cellules souches pluripotentes (IPS) capables de s'auto-organiser et de se différencier en ébauches d’organes ou organoïdes a révolutionné la modélisation des maladies humaines. 

Afin d'étudier les mécanismes physiopathologiques qui sous-tendent les anomalies cérébrales chez les patients atteints de ciliopathies, nous avons ainsi tiré profit des avancées technologiques en matière de cellules souches et généré des modèles du développement néocortical en 2D et 3D à partir de cellules IPS, i.e. rosettes neurales et organoïdes cérébraux. Ces deux systèmes de modélisation récapitulent de nombreux aspects du développement néocortical, notamment la génération des divers types de cellules progénitrices neurales ainsi que de neurones néocorticaux. Ces systèmes de modélisation nous permettent d'étudier la biogenèse et la fonction des CP. La transduction de la voie Sonic Hedgehog (SHH) est analysée par quantification de l’expression de gènes cibles de cette voie et par analyse immunochimique de la dynamique de localisation ciliaire des acteurs de la voie SHH. Afin de tirer parti de l'organisation 3D des organoïdes cérébraux, nous avons mis au point une méthode simple permettant d’imager les organoïdes cérébraux entiers après immunomarquage et permettant de détecter, à l’échelle de l’oragnoïde entier, à la fois les centrosomes et les CP des progéniteurs et neurones néocorticaux. 

L’utilisation de ces méthodes de modélisation à partir de cellules IPS humaines générées soit par reprogrammation de cellules de patients atteints de ciliopathies, soit par l'utilisation de la technologie CRISPR/CAS9 pour éditer spécifiquement les gènes ciliaires, devrait permettre des progrès significatifs dans la compréhension de la contribution du CP au cours du développement normal et pathologique du cortex cérébral.

Introduction :  Le syndrome de l’X Fragile (FXS), lié à une expansion de plus de 200 triplets CGG du gène FMR1, est la première cause de déficience intellectuelle (DI) héréditaire.  Les Sociétés Savantes de différents pays recommandent sa recherche en première intention avec l’aCGH chez tous les patients présentant un trouble neurodéveloppemental (TND)/DI/trouble du spectre autistique (TSA)/ trouble du déficit de l’attention (TDAH). Dans la littérature, le taux diagnostique de FXS a été évalué à 2,5% chez les patients avec DI et à 1,2% chez les patients avec TSA, ce qui est inférieur à l’aCGH (15-20%) et l’exome (30-40%). De ce fait, la dernière recommandation de l’American College of Medical Genetics soulève la question de la pertinence de la recherche de FXS en première intention.  Nous avons tenté d’évaluer ce point.

Méthodes : 1) Détermination du taux diagnostique de FXS, toute indication confondue, de 2014 à 2020 au sein du laboratoire de génétique moléculaire du CHU Necker. 2) Analyse des dossiers des patients FXS à la recherche de la mention de signes dysmorphiques évocateurs de FXS selon genereview et d’histoire familiale évocatrice (DI lié à l’X, FXS, FXTAS, FOIP). 3) Rétrophénotypage des photos des patients FXS disponibles selon les signes dysmorphiques de genereview. Utilisation et évaluation de l’application Face2Gene (FDNA Inc., Boston, USA) et de son logiciel de reconnaissance faciale DeepGestalt afin d’orienter la prescription.

Résultats : 1) 2324 tests ont été effectués sur 1620 hommes et 704 femmes. Un FXS a été diagnostiqué chez 23 (1,4%) hommes et 12 (1,7%) femmes. L’âge au diagnostic était compris entre 11 mois et 43 ans.  Pour 13/34 (38%) des patients positifs le test avait été prescrit dans un contexte familial de pathologies du spectre FMR1. 21/34 (62%) étaient des cas index présentant un TND/DI ou TSA. 2) 30/34 (88%) des patients avaient des signes dysmorphiques ou une histoire familiale mentionnés dans leur dossier médical. 3) Par rétrophénotypage, 15/16 patients présentaient ≥ 1 signe évocateur. Au total, des signes dysmorphiques évocateurs étaient retrouvés chez 33/34 patients.  L’application Face2Gene a classé le FXS en première position chez 12/16 patients.

Discussion : Le taux diagnostique de notre cohorte (1,5%) est concordant avec ceux de la littérature, ce qui reste bien inférieur à l’exome. Chez la grande majorité des patients (30/34) le FXS pouvait être évoqué devant la présence de signes dysmorphiques (l’application Face2Gene ne semble pas très discriminante chez les patients jeunes) et/ou une histoire familiale évocatrice d’où la justification d’une consultation de génétique avant prescription. La possibilité d’acquérir une présomption diagnostique forte chez les rares patients atteints de FXS semble justifier la relégation du test FXS en seconde intention   sous réserve d’une étude du rapport coût-bénéfice versus l’exome.

Le syndrome d’Ellis-Van Creveld (EVC) fait partie du groupe de ciliopathies squelettiques ou Côtes Courtes-Polydactylie (CCP), et est caractérisé par une dysplasie ectodermique, une chondrodysplasie, une polydactylie et une cardiopathie congénitale, avec une grande variabilité phénotypique allant de formes létales à des formes modérées. Les gènes EVC et EVC2 sont connus pour être les principaux gènes responsables du syndrome EVC. Cependant, un nombre croissant de gènes impliqués dans le fonctionnement du cil - WDR35, GLI1, DYNC2LI1, PRKACA, PRKACB, et SMO - ont été identifiés dans le syndrome EVC, permettant une meilleure compréhension de sa physiopathologie. Ces gènes codent tous pour des protéines du cil primaire, jouant un rôle clé dans la transduction du signal au sein des voies Hedgehog (Hh). L’objectif de cette étude était l’analyse de 50 patients, issus de 45 familles, diagnostiqués EVC, afin de mieux définir les bases phénotypiques et moléculaires du syndrome EVC. Nos critères d’inclusion pour le diagnostic clinique du syndrome EVC étaient la présence d’au moins trois critères parmi : 1) un aspect typique squelettique (brachydactylie, membres courts, thorax étroit) et/ou radiologique (os courts et tubulaires, côtes courtes, ailes iliaques courtes, acetabulum en trident), 2) une polydactylie, 3) la présence d’anomalies unguéales ou de la sphère orofaciale, 4) une cardiopathie congénitale. Notre taux de détection moléculaire au sein de la cohorte des 45 familles a été de 91,11%, avec des variants identifiés dans EVC/EVC2 (77.8%), DYNC2H1 (6.7%), DYNC2LI1 (2.2%), SMO (2.2%), et PRKACB (2.2%). Nous avons identifié une grande proportion de délétions (26.92%, 14/52) dans les gènes EVC et EVC2, dont deux délétions récurrentes retrouvées respectivement six et quatre fois dans le gène EVC. Ces CNVs étaient majoritairement hérités de la mère, et probablement médiés par un mécanisme de recombinaison homologue non allélique impliquant des séquences Alu. Sur le plan clinique, nous avons retrouvé de nombreuses anomalies supplémentaires, dont plusieurs sont décrites ici pour la première fois. La taille finale était rarement impactée dans notre cohorte, même au sein des patients mutés EVC/EVC2. Nous n’avons pas noté de corrélation génotype-phénotype significative, mais quelques éléments sont notables : taille normale chez les individus mutés dans DYNC2LI1, SMO et PRKACB ; et corrélation entre la présence d’une cardiopathie congénitale et le degré d’altération de la fonction protéique pour DYNC2LI1. Notre étude confirme qu’EVC et EVC2 sont les gènes majeurs avec une fréquence importante de CNV non décrite à ce jour.

Les surdités prélinguales ont une transmission liée à l’X dans 1 à 2% des cas et 50% des cas de surdité isolée liée à l'X sont causés par des mutations du gène POU3F4 impliqué dans la surdité héréditaire liée à l'X-2 (DFNX2). DFNX2 est une surdité de transmission et de perception associée à une malformation de l’oreille interne. Des études récentes ont montré une expression de POU3F4 durant le développement cérébral et dans le tube neural. Notre étude visait à constituer une cohorte française de patients présentant une DFNX2, d’établir leur génotype et leur phénotype précis, notamment sur le plan neurodéveloppemental. Notre second objectif était de rechercher une éventuelle corrélation génotype-phénotype.

Les patients ont été identifiés auprès des laboratoires de génétique faisant l’analyse du gène POU3F4. Les données cliniques ont été recueillies auprès des médecins responsables de chacun de ces patients par un questionnaire clinique.

Nous avons constitué une cohorte de 33 patients, âgés de 2 à 52 ans, issus de 25 familles différentes. En étudiant le génotype de ces patients, nous avons observé 5 grands réarrangements, 7 petites délétions intragéniques, 2 petites duplications intragéniques et 12 substitutions nucléotidiques. Nous avons mis en évidence 16 nouvelles mutations. En regardant le phénotype auditif, on voit que la surdité est d’apparition prélinguale chez 70% des patients. 23 patients ont une surdité de perception, 4 ont une surdité mixte et 1 a une surdité de transmission. Cette surdité est sévère ou profonde dès le diagnostic chez 20 patients et modérée chez 9 patients. Le TDM des rochers retrouvait une malformation de l’oreille interne chez 96% (25/26) des patients. Concernant le phénotype neurologique, on observe un trouble de l’équilibre chez 35% (8/23) des patients et des troubles du sommeil chez 40% (10/25) des patients. Concernant le neurodéveloppement 48% (12/25) des patients ont un retard à la marche. Sur 20 patients, 1 a un retard de développement psychomoteur à 3 ans et 9 mois et 6 patients ont une déficience intellectuelle. 43% (7/16) des patients ont un trouble du spectre de l’autisme (TSA) et 41% (9/22) ont déficit de l’attention avec ou sans hyperactivité (TDAH).

Depuis sa description en 1971 par Nance et al, DFNX2 est connue comme une surdité isolée de transmission liée à l’X. Notre étude montre que d’autres symptômes peuvent être associés à la surdité. Le retard à la marche et les troubles de l’équilibre s’expliquent par les malformations de l’oreille interne. Cependant, la déficience intellectuelle, le TSA et le TDAH semblent plus fréquents que dans la population générale. Cela pourrait s’expliquer par un rôle de POU3F4 dans le développement cérébral. Au vu de ces résultats, il semble intéressant de suivre le neurodéveloppement de ces patients. Cela permettra d’étendre nos connaissances sur le phénotype des patients atteints de DFNX2, d’améliorer leur prise en charge et de préciser le conseil génétique.

Les maladies rénales dépistées par l’échographie fœtale représentent un groupe hétérogène de pathologies dont certaines ont une cause monogénique. Elles se présentent principalement sous forme d’anomalies de développement des reins et des voies urinaires ou de gros reins hyperéchogènes parfois kystiques. Leur sévérité est extrêmement variable. Elles peuvent être isolées ou syndromiques. L’existence de formes familiales a fait suspecter une composante génétique, hypothèse validée par l’identification de variations pathogènes dans un très grand nombre de gènes. L’identification des variations causales dans les formes monogéniques de ces pathologies est essentielle pour le conseil génétique. L’objectif de cette étude était d’évaluer la fréquence des causes monogéniques au sein d’une cohorte de 100 fœtus présentant des anomalies rénales sévères. Cinq fœtus présentaient une atteinte compatible avec une dysgénésie rénale tubulaire, 79 des anomalies de développement des reins et des voies urinaires (CAKUT) et 16 une atteinte rénale évoquant une ciliopathie (gros reins hyperéchogènes et/ou kystiques). Une analyse moléculaire a été réalisée par une technique de séquençage moyen débit d’un panel de gènes mis en place dans le laboratoire de génétique de l’hôpital Necker-Enfants malades, le panel « Rénome ». Chez les fœtus présentant une atteinte évocatrice de dysgénésie rénale tubulaire, des variations bialléliques de classe 4 des gènes AGT et AGTR1 ont été identifiées chez deux fœtus, et des variations homozygotes de classe 3 des gènes AGT, ACE et AGTR1 chez les trois autres fœtus. Des variations pathogènes responsables du phénotype ont été mises en évidence chez 10 fœtus avec anomalies de développement des reins et des voies urinaires (dans les gènes PAX2, FRAS1, EYA1, MYOCD et BICC1), et des variations de classe 3 dans le gène GREB1L ont également été identifiées chez trois fœtus avec agénésie rénale bilatérale. Une nouvelle variation de splice dans le gène MYOCD, associé chez les fœtus de sexe masculin à une mégavessie congénitale, a été identifiée chez deux jumeaux grâce à une technique de séquençage haut débit de cDNA issus de rein fœtal. Un diagnostic moléculaire a pu être établi chez 75% des fœtus avec un phénotype évocateur de ciliopathie, avec l’identification de variations pathogènes dans 11 familles (gènes PKHD1, PKD1, PKD2, NPHP3, CEP290 et TMEM67). Ce travail a également permis de montrer qu’une variation bi-allélique du gène DNAJB11 était associée au syndrome d’Ivemark II (OMIM #208540), ciliopathie fœtale sévère associant dysplasie rénale, hépatique et pancréatique. Au total, une variation causale ou possiblement causale a été identifiée dans 30% des cas, avec un taux diagnostique variable en fonction du phénotype et bien plus faible pour les CAKUT que pour les ciliopathies ou les dysgénésies rénales tubulaires.

Etude monocentrique, par exome ciblé chez 112 enfants, de l'architecture génétique des DSD 46,XY. Huby Thomas*, Avril Tristan*, Lambert Anne-Sophie, Proust Alexis, Laddada Lilia, Lucie Tosca, Young Jacques, Guiochon-Mantel Anne, Linglart Agnès, Bouvattier Claire**, Bouligand Jérôme**.  *co-premiers auteurs, **co-derniers auteurs.

Contexte : Les DSD pour « Disorders of Sex Development » sont des pathologies regroupant un grand nombre de situations médicales congénitales où le développement du sexe chromosomique, gonadique ou anatomique est atypique. Ce développement est régulé par de nombreux gènes et la recherche étiologique par séquençage nouvelle génération (NGS) est devenue le standard pour le diagnostic moléculaire de ces maladies.

Objectifs : Étudier l’architecture génétique des DSD 46,XY et discuter de l’intérêt de l'exome ciblé par NGS pour certaines catégories de patients.

Patients : 112 patients avec DSD 46,XY ont été inclus dans notre étude monocentrique : 13 patients dans un groupe de DSD 46,XY syndromiques, 44 dans un groupe avec retard de croissance intra-utérin, 21 dans un groupe DSD 46,XY isolé avec dysgénésie gonadique (AMH < 250 pmol/l) et 34 dans un groupe DSD 46,XY isolé sans dysgénésie gonadique (AMH > 250 pmol/l).

Méthodes : Analyse par exome ciblé (EC) d’un panel de 39 gènes. Deux approches : Analyse supervisée (AS), interprétation des variants génétiques selon la classification ACMG 2015 ; Analyse non supervisée (ANS) de l’ensemble des données génotypiques de notre cohorte.

Résultats : Au cours de l'AS, des variants pathogènes ou probablement pathogènes (classe 4 ou 5) ont été identifiés chez 25 patients soit 22,3% (IC₉₅[14,6%-30%]), des variants de signification inconnue (classe 3) chez 42 patients soit 37,5% (IC₉₅[28,5%-46,5%] et des variants probablement bénins ou bénins (classe 2 ou 1) chez 45 patients soit 40,2% (IC₉₅[31,1%-49,3%]). Entre les 4 groupes, il n’a pas été retrouvé de différence significative du nombre de variants de classe 4 ou 5, de classe 3 et de classe 2 ou 1. L'AS confirme que NR5A1/SF1 est le gène principal responsable des DSD 46,XY avec dysgénésie gonadique. Parallèlement, l'ANS a permis d'identifier des variants de classe 3 qui sont candidats prioritaires pour une ré-interprétation ultérieure.

Conclusion/Perspectives : Après EC, plus de 75% des patients DSD 46,XY restent dans l’errance diagnostique. Dans ce contexte, la poursuite de ces analyses par séquençage complet de génome dans le cadre de la préindication France Médecine Génomique « Anomalies sévères de la différenciation sexuelle d’origine gonadique et hypothalamo-hypophysaire » constitue une véritable opportunité. 

Introduction

Smooth muscle cells (SMCs) capacity to switch between proliferative (synthetic) and quiescent (contractile) phenotypes is a widely studied mechanism in cardiovascular disease. Primary SMCs tend to lose many physiological features in culture, which makes the study of their contractile function challenging. Recently, an optimized protocol of induced pluripotent stem cells (iPSCs) differentiation into contractile SMCs was described. Here we aimed at defining the transcriptomic and open chromatin dynamics during the acquisition of SMCs phenotypes.

Methods

We differentiated 4 human iPSC lines (2 males, 2 females) towards either contractile (Repsox induced) or synthetic (PDGF-BB/TGF-β induced) SMC phenotypes using a 24-days protocol. We performed RNA-Seq and assay for transposase accessible chromatin (ATAC)-Seq at 6 time points of differentiation. We compared gene expression and open chromatin profiles between them and to existing datasets of primary human SMCs and artery tissues.

Results

iPSCs derived SMCs showed expected morphology and positive expression of SMC markers. Synthetic SMCs exhibited greater capacity of proliferation, migration and lower calcium release capacity, compared to contractile SMCs. RNA-Seq results showed that multiple disease-associated genes involved in the contractile function of arteries, including smooth-muscle myosin heavy chain (MYH11), myosin light chain kinase (MYLK) and angiotensin type 1 receptor (AGTR1) genes, were highly expressed in contractile compared to synthetic SMCs. Interestingly, multiple genes coding for extracellular matrix components were also enriched in contractile SMCs.  Analysis of transcriptomic and open chromatin profiles suggests contractile SMCs retained a high level of activity for transcription factors involved in vascular smooth muscle development. Synthetic SMCs however presented open chromatin profiles similar to cultured primary SMCs. Open chromatin regions of contractile SMCs were highly enriched in variants associated to vascular diseases such as hypertension, spontaneous coronary artery dissection and intracranial aneurysm , whereas synthetic SMCs were more enriched for variants associated to peripheral artery disease and aortic aneurysm.

Conclusions

Differentiation of SMCs from iPSC using two complementary protocols provides valid cellular models suitable for the study of a variety of vascular diseases. Utilization of these cells in combination with genome-editing tools is a promising approach to the study of complex regulatory mechanisms at genetic risk loci while taking into account phenotypic variability of arterial cellular components.

Introduction

La maladie de Menkes (MNK), maladie récessive liée à l’X (ATP7A), résulte d’un défaut de transport du cuivre, est une maladie multi-organes (atteintes neurologiques, cutanées, urologiques, vasculaires, osseuses) et conduit historiquement au décès avant 3 ans. L’histidinate de cuivre (HisCu) est le seul traitement spécifique proposé, avec des résultats variables en fonction des études. L’objectif était d’étudier les caractéristiques cliniques et génétiques d’une cohorte française pour discuter de la prise en charge thérapeutique.

Méthodes

Une cohorte a été constituée à partir des diagnostics génétiques (gène ATP7A) de MNK en France et comparée à une analyse systématique de la littérature.

Résultats

Un variant pathogène causal a été identifié dans 81% des 88 dossiers analysés. 94% des variants sont privés dont la moitié non-décrite dans les bases de données. 24,6% sont des délétions/duplications intragéniques, 50,8% des variants de type perte de fonction et 24,6% des variants faux-sens. Ces derniers se répartissent exclusivement à partir de l’exon 7, avec pour conséquence d’un certain nombre une anomalie d’épissage avec délétion partielle d’exon.

Sur les 24 individus dont les données cliniques ont pu être étudiées, l’âge moyen au diagnostic est de 4,5 mois (78% entre 3 et 6 mois). Les signes au diagnostic sont : l’hypotonie (96% ; un seul patient non hypotonique diagnostiqué en période néonatale sur antécédents familiaux), l’épilepsie (88% ; souvent le point d’appel à la démarche diagnostique), les anomalies des phanères (83% de pili torti, 44% de pâleur cutanée). Une hypothermie néonatale (35%) et des céphalhématomes (27%), bien que non spécifiques, sont sur-représentés.

55% des individus ont été mis sous HisCu, à un âge moyen de 5,1±2,78 mois. On ne met pas en évidence de différence de survie entre le groupe traité par HisCu et le groupe non traité ni de corrélation génotype-phénotype distinguant les individus ayant le mieux répondu. En comparant ces données à celles issues de la littérature, on ne retrouve une efficacité de l’HisCU sur le plan de la survie et du neurodéveloppement que lorsque le traitement est mis en place chez des nourrissons n’ayant pas encore d’atteinte neurologique soit avant 1 mois de vie. 

L’épilepsie apparait chez tous les individus de la cohorte même quand l’HisCu a été instauré avant les premiers symptômes, bien que, dans la littérature, est décrit une efficacité de l’HisCu sur la fréquence des crises.

L’HisCU pourrait aussi permettre de mieux contrôler l'atteinte urologique mais ne paraît pas avoir d'impact sur les phénotypes vasculaires et osseux.

Conclusion

La MNK reste une maladie non curable avec un éventail thérapeutique limité et un pronostic sombre. L’introduction de l’HisCu ne devrait être basée que sur des critères cliniques et amènent à ne la proposer que chez des patients présymptomatiques. Dans ce cadre, il permettrait d’avoir un effet sur la survie et le développement psychomoteur de certains patients.

Actuellement, plus de 250 variants pathogènes ont été identifiés sur le génome mitochondrial (ADNmt), avec un large spectre clinique, notamment en raison du phénomène d'hétéroplasmie. De plus, le séquençage de nouvelle génération a considérablement augmenté l'identification de nouveaux variants de signification inconnue (VSI), augmentant la complexité de l'interprétation de l'ADNmt.

L'objectif de notre étude était de comparer l'hétéroplasmie des variants de l'ADNmt dans le sang et l'urine afin d'améliorer les corrélations génotype-phénotype et prioriser les VSI. Les taux d'hétéroplasmie ont été quantifiés pour 179 variants chez 174 patients, sur des échantillons d'urine et de sang.

Comme précédemment rapporté, la corrélation génotype-phénotype est apparue plus significative dans l'urine que dans le sang pour les patients porteurs du m.3243A > G. Des résultats similaires ont été obtenus pour d'autres variants pathogènes de l'ADNmt, accréditant l'utilité de l'urine pour le diagnostic des maladies mitochondriales. Cependant, la correction de l'hétéroplasmie, en tenant compte de l'âge ou du sexe, n'a pas amélioré ces corrélations.

En raison de la variabilité de la distribution tissulaire des variants hétéroplasmiques de l'ADNmt, l'analyse multivariée a permis de distinguer les polymorphismes des variants pathogènes et de discriminer les porteurs asymptomatiques des patients symptomatiques, suggérant l'intérêt de cette comparaison pour la priorisation des VSI. Cette approche a été appliquée à 10 VSI, dont 9 nouveaux variants, et permet de classer 6 d'entre eux : Cinq comme probablement pathogènes (m.5668G > A, m.7778T > C, m.8186G > A, m.10161A > C, m.15243G > A) et un comme polymorphisme (m.8809A > G). Pour 4 variants (m.5770C > G, m.8816A > C, m.8980C > T, m.13679C > T) cette approche n'a pas permis de conclure.

Notre étude confirme l'utilité des cellules uroépithéliales pour le diagnostic mitochondrial, permettant de meilleures corrélations génotype-phénotype et facilitant la priorisation des nouveaux variants.

Muscle contraction is triggered by a massive release of Ca2+ within myofibers in response to nerve excitation. This process, known as excitation contraction coupling (ECC), relies on the interaction of two Ca2+ channels, the dihydropyridine receptor (DHPR) and the type I ryanodine receptor (RYR1). The DHPR is a voltage-gated L-type Ca2+ channel composed of four subunits (α1, α2δ, β, and γ). The α1S subunit of DHPR forms the pore domain which is essential for proper functioning of ECC in skeletal muscle. Variants in the CACNA1S gene, encoding the α1S subunit, have been recently identified in patients with congenital myopathies. We identified compound heterozygosity for nonsense variants of the CACNA1S gene in two unrelated patients presenting with muscle weakness. Here, we characterized the impact of these two CACNA1S truncating variants on transcript and protein expressions in one of them. Whole RNA-sequencing, completed by functional studies, revealed the unexpected consequences of these variants. Our findings could open up new perspectives in the understanding of pathophysiological mechanisms associated with CACNA1S-related diseases.

Le syndrome de Townes-Brocks (TBS) est une pathologie génétique autosomique dominante, à pénétrance complète et expressivité variable, liée à des mutations du gèneSal-like 1 (SALL1). Il comprend classiquement une triade clinique : imperforation anale, oreilles dysplasiques (tubercules, fistules, anomalies des hélix) et malformations des pouces (triphalangés, polydactylie pré-axiale), pouvant être associée à d’autres atteintes notamment auditives. Plus de 150 cas ont été rapportés dans la littérature permettant une bonne description du phénotype malformatif associé au TBS. La surdité y est décrite comme fréquente (65%), le plus souvent neurosensorielle et de sévérité variable. Cependant, l’âge d’apparition, le profil évolutif ou la présence de malformations de l’oreille interne sont rarement précisés. Or ces éléments peuvent permettre d’ajuster le suivi et la prise en charge précoce de ces patients.

L’étude du gène SALL1 est réalisée au CHU de Lille depuis 2006. L’objectif de notre étude est de préciser le phénotype, notamment auditif, des patients présentant un TBS confirmé sur le plan moléculaire. Nous disposons d’une cohorte de 42 patients issus de 25 familles. D'après les données présentes au laboratoire, qui sont parcellaires, 15/42 patients (36%) présentaient une surdité au moment du diagnostic. Elle était congénitale (1/4) ou apparue dans l’enfance (3/4), le plus souvent neurosensorielle (6/8), bilatérale (5/6) et légère (3/5). L’imagerie des rochers montrait des malformations des osselets chez un patient sourd et un patient sans donnée quant à son audition (2/3). 14/15 patients sourds avaient des malformations des oreilles externes comparativement à 18/27 patients normo-entendants a priori, ce qui en faisaient le signe clinique le plus fréquent dans notre cohorte.

Par ailleurs, 20/42 présentaient une malformation des membres supérieurs avec une majorité de patients ayant une polydactylie pré-axiale ou un pouce triphalangé et 17/42 présentaient une imperforation anale. Enfin, 18/42 patients présentaient une anomalie réno-urinaire, ayant évolué vers une insuffisance rénale chronique pour 10 d’entre eux.

25 variations pathogènes ou probablement pathogènes de SALL1 ont été identifiées : 8 non-sens, 16 frameshift et 1 large délétion emportant tout le gène. A notre connaissance, 7 étaient survenues de novo et 9 étaient héritées. Il n’y a pas de corrélation génotype-phénotype évidente dans cette cohorte, tout comme dans la littérature.

Les données dont nous disposons ayant été recueillies au moment de la prescription de l’analyse moléculaire, la surdité a pu apparaître secondairement chez certains patients. Ces résultats préliminaires vont donc être précisés en recontactant les cliniciens référents des patients, afin de connaître leur évolution et compléter les données manquantes. Nous suggérons d’étendre cette étude aux patients ayant bénéficié de l’analyse du gène SALL1 dans un autre laboratoire, dans le cadre d’un appel à collaboration.

Le gène MYRF code pour un facteur de transcription qui agit comme facteur de régulation de la myéline et qui est fortement exprimé dans le diaphragme, les poumons, le cœur en développement ainsi que dans les tissus oculaires. L'haploinsuffisance de MYRF est impliquée dans le syndrome cardio-urogénital (MIM 618280). Les caractéristiques communes de ce syndrome rare, décrit chez 16 patients dans la littérature (dont 1 cas en prénatal), sont une hernie de coupole diaphragmatique, une cardiopathie congénitale et des anomalies génito-urinaires. Des cas d’encéphalopathie aigüe transitoire avec lésion réversible du splénium du corps calleux (MERS) ainsi que des cas de nanophtalmie ont également été décrits associés aux variations du gène MYRF.

Après avoir fait dans notre service le diagnostic moléculaire de syndrome cardio-urogénital chez un fœtus, nous avons collaboré avec d'autres centres pour constituer une cohorte prénatale internationale de cas similaires. Nous rapportons ici les données échographiques, radiologiques, histologiques, pathologiques et moléculaires de six nouveaux fœtus non apparentés porteurs d'une variation délétère du gène MYRF. Tous présentent une association syndromique polymalformative similaire dont les signes cardinaux sont une hernie de coupole diaphragmatique, des anomalies cardiaques congénitales, une hypoplasie pulmonaire et des anomalies génito-urinaires. Le séquençage de l'exome ou du génome a permis d'identifier chez chacun un variant hétérozygote pathogène ou probablement pathogène de MYRF. 

A ce jour, les caractéristiques cliniques récurrentes chez les enfants présentant des variants délétères du gène MYRF ont déjà été décrites mais le phénotype fœtal reste encore à définir pour en permettre le diagnostic prénatal. Ce travail confirme également l'intérêt du séquençage de l'exome en prénatal en cas de hernie de coupole diaphragmatique syndromique.

Le gène MSH3 appartient au système de réparation des mésappariements de l’ADN. Sa déficience entraîne l’instabilité de certains microsatellites de type tétranucléotides, mais aucun variant du gène MSH3 n’a jamais été mis en cause dans le syndrome de Lynch. Cependant, son implication dans les prédispositions héréditaires au cancer est suspectée depuis 2016, puisqu’Adam et al. ont rapporté quatre patients porteurs de variants constitutionnels bialléliques dans MSH3 appartenant à deux familles différentes. Ces patients présentaient, à l’âge adulte, une polypose adénomateuse colorectale atténuée ainsi que différentes tumeurs extra-digestives. Leurs tumeurs présentaient un phénotype appelé « EMAST » (pour « elevated microsatellite alteration at selected tetranucleotide repeats »), caractéristique de la déficience de MSH3. Depuis cette publication, aucun nouveau patient MSH3 n’a été rapporté.

Nous rapportons quatre nouveaux patients non apparentés porteurs de variants constitutionnels bialléliques dans MSH3, sans variant pathogène retrouvé dans les autres gènes connus de prédisposition. Nous avons recueilli leurs antécédents personnels et familiaux et étudié les caractéristiques moléculaires de divers prélèvements de tissu sain et de tissu tumoral, dont le phénotype EMAST (panel de 8 microsatellites développé dans le laboratoire de génétique de l’Institut Curie).

Les patients, deux hommes et deux femmes, présentent tous une polypose adénomateuse colorectale atténuée. Deux d’entre eux ont eu un cancer colorectal et deux une polypose duodénale. Un des deux hommes a également développé un cancer pulmonaire à 58 ans et les deux femmes un cancer du sein à 46 et 63 ans. Aucun patient n’a d’antécédents familiaux de cancer digestif. Trois patients sont homozygotes pour des variants pathogènes jamais rapportés dans MSH3 (deux de ces patients présentent le même variant). Le dernier patient est hétérozygote composite pour un variant pathogène et un variant de signification inconnue. Le phénotype EMAST a été retrouvé à des degrés différents (instabilité d’un nombre variable de microsatellites parmi les 8 testés) dans tous les prélèvements testés exceptés dans les leucocytes, avec un gradient dans les polypes dépendant de leur degré de dysplasie.

La déficience constitutionnelle de MSH3 est donc responsable d’une polypose adénomateuse colorectale survenant à l’âge adulte contrairement à celle observée dans la déficience constitutionnelle des autres gènes MMR. Ces résultats plaident pour l’ajout de MSH3 aux panels de gènes utilisés dans le cadre des prédispositions aux cancers digestifs. L’identification de nouvelles familles pourrait permettre de préciser le spectre tumoral et le risque de cancer chez les porteurs de variants dans MSH3 à l’état mono et biallélique. La caractérisation du phénotype EMAST dans les tumeurs extra-digestives de ces patients peut également aider à définir le spectre tumoral, ainsi qu’à interpréter la pathogénicité des variants.

L’implémentation du séquençage de nouvelle génération (NGS) dans les laboratoires de diagnostic moléculaire a permis la recherche simultanée des altérations dans plusieurs gènes, augmentant notre rendement diagnostique dans le cadre du cancer de l’ovaire familial. L’identification de variants de signification inconnue (VSI) dans les gènes associés aux formes familiales de cancer de l’ovaire, BRCA1, BRCA2, BRIP1, PALB2, RAD51C et RAD51D (GACO), ainsi que dans les gènes hors spectre des panels de routine, est en augmentation constante (entre 15% et 40%). Le véritable défi consiste aujourd’hui en l’interprétation de ces VSI afin d’optimiser le conseil génétique et la prise en charge diagnostique et thérapeutique pour ces patientes. Par ailleurs, la moitié des tumeurs de l’ovaire présenteraient un déficit dans la voie de réparation par recombinaison homologue (HRD), dont environ 20% seraient secondaires à des pertes bialléliques dans les gènes BRCA1/2 d’origine constitutionnelle ou somatique. Dans ce contexte, la connaissance du statut HRD ainsi que la recherche d’une rétention allélique par perte d’hétérozygotie (LOH) tumorale pourraient nous apporter un poids supplémentaire pour l’interprétation des VSI. Le but de notre étude était de rechercher des arguments en faveur ou non de la pathogénicité des VSI à l’aide du séquençage constitutionnel et tumoral. Nous avons analysé de manière rétrospective 158 patientes atteintes de cancer de l’ovaire séreux de haut grade en combinant l’étude du statut HRD (MyChoice® - Myriad Genetics), et l’évaluation du statut d’hétérozygotie dans les GACO par comparaison des statuts génétiques constitutionnel et tumoral. Nous avons retrouvé 18 variants tumoraux de classe 4 et 5 dans les GACO ainsi que dans les gènes ARID1A, ATM, et CDK12. Un total de 22 VSI tumoraux a été identifié dans les GACO ainsi que dans les gènes ATM et MSH6. Environ 30% des tumeurs étaient porteuses d’une signature HRD. Parmi ces 22 variants, seuls 19 ont pu faire l’objet d’une interprétation de comparaison entre statut HRD et LOH. Un total de 5 variants VSI avec LOH ont été identifiées dans des tumeurs HRD-positives dans les gènes BRCA1, BRCA2 et BRIP1, sans différence observée avec les scores HRD des variants tronquants pathogènes connus (t-test, p = 0,43). A l’inverse, nous avons identifié 8 VSI sans LOH et dans des tumeurs HRD-négatives. Enfin, 6 VSI présentaient une discordance entre le statut LOH et la signature HRD. En accord avec les précédentes études, les variants associés à une LOH étaient significativement associés à un score HRD positif (t-test, p ≤ 0,001). Malgré notre cohorte de faible effectif, et la nécessité de tests fonctionnels afin de statuer définitivement sur la pathogénicité de ces VSI nous avons été en mesure d’identifier des VSI au caractère pathogène probable. Actuellement non reconnue par les critères ACMG, la combinaison de la LOH et du statut HRD pourrait devenir un critère d’interprétation phénotypique modéré (PP4).

Introduction : Les mutations constitutionnelles du gène MET sont impliquées dans la prédisposition aux carcinomes papillaires du rein de type I (KP1). Il s’agit de mutations activatrices de type faux-sens du domaine tyrosine kinase. A ce jour, dix mutations ont été rapportées dans la littérature.

Méthodes : Notre cohorte a porté sur 153 cas index présentant un carcinome papillaire du rein de type I. Une étude génétique à la recherche des mutations constitutionnelles du gène MET (NM_001127500.2) a été réalisée par les méthodes dHPLC ou qPCR-HRM et séquençage Sanger des exons 2 à 21 (98 cas) ou par séquençage de nouvelle génération (55 cas – XT HS Agilent). Tous les variants détectés ont été confirmés par séquençage Sanger ou par MLPA. Une étude fonctionnelle a été réalisée pour les nouveaux variants faux-sens identifiés du domaine tyrosine kinase. Nous avons étudié le taux de phosphorylation de ERK et la capacité de formation de clones après transfection sur des fibroblastes NIH3T3. Trois tumeurs de patients présentant un nouveau variant faux-sens du gène MET ont été relues par un anatomopathologiste expert à la recherche du variant alvéolaire squamoïde biphasique. Les grands réarrangements ont été caractérisés par cartographie optique par le système Bionano (BioNano Genomic, San Diego USA).

Résultats : Nous avons identifié sept variants faux-sens du domaine tyrosine kinase du gène MET chez 19 cas index dont trois variants classés comme pathogènes dans la littérature : MET p.H1112R (5 cas); MET p.V1238I (4 cas); MET p.Y1248C (3 cas). Les nouveaux variants MET p.L1130S (4 cas), MET p.C1125G (1 cas) et MET p.I1102T (1 cas) étaient associés à un KP1 bilatéral (6/6) et multifocal (5/6). Nous ne disposions pas de données concernant la tumeur du patient porteur du quatrième nouveau variant MET p.H1086L. Le variant anatomopathologique alvéolaire squamoïde biphasique a été retrouvé sur trois tumeurs porteuses du variant MET p.L1130S. Ces tumeurs présentaient également une triplication du chromosome 7. L’étude fonctionnelle a conclue au caractère pathogène des quatre nouveaux variants du domaine tyrosine kinase MET p.L1130S;p.C1125G;p.I1102T et p.H1086L. Une duplication des exons 6 à 21 et incluant le domaine tyrosine kinase du gène MET a été identifiée chez trois cas index de la cohorte. Sa caractérisation par cartographie optique par le système Bionano a montré qu’elle se situait en aval de la région 3’ du gène à plus de 70kb laissant supposer qu’elle serait probablement neutre. Cette duplication a été retrouvée chez au moins 25 cas non associés sur plus de 10000 analyses avec un syndrome de prédisposition aux cancers.

Conclusion : Il s’agit de la première étude Française réalisée sur une large cohorte incluant 153 cas index et décrivant les mutations constitutionnelles du gène MET dans le carcinome papillaire du rein de type I. Nous avons pu identifier quatre nouveaux variants pathogènes en s’appuyant sur des arguments cliniques, tumoraux et fonctionnels. 

Le syndrome de Peutz-Jeghers (PJS) (MIM 175200) est une maladie héréditaire causée par des variants hétérozygotes perte-de-fonction du gène STK11. Les délétions de tout ou partie de STK11 sont responsables d’un tiers des cas de PJS. Seuls 22 cas de délétions constitutionnelles ont été décrits dans la littérature. Les 3 principaux mécanismes impliqués sont le non-allelic homologous recombination (NAHR) médié par la présence de séquences Alu (10 cas), le non-homologous end joining (NHEJ) (8 cas) et la micro-homologie de séquence (4 cas).

L’objectif de ce travail a été de caractériser les mécanismes mutationnels par l’identification des points de cassure des délétions de STK11 d’une cohorte de 25 patients. Trois délétions étaient récurrentes : délétion de l’exon 1 (9 cas), délétion complète du gène (7 cas), délétion des exons 2-3 (3 cas). Pour déterminer les points de cassure des délétions de l’exon 1, nous avons réalisé un séquençage long read (Oxford Nanopore Technologies) avec enrichissement dans la région d’intérêt (ROI) : (1) par informatique par échantillonnage adaptatif en temps réel ; (2) par CRISPR/Cas9. Dans le premier cas, les molécules d’ADN étaient éjectées du pore si la séquence déterminée en temps réel ne correspondait pas à la ROI. Dans le second cas, l’intron 1 de STK11a été coupé en 3 sites par CRISPR/Cas9 et les fragments générés à partir des points de coupure ont été séquencés.

Nous avons pu identifier les points de cassure d’une délétion de l’exon 1 de STK11. Les autres délétions sont en cours de séquençage. Cette délétion résultait d’un NAHR : les points de cassure se situaient dans des séquences AluSx en amont du gène (GRCh37(hg19) chr19:1182917-1183237) et AluSp de l’intron 1 (chr19:1211014-1211309).

Les enrichissements en temps réel et CRISPR/Cas9 ont permis d’obtenir des profondeurs respectives de 18X et 42X au point de cassure intronique avec 39% et 45% de lectures du fragment de jonction de la délétion.

Nous avons mis à profit la capacité de l’enrichissement à augmenter la profondeur de séquençage des ROI pour déterminer les mécanismes mutationnels de délétions du gène STK11. L’enrichissement par CRISPR/Cas9 permet d’obtenir une profondeur décroissante de la ROI à partir du site de coupure mais nécessite de cibler une région précise connue comme non délétée ou des analyses quantitatives préliminaires. L’enrichissement en temps réel aboutit à une profondeur plus faible mais relativement homogène de la ROI permettant une analyse sans a priori.

Nous avons montré que le NAHR médié par la présence de séquences Alu est à l’origine de la délétion étudiée mais également des délétions des exons 2-3 que nous avons caractérisées par PCR long range. Les points de cassure se situaient au sein de séquences AluY de l’intron 1 (chr19:1212990-1213294) et AluY de l’intron 3 (chr19:1219530-1219843). Ce mécanisme pourrait expliquer la récurrence de ces délétions et la forte proportion de cas de novo parmi les patients délétés (16 cas sur 25).

Le gène BRCA2, impliqué dans la prédisposition au cancer du sein et de l'ovaire, a un très large spectre mutationnel, avec un nombre particulièrement important de variations de signification inconnue (VSI). Parce qu’il s’agit d’un gène cliniquement actionnable, BRCA2 est devenu un emblème du défi actuel d’interprétation des VSI identifiées en Génétique Médicale, et une priorité pour le développement de tests fonctionnels visant aider la classification de ce type de variations. Parmi toutes les VSI de BRCA2, celles qui provoquent des défauts d'épissage partiels sont spécialement difficiles à interpréter car le niveau minimal de transcrits pleine-longueur (PL) requis pour une fonction normale reste à établir.  

Ici, nous avons exploré l'exon 3 de BRCA2 (BRCA2e3) pour dépister des variations splicéogéniques avec des effets partiels et effectuer la première estimation des seuils d'haplo-insuffisance de BRCA2, spécifiquement au niveau de l’ARN. Cet exon a été choisi comme modèle parce qu’il est essentiel pour le rôle suppresseur de tumeurs de BRCA2.  Afin de s’affranchir d’effets combinés « ARN-protéine » potentiellement induits par les VSI, nous avons exclusivement étudié des variations introniques ou synonymes. Nos approches ont compris : (i) des analyses in silico (prédictions sur des altérations des sites d’épissage et/ou d’éléments régulateurs d’épissage), (ii) des tests indicateurs d’anomalies d'épissage basés sur l’utilisation de minigènes, (iii) des analyses de l'ARN de patients porteurs hétérozygotes des variations d’intérêt, (iv) des essais de complémentation basés sur l’utilisation de cellules souches embryonnaires de souris (mESCs),  (v) l’étude de données cliniques et génétiques relatives aux patients et leurs familles, et (vi) l’analyse de la fréquence des variations dans la population générale.

Parmi les 100 variations de BRCA2e3 analysées dans le test-minigène, 64 se sont révélés être splicéogeniques, provoquant des sauts d’exon plus au moins prononcés selon la variation. Les défauts d'épissage identifiés dans ce test ont été confirmés par analyse de l'ARN de patients lorsque de tels échantillons étaient disponibles, ainsi que dans des mESCs porteuses des variations d’intérêt. De façon importante, l'analyse de la VSI c.231T > G a montré qu'une perte de ~40% des transcrits BRCA2 PL exprimés par l’allèle mutant n'entraîne aucune augmentation du risque de cancer chez les individus porteurs de cette variation, ce qui à permis de la classer comme non-pathogène et d’établir un seuil minimal d’expression de BRCA2 PL. De plus, les variations provoquant une perte de ~70% PL pourraient aussi être non-pathogènes étant donné que, dans ces conditions, les mESCs restent viables et résistantes aux agents endommageant l'ADN. En revanche, les mESCs produisant des quantités plus faibles de BRCA2 PL présentent des phénotypes nuls ou hypomorphes. Nos résultats ont des implications pour l'interprétation de toute variation diminuant l’expression de BRCA2 PL

Le sarcome histiocytaire (SH) est un cancer rare mais extrêmement agressif. Du fait de sa rareté et de son hétérogénéité, il n’existe pas de consensus pour sa prise en charge ni de facteurs pronostiques. Chez le chien, certaines races sont fortement prédisposées à ce cancer, partageant de nombreuses similitudes cliniques et histologiques avec le SH humain. Notre objectif est d’identifier les bases génétiques, prédisposantes et somatiques de ce cancer agressif grâce au modèle spontané unique qu’est le chien.

Afin d’identifier les facteurs prédisposants, nous avons réalisé des études d’association pan-génome (GWAS) sur 800 chiens appartenant à 4 races prédisposées. Nous avons confirmé le rôle majeur du locus de CDKN2A et identifié de nouveaux loci sur les chromosomes canins 2, 5, 12, 14, 20, 26 et X. Le séquençage NGS de ces régions a permis d’identifier des variants suspectés régulateurs (ilots de méthylation). L’effet additif de ces variants entraine une forte prédisposition au SH (Odd Ratio  5.4 [4.04-7.24]) mais aussi à d’autre cancers hématopoïétiques ( lymphome ou mastocytome ) (Hédan et al., 2021).

Sur le plan des altérations somatiques, à partir de 3 cas de SH chez le Bouvier bernois, nous avons identifié des altérations récurrentes de TP53 et de PTPN11. La validation de ces altérations sur 111 cas de SH a permis d ‘identifier des altérations dans la voie des MAPKinases dans 64% des cas de SH avec des mutations exclusives de PTPN11 (56.75%), KRAS (7.2%) et BRAF (0.9%). Ces mutations sont retrouvées aux mêmes hotposts que dans les cancers humains, reflétant la forte conservation de ces voies oncogéniques. Grace aux présentations cliniques spécifiques observées dans les races canines prédisposées et à l’analyse de 19 cas de SH humain, nous avons montré que les mutations de PTPN11 sont, chez l’homme et  le chien, associées à un sous-type de SH viscéral et disséminé de plus mauvais pronostic (Rault et al., 2020). Très récemment, nous avons réalisé le séquençage des exomes de 39 tumeurs, représentatives de 3 races canines fortement prédisposées et de différentes présentations cliniques.  Les premiers résultats confirment l’implication majeure de la voie MAPKinase et révèle d’autres altérations récurrentes pertinentes

De plus, en testant des drogues ciblant la voie des MAPKinase sur 8 lignées canines de SH, nous avons démontré que les inhibiteurs de MEK avaient une meilleure inhibition de la prolifération cellulaire que les inhibiteurs ciblant en amont, PTPN11.

Ces résultats illustrent l’intérêt du modèle canin pour comprendre les bases génétiques de cancers rares chez l’homme, mais fréquent dans certaines races canines prédisposées.  L’identification de sous-types moléculaires et de cibles thérapeutiques partagés entre l’homme et le chien permettra de sélectionner et de tester de nouvelles thérapies avec un bénéfice pour la médecine humaine et vétérinaire.

Introduction : Le séquençage pangénomique joue un rôle de plus en plus important dans la caractérisation des cancers et dans le choix de la thérapeutique antitumorale. En parallèle cette technologie permet aussi de détecter les variants responsables d’effets iatrogènes en relation avec la chimiothérapie, les antiémétiques ou les antalgiques, fréquemment prescrits aux patients atteints de cancer. 

Matériels et Méthodes : Nous avons évalué l’intérêt pharmacogénétique de cette approche en détectant les variants d’intérêts au sein d’une cohorte de 445 patients porteurs d’au moins une tumeur solide et ayant bénéficié d’un séquençage d’exome. Nous avons appliqué un pipeline dédié pour extraire 67 variants contenus dans 8 gènes. Après consultation des dossiers d’hospitalisation, nous avons retenu 2 gènes avec des variations d’intérêts, le gène DPYD (dihydropyrimidine déshydrogénase) et le gène CYP2D6. Pour le gène CYP2D6 nous avons prédit le statut métaboliseur pour chaque patient. Nous avons ensuite rétrospectivement analysé les concentrations plasmatiques et les effets indésirables en lien avec les variants identifiés. 

Résultats : Quatre paires allèles-molécules furent analysées : DPYD/5FU, CYP2D6/Opioïdes, CYP2D6/Tamoxifène et CYP2D6/Ondansétron. Six patients avec au moins un variant sur le gène DPYD montrent une clairance en 5FU diminuée par rapport aux non-porteurs (p=0.01). L’ensemble des patients (n=5) avec un statut métaboliseur lent ou métaboliseur ultra-rapide vis-à-vis du CYP2D6 ont montré un effet indésirable en lien avec leur statut métaboliseur (p=0.02 et p < 0.01). L’analyse de la proportion de métaboliseur lent ayant reçu du tamoxifène et ayant rechuté, n’a pas montré de différence significative avec la population générale. 

Conclusion : Nous avons montré que le séquençage pangénomique peut fournir des informations pharmacogénétiques supplémentaires pour les patients porteurs d’une tumeur solide. Cette information peut être utile dans les choix thérapeutiques auquel sont confrontés les prescripteurs, notamment par la transmission des variants du gène DPYD et du statut métaboliseur du CYP2D6.

Introduction

Actuellement, la technique de première intention pour la détection de Copy Number Variation (CNV) est l’ACPA (analyse chromosomique par puce à ADN). Cette technique a une résolution d’environ de 200kb et a un rendement diagnostique limité (~10% dans la déficience intellectuelle). En conséquence, pour bon nombre de ces patients, la réalisation d’explorations complémentaires est nécessaire, notamment l’analyse des Single Nucleotide Variation (SNV) et indels sur Panel ou Exome. Pourtant, avec un pipeline bioinformatique adéquat, il est possible de réaliser l’identification des CNV à partir des données de séquençage d’exome. Le but de ce travail est d’évaluer si cette approche peut permettre de remplacer l’ACPA, et de quantifier le rendement diagnostique additionnel.

Matériel et Méthode

L’ADN de plus de 2000 patients, adressés majoritairement pour déficience intellectuelle ou maladie rénale, a été séquencé sur la Plateforme de séquençage d’Exome Eurofins-Biomnis (Kit Twist Biosciences / Séquençage NextSeq500 Illumina). Nous avons développé un pipeline bioinformatique pour la détection des CNV basé sur le module gCNV de l’outil GATK4.

Afin de valider cette méthode de détection des CNV, nous avons comparé les données issues de ce pipeline aux résultats d’études génétiques préalables permettant la détection de CNV (majoritairement ACPA, mais aussi caryotype, MLPA et CNV sur panel).

Résultats

Pour 616 patients ayant bénéficié d’une technique orthogonale de détection de CNV, nous obtenons avec la méthode proposée, après exclusion de 25 échantillons en échec pour le CNV-Exome, 100% de concordance : 528 sans anomalies, détection de 63 anomalies d’intérêt clinique (variants de signification inconnue ou pathogènes : délétion ou duplication allant de 725pb à 156Mb).

De plus, dans la cohorte de 2000 patients, cette méthodologie a permis l’identification de 31 autres CNV responsables de la pathologie du patient (ACPA non réalisé en première intention ou non assez résolutive), allant de 700pb (1 exon de CLDN16) à 80Mb (chromosome 18). Plus précisément, nous avons mis en évidence :

- 20 CNV de taille supérieure à 50kb

- 10 CNV de taille inférieure à 50 kb, classiquement inaccessible aux techniques d’ACPA.

- 1 CNV, associé à un SNV dans un gène entrainant une pathologie de transmission récessive.

Conclusion/Discussion

De plus en plus de patients ont bénéficié ou bénéficieront d’un séquençage d’exome. Pourtant, les CNV ne sont pas toujours recherchés sur cette base, malgré leur implication en génétique médicale. Nous proposons un processus qui permet l’obtention de données de CNV non seulement fiables et robustes mais aussi, assez spécifique pour être directement interprétable. Nous proposons donc l’approche Exome first puisqu’elle permet de réaliser une étude pan-exonique complète (SNV et CNV, de la taille d’un exon à un chromosome entier) sur un même prélèvement et dans un même laboratoire. Le parcours diagnostique du patient est simplifié et accéléré.

La déficience intellectuelle (DI) a une prévalence estimée entre 1% et 3%. Plus de 1400 gènes sont déjà connus pour être impliqués et plus de 1200 sont candidats. Le séquençage de nouvelle génération a considérablement contribué à l’amélioration du rendement diagnostique et à l’identification de nouveaux gènes responsables de DI. Le diagnostic moléculaire repose aujourd’hui essentiellement sur le séquençage d'exome (ES), mais son rendement plafonne à environ 35%, ce qui laisse près de 2/3 des patients sans diagnostic. 

Le séquençage de génome (GS) peut, en théorie, permettre d’améliorer ce rendement. L’accès à des régions peu ou pas couvertes en ES autorise une meilleure couverture de certaines régions exoniques, la détection des variants dans les régions non codantes et la détection des variants structuraux (SV) équilibrés ou non. Afin d’évaluer le potentiel diagnostique du GS, nous avons effectué un séquençage de génome en trio de 33 patients atteints de DI, négatifs en ES. Les SNV/INDELs ont été appelés en suivant les recommandations de GATK et leur annotation/filtration a été réalisée par VEP et un pipeline snakemake maison. Un autre pipeline snakemake combinant les outils CNV de GATK4 et MANTA incluant la filtration et l’annotation des SV a également été développé. Les pipelines sont disponibles sur gitlab. 

Nous avons mis en évidence un variant pathogène ou probablement pathogène chez 24% des patients. Nous avons été identifié 11 SNV (9 par effet de ré-analyse; 2 non détectés en ES) et 9 SV. Parmi ces variants structuraux, 6 étaient de novo, un transmis selon un mode récessif, un lié à l’X et un variant avec point de cassure dans NUS1 transmis par une mère saine. Le taux de faux positifs est relativement faible. En moyenne moins de 10 SV de novo par patient ont été retenus par notre algorithme de détection et de filtration. L’ensemble de ces résultats confirme les bonnes performances de notre pipeline. De plus, notre méthode a montré son efficacité dans l’identification d’évènements complexes et de variants dans des régions non-codantes du génome. Nous avons notamment pu mettre en évidence une délétion du long ARN non-codant CHASERR dont l’implication dans des troubles neurodéveloppementaux est fortement suspectée. 

Nous présenterons ici notre méthode, les résultats obtenus et discuterons des difficultés que posent l’annotation et la filtration.

Les môles hydatiformes (MH) sont des grossesses humaines avec un développement embryonnaire anormal et une prolifération trophoblastique excessive. En France, on estime la fréquence des môles à environ 1 pour 1000 grossesses.

Il y a 2 types de môles : môle complète dans laquelle il n’y a jamais d’embryon ou de fœtus identifiable et môle partielle où un embryon peut se développer sans pouvoir survivre longtemps.

La très grande majorité des môles (98%) sont accidentelles. Seulement 2% sont récurrentes lors d’une grossesse suivante. Parmi ces môles récurrentes une fraction est d’origine génétique, le plus souvent il s’agit de môles complètes, biparentales et aucune grossesse n’aboutit à une naissance vivante. Six gènes ont été impliqués dans ces môles récurrentes : NLRP7, KHDC3L, PADI6, TOP6BL/C11orf80, MEI1 et REC114. Les femmes ont des variant bi-alléliques. La transmission est autosomique récessive. Ces femmes ont une diminution importante voire une impossibilité de produire des ovocytes fonctionnels.

Des patientes ayant présenté au moins deux môles ont pu avoir une ou plusieurs grossesses normales, mais ceci reste exceptionnel en cas de mutation bi-allélique. Il est important pour ces couples et ces familles de déterminer si la récurrence de môle est sous la dépendance d’un tel génotype du fait de cet élément malheureusement de mauvais pronostic pour la procréation, faisant orienter le couple vers une AMP avec don d’ovocytes. On peut aussi s’interroger sur le caractère éventuellement plus modéré de certains génotypes qui permettrait de continuer à envisager une grossesse naturelle, même si cela parait peu probable. Enfin d’autres gènes pourraient être impliqués dans ces situations.

C’est pourquoi nous avons développé un panel contenant les 6 gènes connus donnant des môles récurrentes et 68 gènes candidats. Nous avons obtenu une couverture de 100% à une profondeur de 30X, pour tous les exons de ces 6 gènes sur une série de 24 patientes. La couverture était de 99% à une profondeur de 30X sur l’ensemble du panel.

Une patiente a été utilisée comme témoins positif. Les 2 mutations, connues, de cette patiente ont bien été retrouvées.

Sur les 23 patientes testées en prospectif, nous avons identifiés 2 hétérozygotes composites NLRP7, 2 hétérozygotes NLRP7. Les variants bi-alléliques sont considérés comme responsables de la pathologie molaire à répétition des 2 patientes concernées. Les deux patientes ayant une mutation bi-allélique de NLRP7 ont une histoire obstétricale correspondant à ce qui est décrit : MH et absente d’enfant. L’interprétation pour les 2 patientes hétérozygotes est plus délicate puisque seuls les altérations bi-alléliques aboutissent à des môles : le variant en trans n’a pas été identifié ou s’agit-il seulement d’hétérozygote simple ? Des études complémentaires familiales et sur l’ARN sont nécessaires.

Pour certaines patientes sans mutation identifiée, une étude pangénomique serait intéressante afin d’essayer d’identifier d’autres gènes.

On estime qu'au moins 4000 gènes sont impliqués dans la spermatogenèse humaine qui représentent autant de candidats pour expliquer les anomalies spermatiques responsables de la majorité des infertilités masculines. La composante génétique de l'infertilité masculine est complexe et hétérogène. Dans cette étude, nous avons analysé par séquençage exomique deux patients infertiles non apparentés. Ces deux sujets présentaient une azoospermie non-obstructive (ANO) non syndromique et idiopathique. Comme ces sujets sont issus de parents apparentés, nous avons postulé que l’étiologie de leur affection était très probablement liée à une cause génétique à transmission autosomique récessive. L’analyse bio-informatique a donc été focalisée sur les variants homozygotes. Après une première étape d’analyse des données d’exome basée sur l’investigation des variants localisés dans des gènes candidats dans l’ANO (panel in silico de 151 gènes), nous nous sommes intéressés aux variants localisés dans des gènes à expression testiculaire spécifique ou dominante chez l’homme et la souris, et dont la fonction et/ou l’implication dans l’infertilité masculine ne sont pas connues. Cette dernière analyse nous a permis d’identifier pour chaque sujet testé un variant homozygote perte de fonction dans un gène exprimé spécifiquement dans les cellules germinales testiculaires, C1orf185 (c.250C>T ; p.Gln84Ter) et CCT6B (c.615-2A>G). Ces deux variants sont rares dans la population générale (fréquence allélique <0.005% selon gnomAD) et absents de notre cohorte locale de sujets contrôles (n=445). Pour vérifier l'implication de ces gènes candidats dans l’ANO, nous avons employé la technique CRISPR/Cas9 pour invalider les orthologues murins des gènes candidats identifiés chez nos patients et avons produit deux lignées de souris knockout (KO). Nous avons montré que les mâles KO homozygotes sont fertiles et présentent des paramètres spermatiques et un volume testiculaire comparables aux souris contrôles ainsi qu’une spermatogenèse fonctionnelle. Ces résultats montrent que tous les gènes fortement et spécifiquement exprimés dans les testicules ne sont pas essentiels à la spermatogenèse et en particulier, C1orf185 et CCT6B. 

Le syndrome microdéltionnel 8q21.11 (OMIM # 614230) est un syndrome rare caractérisé par une déficience intellectuelle, une dysmorphie faciale, des anomalies des extrémités, associées à d’autres anomalies ophtalmologiques, cérébrales et/ou cardiaques. Les délétions décrites à ce jour sont de tailles variables et le gène ZFHX4 est le seul gène candidat identifié pour expliquer essentiellement les signes oculaires identifiés dans ce syndrome. 

Nous rapportons le cas d’un garçon de six ans présentant un retard psychomoteur syndromique. L’examen clinique a montré une dysmorphie faciale et une hypotonie. Le bilan malformatif a objectivé une atrophie corticale avec une agénésie du corps calleux à l’IRM cérébrale et une communication inter-auriculaire à l’échographie cardiaque.

Le caryotype standard a objectivé la présence d’une translocation t(8;16)(q21;q11.2) de novo et l’analyse par FISH a confirmé qu’il s’agit d’une translocation réciproque n’impliquant que les chromosomes 8 et 16. L ‘analyse chromosomique par puces à ADN (ACPA) (Agilent 4X44K) a révélé une délétion interstitielle de 9.4 Mb de la région 8q21.12-q21.3 n’emportant pas le gène ZFHX4.

L’alignement de cette délétion avec toutes les délétions chevauchantes précédemment rapportées dans la littérature et dans la base de données Decipher nous a permis de délimiter une nouvelle région de chevauchement (SRO) contenant cinq gènes dont HEY1 ( hairy/enhancer of split related to the YRPW motif 1). Ce gène code pour un facteur de transcription impliqué dans la voie de signalisation Notch, dans l’embryogenèse cardiaque et dans la neurogenèse. Compte tenu de son expression et de sa fonction, nous suggérons que HEY1 est un nouveau gène candidat qui serait responsable à la fois des manifestations neurologiques et cardiaques dans le syndrome microdélétionnel 8q21.11. Cette étude permettra d’avancer dans la compréhension bases moléculaires de ce syndrome microdélétionnel encore non expliquées à ce jour.

Les technologies de séquençage nouvelle génération ont ouvert la possibilité de séquencer de grands échantillons de malades et de tester l'association avec des variants rares. Pour ce faire, les données de séquence des malades sont comparées à des données obtenues sur des témoins qui peuvent être séquencés spécifiquement pour l’étude ou, pour limiter les coûts, extraites de panels de témoins partagés comme le panel d’exomes FREX. Les données de séquence de ces panels de témoins peuvent avoir été générées sur des plateformes de séquençage différentes de celles utilisées pour séquencer les malades et se pose alors un problème de comparabilité des données et la possibilité de biais dans les analyses. Pour limiter ces biais et éviter de détecter de faux signaux d’association, des contrôles de qualité rigoureux sont nécessaires.

Nous proposons un pipeline complet en 5 étapes, RAVAQ, qui a) effectue un contrôle de qualité spécifique en 3 étapes tenant compte du statut cas-témoin pour assurer la comparabilité des données, b) sélectionne les variants pour les tests d’association selon la stratégie définie par l'utilisateur, et c) effectue les tests d’association avec variants rares par région génomique. Le pipeline RAVAQ est intégré dans un package R. Il est convivial et flexible dans ses arguments pour s'adapter à la spécificité de chaque projet de recherche. Nous montrons par des exemples sur des données réelles comment RAVAQ améliore les tests d'association avec variants rares. Le contrôle de qualité par défaut de RAVAQ est meilleur que la méthode VQSR (Variant Quality Score Recalibration) largement utilisée pour identifier des données de bonne qualité et aboutit à un test d'association mieux contrôlé, éliminant l'inflation due aux faux signaux d’association. Dans l’étape de contrôle de qualité des échantillons, RAVAQ intègre une méthode de détection des échantillons contaminés. Sur des données réelles, nous montrons que cette méthode est comparable à la méthode standard actuellement utilisée. Le package R RAVAQ est open source et disponible gratuitement sur https://gitlab.com/gmarenne/ravaq. La documentation du package est détaillée avec une vignette-tutoriel et deux scripts R qui peuvent être testés sur un vcf exemple inclus dans RAVAQ.

Abstract

Les fibroses pulmonaires idiopathiques (FPI) familiales ont été associées environ 30% des cas à des mutations germinales dans les gènes liés aux télomères (TRG). Dans cette étude, nous avons étudié la taille et la stabilité des télomères, l’intégrité des chromosomes et la réponse à l’exposition à un stress génotoxique tel que l’irradiation dans des fibroblastes pulmonaires primaires de patients atteints de FPI associées (FPI-TRG) ou non à une mutation d’un TRG. 

Matériels et méthodes :

Treize patients atteints de FPI, dont 7 patients porteurs d’un variant pathogène de  TRG (TERT et RTL1), et 7 témoins ont été introduits dans cette étude.  

La quantification de la taille des télomères et les aberrations télomériques ont été analysées par Aging kit. L’instabilité chromosomique a été étudiée après marquage des télomères et des centromères suivi par la technique de M-FISH. L’expression des protéines 53BP1, gH2AX et pATM ont été dénombrée par immunofluorescence avant et après irradiation in vitro.

Résultats :

La détection automatisée à haut débit des signaux télomériques a mis en évidence une intensité de signal plus faible dans les fibroblastes pulmonaires des patients atteints de FPI, suggérant un raccourcissement des télomères dans ces cellules. L’analyse des aberrations télomériques (pertes et délétions) a montré une fréquence significativement plus importante chez les patients FPI par rapport au contrôle et en particulier chez les FPI-TRG montrant une instabilité des télomères chez ces patients. Des chromosomes dicentriques, marqueur d’instabilité chromosomique, ont été trouvés chez tous les patients FPI-TRG.  Une accumulation spontanée des dommages de l'ADN (foyers spontanés de 53BP1 et gH2AX) a été détectée dans la majorité des cellules des FPI. Une sensibilité plus élevée aux rayonnements avec un retard systématique dans l’activation de la protéine ATM, nécessaire à la reconnaissance complète du DSB, était associée à la persistance d'un taux élevé de foyers gH2AX et 53BP1 après irradiation.

Conclusion :

Les fibroblastes issus de FPI présentent une instabilité télomérique et chromosomique avec un déficit de réparation des cassures double brin, instabilité qui pourrait jouer un rôle dans la physiopathologie de la maladie.  

Lors des dernières assises, nous avions présenté l’élaboration d’un outil digital en étroite collaboration avec l’Union Régionale des Médecins Libéraux et financé par l’ARS Normandie, destiné à faciliter l’accès à la génétique auprès des praticiens non généticiens (sage femmes, médecins généralistes, gynécologues…). Cet outil d’aide à la décision, disponible gratuitement, sur smartphone et ordinateur, vise à faciliter l’orientation des patients dont l’histoire personnelle et/ou familiale relève d’une consultation d’oncogénétique. L’outil s’intègre à la procédure basée sur les Entretiens Téléphoniques de Préparation (ETPs) et de routage implantée en Normandie, permettant d’accélérer la prise en charge des patients. Le but de cet outil n’est pas d’apporter une expertise en oncogénétique mais de déterminer si un(e) patient(e) doit être adressé(e) vers une consultation d’oncogénétique. Cette application repose sur une arborescence constituée d’une succession de questions simples à 2 ou 3 réponses possibles. L’algorithme est construit en commençant par les questions les plus discriminantes (cancer du sein chez un homme, cancer du sein triple négatif...) puis en intégrant les antécédents familiaux afin d’arriver le plus rapidement possible, en moins de 2 minutes, à la conclusion : « indication à un ETP » ou « pas d’indication à un ETP ». Cette application intègre également la possibilité de propositus asymptomatique, considérant que les professionnels de santé sont amenés à prendre en charge des apparentés asymptomatiques dont un proche a présenté un cancer du sein et/ou de l’ovaire. Lorsque l’indication à un ETP est retenue, l’application indique les coordonnées du service de génétique le plus proche, ainsi qu’un code que le patient communique lors de sa prise de rendez-vous. Ce code permet de façon cryptée et anonyme de tracer le parcours sur l’application qui a conduit à cette prise de rendez-vous dans le service de génétique correspondant et justifie l’ETP.  Ce nouvel outil nommé « SmartGenetCancer », associé à la stratégie des ETPs, s’inscrit dans un nouveau parcours en oncogénétique, offrant réactivité. En effet, l’outil a été pensé comme un vecteur simple des connaissances actualisées, auprès des professionnels de santé non formés à la génétique. A terme, compte tenu de l’impact de la consultation d’oncogénétique dans le parcours thérapeutique des patients pris en charge en oncologie (exemple des inhibiteurs de PARP), cette application pourra être un outil évolutif en accord avec les recommandations, s’inscrivant dans une médecine génomique personnalisée, accessible rapidement et au plus grand nombre. Cette application est maintenant diffusée en Normandie et son impact sur le parcours du patient et le retour des professionnels utilisateurs est en cours d’évaluation. A l’occasion de ces assises, « SmartGenetCancer » est mis à disposition afin de permettre son test dans le cadre de la prédisposition héréditaire au cancer du sein et de l’ovaire.

Les anomalies du gène DMD sont responsables de la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Nous avons identifié pour la première fois une délétion de l’exon 49, respectant le cadre de lecture du gène DMD, et associée à un phénotype musculaire normal. Sur la base de cette observation, et de données préalables d’efficacité thérapeutique du saut d’exon dans la DMD, y compris avec des applications cliniques pour d’autres exons, nous avons débuté un projet dont l’objectif sera d’étendre l’utilisation clinique de cette approche aux patients porteurs de mutations ponctuelles dans l’exon 49. Ainsi, cela permettra d’élargir le nombre de patients pouvant bénéficier de cette approche thérapeutique.  Pour cela, nous avons réussi d’abord à caractériser la taille génomique précise de la délétion. Puis, nous avons transfecté, in vitro, des myotubes différenciés à partir de myoblastes humains sains avec des AON et démontré leur efficacité pour effectuer le saut de l’exon 49. Nous présenterons aussi de futures études fonctionnelles. Notre projet est une preuve de concept pour concevoir des AON thérapeutiques, et initier des essais cliniques dans le but d’élargir l’utilisation du saut d’exon pour la DMD.

Les déficits de la voie de réparation de l’ADN par excision de nucléotides (NER) sont à l’origine de plusieurs maladies de transmission autosomique récessive, de sévérité et de pronostic variables. Peu de données existent sur la reconnaissance précoce des premiers symptômes, nécessaires à l’amélioration de la prise en charge, du suivi ainsi que du conseil génétique de ces patients et de leur famille.

Nous avons inclus l’ensemble des fœtus avec une variation pathogène dans un des gènes de la voie NER présentant un phénotype clinique détaillé (autre qu’un RCIU isolé). Les données ont été collectées à partir de patients de la littérature ainsi que de patients diagnostiqués au sein de notre laboratoire.

13 cas fœtaux issus de 7 familles différentes ont ainsi été rapportés, 11 d’entre eux sont décédés in utero (10 lors d’une interruption médicale de grossesse et 1 mort fœtale in utero), 1 lors de l’accouchement et 1 enfant est décédé à 6 ans. Des mutations d’ERCC5/XPG était retrouvées chez 77% (10/13) d’entre eux. Les 1ers signes cliniques sont retrouvés à l’échographie entre 20 et 32 semaines d’aménorrhées, plutôt aspécifique avec pour la majorité d’entre eux une arthrogrypose (9 cas), une réduction des mouvements fœtaux (8 cas), et/ou une microcéphalie (7 cas). Devant ces anomalies, 3 IRM fœtales in utero ont été réalisées mettant en évidence pour tous une hypoplasie cérebelleuse.10 fœtus ont eu une autopsie post-natale avec analyse microscopique notamment cérébrale et 2 un examen post-natal mini invasif (IRM + examen macroscopique).  A l’examen post-natal on retrouve une microcéphalie pour la totalité des cas (100% ; 12/12), une dysmorphie pour 83% (10/12) d’entre eux (essentiellement une micrognathie et des oreilles basses implantées), un RCIU pour 72% (8/11) et une cataracte uniquement pour 33% (3/9) d’entre eux. Sur le plan cérébral, 70% (7/10) des cas présentaient des anomalies de la fosse postérieure (à type d’hypoplasie ponto-cérebelleuse ou hypoplasie cérébelleuse isolée), 70% (7/10) une dilatation des ventricules latéraux et 50% (6/12) un retard de maturation corticale. Au total 11 présentaient un phénotype correspondant au syndrome cérébro-oculo-facio-squelettique (COFS), 1 avec un phénotype de trichothiodystrophie et une patiente avec un syndrome de Cockayne de type 2.

Les anomalies associées aux syndromes de la voie NER en anténatal diffèrent des atteintes retrouvées habituellement en post-natal avec notamment une plus forte prévalence des anomalies cérébrales à type de malformation corticale notamment hypoplasie ponto-cérébelleuse qui pourraient attirer l’attention des cliniciens en l’absence de la totalité des critères cliniques habituellement associés à ces pathologies en post-natal.

Introduction

L’analyse d’exome a pris une place prépondérante dans le bilan étiologique des syndromes malformatifs avec un rendement diagnostique pouvant être estimé entre 25 et 40% selon les études, leur ancienneté, le design (solo, trio, autre), le cadre diagnostique ou l’extension en recherche contribuant à identifier de nouveaux gènes et/ou nouveaux mécanismes physiopathologiques. Dans un premier temps, l’exome a été utilisé en période post-natale (patients vivants ou décédés dont post-IMG). Depuis quelques temps, la prescription s’est élargie au contexte prénatal devant des signes d’appel échographiques afin de tenter de préciser le pronostic de grossesses. Ce travail a pour but de contribuer à évaluer l’apport de l’exome, comprenant la détection des CNV, dans ce cadre.

Méthode

Les exomes ont été prescrits par différents médecins intervenant au sein de CPDPN entre juin 2020 et aout 2021 inclus pendant ou après ACPA. Les interprétations ont été réalisées au laboratoire Eurofins Biomnis et au CHU de Saint-Etienne à l’aide de la plateforme bioinformatique SeqOne pour les SNV et un pipeline interne pour les CNV, après séquençage Illumina.

Résultats

Quarante analyses ont été réalisées. Il existait une atteinte de plusieurs organes dans 11 à 13 cas (2 cas diagnostiqués en cours de récupération de données complémentaires). Le motif principal d’atteinte d’organe isolée était une anomalie du corps calleux dans 9 cas (22,5%) sur 13 cas (32,5%) d’anomalies uniquement cérébrales. Dans 22/37 cas, la recevabilité d’une IMG pouvait s’envisager avant la prescription.

Au total, 10/40 diagnostics (25%) ont été posés dont 1 duplication intra-génique. Dans un autre cas, un variant chromosomique (vu en ACPA et sur le pipeline CNV) prédisposant aux troubles neurodéveloppementaux pouvait participer à l’anomalie isolée du corps calleux (sans autre cause identifiée).

Parmi les syndromes polymalformatifs, 4/11 à 6/13 diagnostics ont été posés ; parmi les anomalies du corps calleux isolées, 0/9 diagnostic posé (intérêt pour réduire le risque résiduel dans la majorité).

Concernant l’apport de l’exome pour le pronostic pour les 8 cas diagnostiqués avec données cliniques suffisantes :

- pour 6 cas, l’apport de l’exome a été principalement diagnostique, les signes en imagerie étaient déjà associés à un pronostic réservé ;

- dans 1 cas, le résultat a permis de rassurer le couple (polydactylie isolée des 4 extrémités) ;

- dans 1 cas, le résultat a permis de diriger la surveillance échographique et envisager un pronostic possiblement moins marqué (SLC26A2/DTDST).

Discussion

Il s’agit d’une cohorte hétérogène avec prescription débutante d’exome en prénatal rendant la pertinence des pourcentages limités. Plus les tableaux seront légers, plus le rendement diagnostique attendu diminuera. Des tests supplémentaires en cours vont enrichir la cohorte.

Il existe un intérêt à détecter les CNV pour le diagnostic et à une concertation régulière génétique-imagerie pour préciser le pronostic.

Introduction

Le rendement diagnostique de l’exome dans les anomalies du développement est de 35 à 40 %, laissant plus de la moitié des patients sans diagnostic. Solve-RD, un projet européen Horizon 2020, a pour but de résoudre l’impasse diagnostique et d’identifier les causes moléculaires des maladies rares génétiques non connues. Le projet agrège près de 19000 exomes et génomes de patients sans diagnostic partagés par les réseaux européens de référence (ERN) pour réanalyser les données à l’aide de pipelines bioinformatiques automatisés et standardisés. Parmi ceux-ci, celui dédié à la recherche de variations (probablement) pathogènes dans ClinVar dans les données des patients permet d’identifier rapidement les variations présentant un intérêt clinique. Nous présentons les résultats de cette réanalyse, appelée « ClinVar low-hanging fruits », les raisons de l’absence de diagnostic au moment de la première analyse et les leçons à en tirer.

Méthodes

À partir des données brutes des cas non résolus de la cohorte ERN-ITHACA, nous avons retenu les SNV et indels 1) situés dans des gènes associés à la déficience intellectuelle ou aux troubles du neurodéveloppement (1740 gènes) 2) de fréquence allélique dans gnomAD <  1 % et dans la base de données interne RD-Connect <  2 % et 3) rapportés dans ClinVar comme étant pathogènes ou probablement pathogènes. Les résultats ont été retournés aux centres d’inclusion pour une interprétation clinico-biologique.

Résultats

Nous avons réanalysé 1522 cas, priorisé 147 variations et retenu 9 variations permettant 9 nouveaux diagnostics :

- 2 faux-sens de novo dans des gènes non connus en pathologie humaine au moment de la première analyse : 1 dans TRRAP associé à un retard de développement depuis 2018 ; 1 dans NFIA rapporté morbide dans OMIM depuis 2017.

- 3 variations mal interprétées : 1 d’épissage dans SYNGAP1 qui n’avait pas été retenue ; 1 faux-sens dans PTEN qui avait été rendu comme étant de signification incertaine car hérité de la mère paucisymptomatique ; 1 indel homozygote dans ANO10 qui avait été lue comme hétérozygote du fait d’un alignement mal interprété sur IGV.

- 4 variations non détectées ou filtrées par les pipelines locaux : 1 faux-sens dans TUBB3 situé dans une région non ciblée par le kit d’enrichissement ; 1 faux-sens dans TUBB éliminé du fait d’une faible profondeur de couverture ; 1 en mosaïque dans EEF1A2 non identifiée car seuls quelques reads la soutenaient ; 1 frameshift dans FKBP14 filtré car annoté « commun » dans dbSNP (6ꞏ10^-4 dans gnomAD), responsable dans 70 % des cas de la pathologie.

Conclusion

La réanalyse « ClinVar low-hanging fruits » des cas négatifs de la cohorte ITHACA, montre l’utilité d’une réanalyse systématique des exomes négatifs, notamment ciblée sur les variations rapportées (probablement) pathogènes dans ClinVar, avec des critères peu stricts. Des outils développés par la communauté comme VariantAlert permettent de réaliser une telle réanalyse à mesure des soumissions dans ClinVar.

L'holoprosencéphalie (HPE ; MIM# 236100) est la malformation cérébrale congénitale la plus fréquente (1 sur 10 000 naissances vivantes, 1 sur 250 conceptions). Elle résulte d'un défaut de clivage médian du prosencéphale, entre le 18e et le 28e jour de gestation, affectant à la fois le cerveau antérieur et le visage.

Le spectre phénotypique est très large, allant de l'HPE alobaire sévère avec ventricule cérébral unique et cyclopie jusqu'aux porteurs asymptomatiques dans le cas des HPE familiales. Trois classes anatomiques classiques ont été décrites, par ordre décroissant de gravité : HPE alobaire, semi-lobaire et lobaire. Le spectre complet du HPE comprend également des microformes caractérisées par des anomalies de la ligne médiane craniofaciale, avec fente labiale/palatine, hypotélorisme, colobome, microcéphalie, sténose des sinus piriformes et/ou incisive médiane maxillaire unique (IMU).

Les bases génétiques de l'HPE ne sont que partiellement comprises car ∼70% des cas familiaux restent sans cause moléculaire établie. Différents modes de transmission ont été décrits, notamment l'hérédité autosomique dominante, récessive, digénique et oligogénique, illustrant l'architecture génétique complexe de ce spectre. La plupart des variants pathogènes rapportés présentant une pénétrance incomplète et une expressivité variable, les modificateurs génétiques apparaissent désormais comme des modulateurs clés du phénotype de cette pathologie.

La plupart des gènes d'HPE connus appartiennent à la voie Sonic Hedgehog (SHH) - une cascade moléculaire complexe qui joue un rôle central dans le développement du cerveau. Le principal effet commun des variants pathogènes identifiés est l'altération de l'activité de la voie SHH, ce qui entraîne une perturbation de la ligne médiane ventrale du cerveau.

DISP1 est un facteur positif nécessaire à la sécrétion efficace du morphogène SHH et à l'établissement de son gradient de concentration le long de la ligne médiane du tube neural. Les souris déficientes (KO) Disp1 présentent une HPE sévère associée à une cyclopie et une signalisation SHH défectueuse. Chez l'homme, des études génétiques supplémentaires sont nécessaires pour élucider le rôle précis de DISP1 dans la pathogénèse de la maladie.

Dans cette étude, nous décrivons la première cohorte de patients atteints d'HPE et présentant des variants de DISP1. Nous élucidons la contribution de DISP1 à l'HPE en effectuant une évaluation de la pathogénicité des variants de DISP1 associés à l'HPE. Nous décrivons une cohorte de 28 individus issus de 23 familles non apparentées, en regroupant les variants de DISP1 retenus lors du diagnostic moléculaire dans notre laboratoire, ainsi que les résultats obtenus en collaboration et ceux publiés précédemment.  Nous analysons plus précisément le spectre clinique de l'HPE associée à DISP1, nous donnons un aperçu du processus pathologique sous-jacent et nous décrivons des facteurs modulant les conséquences phénotypiques des variants de DISP1.

Le syndrome hamartomateux lié au gène PTEN, ou PHTS (PTEN-related Hamartoma Tumor Syndrome), est un syndrome de prédisposition au cancer dans lequel on décrit diverses anomalies cérébrales : fistules artério-veineuses durales (FAVD), tumeurs cérébelleuses de Lhermitte-Duclos (TLD), malformations d’Arnold-Chiari (MAC) et des anomalies veineuses du développement (AVD). Les FAVD sont rares, leur développement est lent et pauci-symptômatique mais leurs conséquences parfois fatales. Les TLD, dont la fréquence parmi les patients PHTS varie de 9 à 50%, et les MAC, dont la fréquence est comprise entre 12 et 33%, nécessitent parfois des interventions neurochirurgicales. Malgré cela, il n’existe pas de consensus d’exploration ni de suivi par imagerie cérébrale chez ces patients. 

Le but de notre étude était de quantifier et de décrire les anomalies cérébrales afin de proposer un protocole d’exploration. Elle a porté sur une série de patients diagnostiqués dans le laboratoire de génétique moléculaire de la Pitié-Salpêtrière dont nous avons relu les IRM cérébrales. Nous avons inclus 58 patients. L’âge moyen était de 15.7 ans [0.6 ; 55.9] au moment du diagnostic avec un sex ratio H/F de 1.9. Les portes d’entrée diagnostiques étaient diverses : oncogénétiques, enquête familiale, trouble du neurodéveloppement/macrocéphalie ou malformation vasculaire. Deux patients avaient une FAVD, suggérant un risque supérieur à celui de la population générale (incidence de 0.3/100 000/an). Alors que les FAVD se manifestent généralement après 50 ans, ces deux patients étaient âgés de 21 et 36 ans. Les patients n’ayant pas tous bénéficié des séquences d’IRM dans le but de visualiser les anomalies vasculaires, ce chiffre est possiblement sous-estimé. Par ailleurs, 10,3 % des patients avaient une AVD dont un symptomatique (épilepsie). 63,2% avaient des anomalies non progressives de la substance blanche. La fréquence des TLD était de 12,3 %, celui de MAC de 14,0% et un patient présentait un méningiome, ce qui est en cohérence avec les données de la littérature existante. Il n’y avait ni cavernome ni dysplasie corticale.

Ces observations confirment l’intérêt d’une IRM cérébrale systématique chez les patients porteurs d’un variant pathogène dans le gène PTEN. Nous proposons un protocole de surveillance comprenant : 1) une séquence T1 sans injection et 2) FLAIR pour éliminer une MAC, faire le bilan des anomalies de la substance blanche et vérifier l’intégrité du cortex ; 3) une susceptibilité magnétique SWI ou SWAN, ou à défaut une T2*, afin de visualiser les lésions d’allure vasculaire de type cavernome ou AVD ; enfin, la recherche systématique d’une FAVD implique 4) l’acquisition avec injection en 5) ARM dynamique, ainsi qu’une 6) séquence perfusion ASL à la recherche de shunts vasculaires ou d’AVD puis 7) une séquence d’angio-IRM en temps de vol (grand 3D-TOF). Les FAVD étant des lésions qui se développent, une répétition de cet examen est envisageable tous les 5 à 7 ans.

La vision, considérée comme le sens le plus complexe, le plus développé et le plus important, semble particulièrement affectée chez les patients FXS. Des preuves relient également directement les anomalies sensorielles à l'expression clinique des troubles du comportement chez les personnes atteintes de FXS.

En utilisant l'électrorétinographie (ERG) et la sensibilité au contraste (CS), nous avons précé-demment décrit la présence de déficits sensoriels dans le système visuel du modèle de souris Fmr1-/y (Ros-signol et al, 2014 ; Perche et al, 2018 ; Felgerolle et al, 2019). La présente étude rapporte une approche similaire dans une cohorte de garçons avec FXS (n=20, 18-45 ans) et de témoins appariés en âge (n=20, 18-45 ans). L'enregistrement des données a été réalisé avec succès pour l'ERG et le CS chez la plupart des individus. Des anomalies de l’ERG et CS similaires à celles observées chez le modèle souris Fmr1-/y ont été caractérisées chez les sujets avec FXS.

Notre étude montre la pertinence d'utiliser l’ERG et CS pour évaluer le système visuel dans le FXS. La similitude du phénotype humain et du modèle souris valide l’utilisation de ce modèle animal pour l’étude préclinique du déficit sensoriel visuel chez l’homme.

Enfin, en objectivant un phénotype électrophysiologique (ERG) associé à un phénotype fonction-nel, notre étude suggère la possibilité d’utiliser l'ERG et la CS (ERG-CS) comme biomarqueurs complémen-taires pour caractériser les anomalies sensorielles visuelles observées dans le FXS (Perche et al, in press).

Bibliographie :

Rossignol R et al. Visual sensorial impairments in neurodevelopmental disorders: evidence for a retinal phenotype in Fragile X Syn-drome. PLoS One. 2014;9(8):e105996

Perche O et al. Early Retinal Defects in Fmr1-/y Mice: Toward a Critical Role of Visual Dys-Sensitivity in the Fragile X Syndrome Pheno-type? Front Cell Neurosci. 2018;12:96

Felgerolle C et al. Visual Behavior Impairments as an Aberrant Sensory Processing in the Mouse Model of Fragile X Syndrome. Front Behav Neurosci. 2019;13:228

Perche et al. Electroretinography and contrast sensitivity, complementary translational biomarkers of sensory deficits in the visual system of individuals with Fragile X Syndrome. J Neurodev Disord. 2021; in press.

Contexte :

Le syndrome de CANVAS (Cerebellar Ataxia, Neuropathy, Vestibular Areflexia Syndrome) est une maladie autosomique récessive rare d’apparition tardive, caractérisée par une atteinte cérébelleuse lentement progressive (démarche ataxique, nystagmus, dysarthrie), une atteinte vestibulaire bilatérale, une neuropathie sensitive axonale ainsi qu’un syndrome dysautonomique. La présence d’une toux chronique antérieure à l'apparition du tableau neurologique est fréquente. La prévalence de ce syndrome serait de 1 sur 20 000 dans la population caucasienne soit plus fréquent que l’ataxie de Friedreich.

Récemment, une expansion bi-allélique d’un pentanucléotide (AAGGG) dans l’intron 2 du gène RFC1 a été identifiée comme la cause moléculaire de ce syndrome (Cortese et al. Nature Genetics 2019).

Méthode :

Nous rapportons le bilan de 2 ans de diagnostic moléculaire du syndrome de CANVAS par analyse des expansions RFC1 par RP-PCR et PCR longue, chez 130 familles (120 cas sporadiques et 10 cas familiaux) présentant une ataxie d’apparition tardive.

Résultats :

Au sein de notre cohorte, nous avons pu identifier une expansion pathologique du pentanucléotidique AAGGG dans le gène RFC1 chez 50% des cas index à l’état homozygote et chez 9% à l’état hétérozygote.

Des profils de PCR longue atypiques ont parfois été identifiés chez certains de ces patients. Le séquençage Sanger des allèles a permis de mettre en évidence des expansions complexes non-décrites à ce jour et dont la signification est inconnue.

Nous constatons une forte hétérogénéité clinique chez nos patients présentant l’expansion pathogène à l’état bi-allélique (AAGGG) :

- 25% avec un syndrome de CANVAS (triade : Ataxie, Neuropathie, Vestibulopathie dont 5% présentent un phénotype plus complet : triade + toux chronique + dysautonomie). 

- 48% au moins 2 signes (Ataxie + Neuropathie ou Neuropathie + Areflexie Vestibulaire)

- 27% 1 seul signe (majoritairement la Neuropathie).

Nous notons que la neuropathie sensitive est quasi constante (99%) et que la toux chronique est retrouvée chez 58 % des patients porteurs de l’expansion à l’état homozygote.

Nous ne disposons pas toujours des résultats des investigations cliniques (IRM et EMG) ce qui explique peut-être des phénotypes incomplets.

Conclusion :

Notre étude permet de confirmer la forte implication du gène RFC1 dans les ataxies d’apparition tardive associées à une neuropathie sensitive. L’absence de neuropathie sensitive rend le diagnostic de CANVAS peu probable, justifiant la nécessité d’une bonne caractérisation clinique de l’atteinte neurologique afin d’optimiser le criblage génétique. A l’heure du séquençage haut-débit systématisé, il apparait justifié d’exclure une expansion bi-allélique du gène RFC1 avant toute étude génomique (recommandations du PFMG2025), au vue la grande proportion de CANVAS identifiée sur le plan moléculaire au sein de notre cohorte.

Les neurodégénérescences avec accumulation intracérébrale de fer, ou NBIA (pour Neurodegeneration with Brain Iron Accumulation) constituent un groupe de pathologies héréditaires très rares, ayant pour dénominateur commun une accumulation excessive de fer dans les ganglions de la base du cerveau visible en IRM cérébrale. L’IRM cérébrale est en général l’examen clé révélant la surcharge en fer. Les signes cliniques sont variables, dominés par des mouvements anormaux (dystonie, parkinsonisme, chorée, ataxie, spasticité), des troubles du comportement et des troubles cognitifs. L’âge de début est très variable de même que l’évolution, pouvant conduire en quelques années au décès ou être d’évolution lente avec des périodes de stabilité. Des variants pathogènes de NBIA ont été identifiés dans une quinzaine de gènes différents, la plupart étant soumis à une hérédité autosomique récessive (AR).

Les variants pathogènes de C19ORF12 sont à l’origine de la NBIA type 4 ou Mitochondrial membrane Protein Associated Neurodegeneration (MPAN) dont la présentation classique débute au cours de la première décennie par des troubles de la marche de type cérébellospastique. Les symptômes fréquents sont des difficultés d’apprentissage, des troubles psychiatriques qui peuvent être présents dès la petite enfance, une dysarthrie, une dystonie habituellement limitée aux pieds et aux mains et une atrophie optique quasi constante avec une baisse d’acuité visuelle. La transmission est AR. Récemment quelques familles avec MPAN de transmission autosomique dominante ont été décrites avec des présentations cliniques et des âges de début relativement similaires aux formes classiques ( AR.

Nous décrivons 8 patients supplémentaires de MPAN dominant issus de 5 familles et identifiés par séquençage haut-débit d’un panel de 9 gènes impliqués dans les NBIA. Le tableau clinique et paraclinique des 8 patients est très détaillé, reproduisant en partie les données de la littérature.  Cependant de façon plus originale, un phénotype très fortement évocateur d’une démence fronto-temporale a été relevé chez plusieurs patients, éventuellement associé à une atteinte du motoneurone (suspicion de DFT-SLA). Les variants pathogènes hétérozygotes dans C19ORF12 sont tous de type tronquant (3 non-sens et 1 délétion d’une base), localisés dans le 3^ème exon  codant la moitié C-terminale de la protéine. Le cerveau d’un patient décédé a été analysé, révélant des anomalies déjà décrites, incluant des corps de Lewy abondants dans les ganglions de la base. Enfin sur le plan fonctionnel, nous avons obtenu des cultures primaires de fibroblastes de 3 de ces patients permettant d’analyser les fonctions mitochondriales, l’autophagie et le métabolisme du fer. Les données obtenues suggèrent une homéostasie anormale du fer, et des défauts de biogénèse mitochondriale ou de mitophagie chez les patients présentant une forme dominante.

L’achondroplasie est une maladie osseuse constitutionnelle autosomique dominante causée par la présence du variant pathogène récurrent p.Gly380Arg du gène FGFR3, responsable d’une anomalie de l’ossification endochondrale et de la fermeture prématurée des synchondroses. Les patients présentent un sur-risque de mort subite dans la première année de vie due à une myélopathie compressive secondaire à un rétrécissement significatif du foramen magnum (FM). Un suivi multidisciplinaire incluant une IRM de la charnière cranio-vertébrale (CCV) et une polysomnographie vers l’âge 6 mois est préconisé afin d’identifier les patients nécessitant une chirurgie de décompression. Cependant, la corrélation entre la dimension du FM et le risque de complications neurologiques n’est pas complétement élucidée et l’évaluation de l’indication neurochirurgicale reste complexe.

Nous avons réalisé une étude rétrospective des patients suivis dans notre centre entre 2008 et 2020 afin de mieux caractériser les modifications anatomiques précoces de la CCV et leur évolution et de proposer des critères anatomiques de sévérité.

Des mesures anatomiques de la CCV ont été réalisées sur l’IRM cervicale des 21 patients et 84 contrôles sains, en aveugle par deux radiologues. L’âge médian à l’IRM était de 1,5 ans pour les filles et de 5,4 ans pour les garçons. Les 21 patients ont bénéficié d’une ou plusieurs IRM avec un temps moyen de suivi de 5,7 ans. Les données cliniques et de polysomnographie disponibles ont également été collectées afin d’évaluer la corrélation entre l’évolution radiologique et clinique.

Une sténose de la CCV a été retenue chez 52,4% des patients, dans tous les cas avant 2 ans. Notre étude confirme la diminution du FM (13,6±6,2mm vs 28,5±4,7mm, p<0,001) en accord avec la littérature. Cependant, nous avons observé chez tous les patients présentant une sténose de la CCV que celle-ci n’est pas liée au diamètre du FM mais plutôt au diamètre antéro-postérieur entre la dent de C2 et l’opisthion (8,7±3,9mm vs 24,6±5,1mm, p<0,001). D’autres modifications anatomiques précoces incluent un antelisthesis de l’opisthion, une bascule postérieure de C1-C2, un épaississement de la dent de C2. Nous avons donc défini 3 formes anatomiques de CCV à l’IRM chez les nourrissons porteurs d’achondroplasie : 1) absence de sténose, 2) compression postérieure, 3) association de compressions postérieure et antérieure (en « Z »). Concernant le pronostic, tous les nourrissons dont le diamètre C2-opisthion était supérieur à 6 mm ont présenté une bonne évolution clinique et radiologique spontanée. L’absence d’apnée centrale ne semble pas être un argument permettant d’écarter une sténose sévère.

Une étude prospective à l’échelle nationale concernant une série plus large de patients serait souhaitable pour confirmer ces résultats préliminaires, dans le but de mieux préciser l’indication de la prise en charge neurochirurgicale des patients achondroplases dans la première année de vie.

Le syndrome de Netherton (SN) est une maladie génétique cutanée rare due à des mutations perte de fonction du gène SPINK5 codant l’inhibiteur de protéase LEKTI. Les personnes atteintes du SN présentent une profonde anomalie de la barrière cutanée, des lésions cutanées inflammatoires, une desquamation superficielle de la peau, une anomalies pilaire spécifique (trichorrhexis invaginata) et des manifestations atopiques sévères avec IgE sériques élevées. Les personnes atteintes de SN développent la forme classique d’ichthyose linéaire circonflexe (SN-ILC) ou une érythrodermie desquamative (scaly erythroderma) (SN-SE). Il n’existe actuellement pas de traitement satisfaisant pour cette maladie orpheline.  

L’objectif du notre étude était de combiner des approches de génomique, protéomique et de profilage moléculaire afin de caractériser les anomalies cutanées, immunologiques et allergiques des sujets SN-ILC et SN-SE.

Nous avons étudié une cohorte de 13 sujets SN comprenant 9 SN-ILC et 4 NS-SE. Une approche multi-omique intégrée a révélé des anomalies de la prolifération et de la différenciation épidermique et des signatures moléculaires IL-17/IL-36 dans la peau lésée et le sang des deux phénotypes. Les profils moléculaires de la peau lésée des sujets SN-ILC et SN-SE étaient très comparables, mais la peau non lésée de chaque sous-type de la maladie présentait des signatures moléculaires distinctes.   L’épiderme lésé et non lésé de sujets SN-SE montrait une activation de la voie de signalisation de l’interféron de type 1 (IFN-1), alors que la peau lésée des sujets SN-ILC se distinguait de la peau non lésée SN-ILC par une activation du complément et un infiltrat cutané de polynucléaires neutrophiles. Le profilage moléculaire des cytokines sériques et l’immuno- phénotypage des lymphocytes circulants montraient une activation des réponses allergiques de type Th2 chez les sujets SN-ILC, alors que les patients SN-SE présentaient principalement une réponse allergique de type Th9 avec une augmentation des concentrations sériques de CCL22/MDC et CCL17/TARC.

Notre étude confirme les signatures IL-17/IL-36 prédominantes dans les deux phénotypes SN et révèle des profils moléculaires permettant de distinguer les sujets SN-ILC et SN-SE. Ces résultats ont permis d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et pourraient guider le développement d’une médecine de précision pour traiter le SN. 

ETUDES : Cohorte de 140 enfants de moins de 5 ans atteint de retard d’éveil visuel : les étiologies génétiques

METHODES : Il s’agit d’une étude rétrospective portant de 2015 à 2021, dans le centre de compétence de maladie rare neuro-visuelle de Nantes étudiant les retards d’éveil visuel chez l’enfant de moins de 5 ans. Le mode de recrutement, la pyramide des âges, les pathologies prénatale et périnatale, les retard psychomoteurs, l’âge de la marche,  le phénotype ophtalmologique, le retentissement médico-social sont calculés dans l'ensemble de la cohorte, ainsi que les étiologies génétiques.

RESULTATS : Nous avons analysé une cohorte de 140 enfants de moins de 5 ans qui présentent tous un retard d’éveil visuel, d’âge moyen lors de la première consultation de 10 mois, avec une nette prédominance de garçons (59%). Les enfants étaient directement adressés pour 45% par des neuropédiatres, pour 32% par des ophtalmologistes, pour 14% par des pédiatres, et pour 5% par des généticiens. Les problèmes périnataux (prématurité, syndrome de west, hypotonie axiale,…) concernent quasiment un enfant sur deux (55%). Pour une moyenne d’âge de la dernière consultation à 5 ans et 4 mois, la marche est non acquise pour 73% d’entre eux. Il a également été constaté un nystagmus associé chez 30 % des enfants. 

Un bilan génétique a été demandé dans 60% des cas. Chez ces enfants, la biologie moléculaire (CGH array, exome, panel, ..), a confirmé l’étiologie génétique dans 41 % des cas,  est revenu négative dans 13% des cas déclenchant une étude du génome entier sur plateforme Seqoia, et en attente de résultat pour 46 % des enfants. Des microdélétions, des trisomies en mosaïque ont été retrouvées. Des variants pathogènes des gènes KAT6B, EPG5 , MYO5A, POGZ, CLCN4, SALSA2, KIF5C, CHD7, YIF1B, ITPR1, PIGA, P1GN, CIP1B1, FOXG1, CDKL5, UBA5 ont été retrouvés De façon beaucoup plus surprenante, nous avons retrouvé des variants pathogènes de gènes donnant classiquement des nystagmus et une amblyopie, mais pas de retard d’éveil visuel comme le PDE6C et le CMGB3 (achromatopsie) et 2 phénotypes d’albinisme oculaire et oculocutané dont nous attendons les résultats.

CONCLUSIONS : Notre cohorte montre que devant tout retard d’éveil visuel, un bilan cytogénétique, métabolique et génétique est très souvent nécessaire, et que l’on retrouve une étiologie génétique certaine dans 41% des cas, pourcentage qui devrait augmenter avec les résultats en attente des génomes entiers.

Contexte : Le déficit en 21-hydroxylase (D21OH) par mutation de CYP21A2 est une cause très fréquente d’hyperplasie congénitale des surrénales, une des maladies génétiques les plus fréquentes en France. Peu de laboratoires réalisent cette analyse, rendue compliquée par une région génomique très complexe avec un pseudogène (CYP21A1P). Le séquençage par Sanger après amplification spécifique reste la seule méthode communément utilisée et elle doit être combinée à une MLPA afin de rechercher des délétions/réarrangement du locus. L’analyse par diverses méthodes de séquençage nouvelle génération (NGS), théoriquement transposable dans de nombreux laboratoires, n’était à ce jour pas fiable.

Objectif : Développer et valider une méthode fiable, rapide et reproductible d’analyse de CYP21A2 par NGS, facilement utilisable.  

Méthode : L’amplification spécifique du locus CYP21A2 est assurée par une unique PCR longue (4kb). Le locus est ensuite entièrement séquencé par NGS Illumina et analysé par un protocole bioinformatique spécifique.

Résultats : Nous avons analysé 100 patients avec (D21OH) avec cette méthode originale qui a été validée par comparaison à la technique de référence Sanger combinée à la MLPA. Cette comparaison des méthodes initiale (concordance > 90%) a permis d’optimiser le protocole final afin d’améliorer la détection des variants substitutions ou insertions/délétions. La détection des anomalies du nombre de copies est en cours d’optimisation et permettra éventuellement de s’affranchir de la MLPA.

Conclusion : Nous décrivons une méthode rapide et robuste d’analyse de CYP21A2 par NGS. En raison de sa facilité de mise en œuvre, cette méthode serait utilisable dans la plupart des laboratoires de génétique.

Résumé

Introduction. La cardiomyopathie dilatée (CMD) est l’une des causes principales de l’insuffisance cardiaque systolique et, de ce fait, un problème majeur de santé publique.

Objectif. Le but de cette étude était d’améliorer nos connaissances et notre compréhension des causes génétiques de la cardiomyopathie dilatée.

Méthodes. Nous avons mené une étude d’association pan-génomique, combinée à une imputation sur les données 1000Genome, pour 2719 cas sporadiques de CMD et 4440 contrôles, tous d’origine européenne, sur 9 152 885 SNPs. Cette étude d’association a été complétée par une étape de réplication des signaux significatifs dans deux autres cohortes européennes. Nous avons ensuite recherché, au sein des nouveaux loci identifiés, les meilleurs gènes candidats, en nous basant sur une stratégie de sélection dédiée. Cette stratégie inclue des recherches in silico dans les bases de données publiques (expression tissue spécifique des gènes, loci de caractères quantitatifs, QTL, liés aux niveaux d’expression et/ou de méthylation) ainsi que des analyses fonctionnelles de séquençage 4C sur des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites. Un score de risqué génétique (GRS) a également été construit à partir du nombre d’allèles à risque pour chaque locus impliqué.

Résultats. L’étude d’association génomique suivie de l’étape de réplication ont permis d’identifier deux nouveaux loci pour la CMD, en 3p25.1 (meilleur signal rs62232870 avec une p = 8.7 x 10^-11 et 7.7 x10^-4 dans les phases exploratoires et de réplication, respectivement) et 22q11.23 (meilleur signal rs7284877, avec une p = 3.3 x10^-8 et 1.4 x10^-3, dans les phases exploratoires et de réplication, respectivement), tout en confirmant deux loci précédemment identifiés, BAG3 and HSPB7. Le GRS construit à partir de ces 4 loci révèle une augmentation par plus de 3 du risque de CMD pour les individus avec 8 allèles à risque comparés à ceux n’en présentant que 5 (médiane de la population de référence) et une diminution par 5 du risque pour ceux n’en présentant qu’un. Au locus 3p25.1, notre stratégie de sélection pointe SLC6A6 comme le meilleure gène candidat. Ce gène code un transporteur de la taurine, métabolite dont l’implication dans la dysfonction cardiaque et la CMD est soutenue par de nombreuses observations chez l’homme et l’animal. Au locus 22q11.23, cette même stratégie suggère que SMARCB1 est le meilleur candidat.

Conclusion. Cette étude fournit de nouvelles pistes sur l’architecture génétique de la cardiomyopathie dilatée tout en mettant en lumière de nouvelles voies biologique sous-jacente de l’insuffisance cardiaque, avec un potentiel pour des perspectives thérapeutiques en particulier via la modulation de la taurine.

Introduction. La cardiomyopathie dilatée (CMD) est caractérisée par une dilatation ventriculaire et un dysfonctionnement systolique débutant chez l’adulte jeune et conduisant à une insuffisance cardiaque avec peu d'options thérapeutiques. Les mutations perte de fonction du gène FLNC, codant la Filamine C, y compris les mutations d'épissage, ont été fortement associées à un phénotype de CMD arrythmogène. Les cardiomyopathies liées au gène FLNC sont transmises sur un mode autosomique dominant et les mécanismes conduisant au phénotype ne sont pas entièrement compris. Des modèles in vitro sont nécessaires pour améliorer les connaissances sur les mécanismes pathogéniques. 

Méthode. Une lignée iPSc de contrôle (ICAN-403.3) a été établie à partir de fibroblastes d’un donneur sain et un sous-clone muté FLNC (ICAN-FLNC-42.1) a été dérivé en utilisant la technologie CRISPR/Cas9. Les cellules iPSc ont été ensuite été différenciées en cardiomyocytes et en pseudo-tissus battants afin d’étudier les effets fonctionnels de la mutation 

Résultats. Nous avons généré deux clones iPS, l’un dérivé de l’autre après mutation induite par réparation non-homologue de l’ADN CRISPR/Cas9 dépendante. Les clones ont été caractérisés pour leur pluripotence (immunoflurescence et qPCR de gènes exprimés à l’état pluripotent, test à la phosphatase alcaline), leur intégrité génomique (exome, caryotype) et pour leur capacité de différenciation dans les 3 feuillets (ScoreCard). Plus particulièrement, ces cellules peuvent être différenciées en cardiomyocytes battants ( > 85% des cellules expriment la troponine T) et qui présentent une striation sarcomérique par immunomarquage de l’actinine-2. Le séquençage montre que la mutation induite par CRISPR/Cas9 est une délétion de la borne 3’ de l’exon 42 du gène FLNC retrouvée à l’état homozygote (Chr7(GRCh38):g.128854898_128854915del) et sans effet hors cible mesurable après contrôle par séquençage d’exome. L’analyse par RT-PCR et immunoblot montre que la mutation induit un saut de l’exon 42 aboutissant et l’expression réduite d’une protéine de poids moléculaire abaissé. Des pseudos tissus battants enregistrés durant 3 semaines (engineered heart tissue (EHT) issus de cardiomyocytes différenciés des deux clones iPS montrent, pour le mutant, une fréquence de battement abaissée et un index d’arythmie plus élevé.

Conclusion. Nous avons développé et caractérisé au niveau moléculaire et fonctionnel un modèle d’étude iPSc-cardiomyocytes-EHTs pour une mutation saut d’exon dans le gène FLNC responsable de cardiomyopathie humaine. Ce modèle permettra d’appréhender le mécanisme patho-physiologique de la CMD due aux mutations FLNC, dans un contexte où le tissu malade est difficilement accessible. Ces modèles sont également utiles pour tester des voies thérapeutiques potentielles. 

Aminoacyl-tRNA synthetases (aaRS) are ubiquitously expressed enzymes responsible for ligating amino acids to their cognate tRNA molecules through an aminoacylation reaction. The resulting aminoacyl-tRNA is delivered to ribosome elongation factors to participate in protein synthesis. Seryl-tRNA synthetase (SARS1) is one of the cytosolic aaRSs and catalyzes serine attachment to tRNA^Ser.

SARS1 deficiency has already been associated with moderate intellectual disability, ataxia, muscle weakness, and seizure in one family. We describe here a new clinical presentation including developmental delay, central deafness, cardiomyopathy, and metabolic decompensation during fever leading to death, in a consanguineous Turkish family, with biallelic variants (c.638G > T, p.(Arg213Leu)) in SARS1.

This missense variant was shown to lead to protein instability, resulting in reduced protein level and enzymatic activity.

Our results describe a new clinical entity and expand the clinical and mutational spectrum of seryl- and aminoacyl-tRNA synthetases deficiencies.

Le gène NARS2 code pour l’Asparaginyl-tRNA synthétase mitochondriale. Les variants pathogènes dans ce gène sont associés à un large spectre de phénotypes cliniques de transmission autosomique récessive. Les tableaux varient de formes sévères d’encéphalopathies de mauvais pronostic comme les syndromes de Leigh ou d’Alpers, à des tableaux plus modérés comme une myopathie isolée ou une surdité non syndromique. À ce jour, seulement une vingtaine de cas porteurs de variants pathogènes dans NARS2 ont été rapportés et les corrélations génotype-phénotype sont compliquées. Nous rapportons ici une fratrie avec trois patients qui ont tous les mêmes variants NARS2, mais présentent une large variabilité clinique. Nous décrivons particulièrement le phénotype du patient le plus âgé ( > 45 ans) à ce jour et présentant un tableau sévère de début infantile. Ce patient a développé une surdité de perception à l'âge de 2 ans après une période infectieuse. Il a également présenté dans l'enfance des troubles cognitifs et comportementaux évoquant un syndrome frontal. À l'âge adulte, il a développé une épilepsie généralisée, une ataxie, une neuropathie axonale, une myopathie mitochondriale et un déficit de la chaine respiratoire. Il a deux sœurs qui ont également développé pendant leur petite enfance une surdité, mais l’évolution est beaucoup moins sévère que celle de leur frère. Le NGS a permis l'identification d’un variant connu comme pathogène c.822G > C dans NARS2 à l'état hétérozygote. L'analyse de couverture suivie du séquençage Sanger a révélé un nouveau variant intronique c.922-21_922-19delCTT en trans avec le c.822G > C chez les trois patients. Les analyses fonctionnelles de l’ARNm (RT-PCR) à partir des fibroblastes du patient ont montré que cette délétion affecte l'épissage, conduisant à un saut de l'exon 9 du gène NARS2. De plus, nous montrons que le c.822G > C conduit à un saut de l'exon 7, mais n'affecte pas l'exon 8, contrairement à ce qui a été rapporté. Les deux variants auraient comme conséquence un décalage du cadre de lecture et un codon stop prématuré. Tout en confirmant la complexité de la corrélation génotype-phénotype pour le gène NARS2, nos résultats suggèrent qu’il est difficile de prévoir l’évolution des patients porteurs de variants d'épissage. Ceci pourrait être dû au fait que l’épissage peut être complet ou partiel et/ou aux mécanismes de NMD (nonsense-mediated decay) et/ou à d’autres mécanismes moléculaires. La description d’autres patients avec des variants pathogènes dans le gène NARS2, notamment ceux altérant l'épissage du gène, ainsi que des études fonctionnelles complémentaires seraient d’une grande utilité pour mieux comprendre le gène NARS2 et la famille des aminoacyl-tRNA-synthétases mitochondriales et les pathologies associées.

Introduction. Les maladies auto-inflammatoires (MAI) sont liées à des anomalies génétiques de facteurs impliqués dans le système immunitaire et caractérisées par des accès inflammatoires fébriles récurrents spontanément résolutifs. Les atteintes cutanées ont une place importante dans l’orientation étiologique. Elles sont rencontrées dans les urticaires familiales au froid et les syndromes de Muckle-Wells ou CINCA (chronique infantile neurologique, cutané et articulaire) liés à NLRP3 ou plus rarement à PLCG2. Nous rapportons ici 2 patientes avec une urticaire auto-inflammatoire syndromique liée au gène LYN, un régulateur essentiel de plusieurs récepteurs de l’immunité. Deux autres patients avec des variations de LYN non explorées sur le plan fonctionnel ont été rapportés lors de congrès. Le gène LYN code pour une protéine tyrosine kinase, finement régulée au niveau post-traductionnel par la phosphorylation de deux de ses tyrosines (Y397 et Y508). Dans un modèle murin, le knock-in Y508F conduit à une hyperactivation de Lyn et au développement d’une glomérulonéphrite autoimmune sévère.

Matériel et Méthodes. Etude NGS d’un panel de gènes de MAI chez 2 patients adressés pour séquençage de NLRP3. Etudes fonctionnelles in vitro des variations LYN identifiées : phosphorylation de Lyn par western blot et activation de la voie NF-kB par essai luciférase.

Résultats. Nous avons identifié chez deux patients indépendants présentant une urticaire autoinflammatoire syndromique deux variations hétérozygotes au sein de LYN : c.1522T > C, p.(Tyr508His) de novo chez le patient 1 (P1) et c.1079G > A, p.(Arg360Gln) chez P2. P1, une enfant de 3 ans, présentait une atteinte néonatale sévère caractérisée par un important retard de croissance, une urticaire et une hépatosplénomégalie ainsi qu’une dysmorphie faciale (front bombé, hypertélorisme et exophtalmie). Les épisodes inflammatoires d’une durée d’une semaine étaient caractérisés par une fièvre élevée, des lésions cutanées, des arthrites et des troubles gastro-intestinaux, une CRP élevée et une hypercytokinémie. Un traitement par anti-IL1 a nettement amélioré sa maladie. P2, une femme de 25 ans présentait une MAI modérée ayant débuté à 14 ans avec des épisodes récurrents associant arthralgies, céphalées et atteinte cutanée et oculaire.

L’étude in vitro de la phosphorylation de Lyn portant la variation Tyr508His a montré une absence totale de la protéine sous sa forme phosphorylée inactive. L’étude de la voie de signalisation NF-kB a montré une activation constitutive de cette voie en l’absence de stimulation pour les 2 variations étudiées.

Conclusion. Cette étude permet de mieux définir le cadre nosologique des urticaires autoinflammatoires et d’en élargir le spectre phénotypique avec un régulateur immunitaire Lyn. Ce travail a permis de caractériser pour la première fois les défauts fonctionnels de 2 variations faux-sens de LYN et de démontrer l’effet gain de fonction de ces variations sur l’activation de la voie NF-kB.

Introduction : L’arthrogrypose multiple congénitale (AMC) se définit par des limitations articulaires congénitales touchant au moins deux niveaux articulaires, conduisant à des handicaps multiples. La fonction musculaire est altérée. Le but de notre étude était d’évaluer la corrélation entre l’infiltration graisseuse musculaire avec les déficiences et limitations d’activité chez des adultes présentant une AMC.

Méthode: Cette étude évalue des adultes non sélectionnés adressés au centre de références de l’AMC entre 2010 et 2020. Tous ont bénéficié d’une évaluation pluridisciplinaire, ainsi qu’une IRM musculaire corps entier. Les muscles ont été analysés grâce à l’échelle de Mercuri, quantifiant l’infiltration graisseuse. Deux groupes étiologiques ont été formés selon l’étiologie Amyoplasie et Arthrogryposes Distales (AD), les deux formes les plus communes d’AMC.

Résultats : La moyenne d’âge des 53 adultes (34 femmes) était de 34 ans, 35 avaient une Amyoplasie, et 18 une Arthrogrypose Distale. Dans les deux groupes d’individus avec Amyoplasie et AD, nous avons retrouvé une corrélation significative entre le score Mercuri moyen et l’évaluation manuelle de la faiblesse musculaire aux membres supérieurs et inférieurs. De plus, dans l’Amyoplasie, les scores Mercuri des membres supérieurs et inférieurs étaient corrélés à l’amplitude articulaire passive, le score Mercuri des membres inférieurs était corrélé au test de marche de 6 minutes, et celui des membres supérieurs à la mobilité de la main dans l’espace. Dans l’AD, ces corrélations n’ont pas été retrouvées.

Conclusion : Notre étude est la première à étudier le lien entre imagerie médicale et aspects fonctionnels dans l’AMC. L’IRM musculaire, un puissant outil diagnostic, est aussi hautement adapté pour évaluer le handicap fonctionnel. Des scores Mercuri élevés étaient corrélés à de plus grandes déficiences et une moindre mobilité.

Le Spectre Oculo-Auriculo-Vertebral (OAVS) ou Syndrome de Goldenhar est une anomalie du développement embryonnaire des premier et deuxième arcs branchiaux, principalement caractérisée par une microsomie hémifaciale associée à des malformations auriculaires, oculaires et vertébrales. L’hétérogénéité clinique et génétique de ce spectre avec une pénétrance incomplète et une expressivité variable, rendent son diagnostic moléculaire complexe. Des CNV ou SNV pathogènes ont été identifiés chez environ 15 % des patients OAVS, avec peu de loci et gènes récurrents, et environ 10% de cas familiaux. Afin de s’aventurer au-delà du monogénique, nous avons développé une approche clinico-biologique combinée. D’un point de vue clinique, nous avons standardisé les données phénotypiques des 350 patients issus de notre cohorte OAVS via l’ontologie HPO, afin d’établir une heatmap de similarité sémantique, pour rechercher des clusters phénotypiques et établir des endophénotypes au sein de la cohorte. D’autre part, d’un point de vue moléculaire, nous avons analysé conjointement 45 exomes et 5 génomes de patients OAVS en simplex, avec des approches de type test oligogénique et burden-test, incluant une comparaison à une cohorte de témoins. En effet, après la recherche de variants à effet fort, l’analyse a été étendue aux loci de plus faible pénétrance, en identifiant des combinaisons de variants altérant les protéines et raisonnablement fréquents. L’idée est d’identifier des effets combinés de petits facteurs de risque pour atteindre une puissance statistique suffisante pour identifier les gènes candidats. Nous avons confronté ces gènes à nos listes de gènes candidats pour l’OAVS et aux voies de signalisation impliquées dans le développement craniofacial. D’autres analyses multivariées combinant les études omiques mais aussi des études environnementales sont nécessaires pour décrypter les bases étiologiques de cette maladie complexe.

Le syndrome de Silver-Russell (SSR, OMIM#180860, ORPHA#813) est un syndrome (épi)génétique rare lié à l’empreinte parentale décrit pour la première fois par Silver et Russell en 1953 et 1954 respectivement. Ce syndrome se caractérise par l’association d’un retard de croissance intra-utérin et post-natal sévère, un périmètre crânien relativement préservé à la naissance, une asymétrie corporelle, un front proéminent et des difficultés d’alimentation pendant l’enfance. Le SSR est causé dans 5-10% des cas par une disomie uniparentale maternelle du chromosome 7 et un défaut de méthylation au locus IGF2/H19 dans la région 11p15 dans 40-60% des cas. Dans de nombreux cas, les causes du SSR demeurent inconnues. Les individus atteints du SSR présentent des signes cliniques variables, notamment en fonction de la cause génétique sous-jacente. Si de nombreuses avancées ont été réalisées ces dernières années concernant les connaissances médicales relatives au SSR, certains aspects du phénotype du SSR restent encore peu connus. Les descriptions du phénotype cognitif et psychosocial sont notamment peu nombreuses et reposent parfois sur la description de patients dont le diagnostic n’a pas été confirmé au niveau moléculaire. Cette étude poursuivait ainsi deux objectifs : étudier les caractéristiques cognitives, psychologiques et comportementales des adolescents et adultes porteurs d’un SSR (e.g., efficience intellectuelle, fonctions exécutives, estime de soi, qualité de vie) et d’autre part, d’identifier les facteurs associés à ces différentes caractéristiques (e.g., âge, anomalie moléculaire, traitements). Au total, 19 participants ayant un SSR (8 adolescents et 11 adultes) âgés de 13 à 39 ans, et 19 participants contrôles ont pris part à cette recherche. Nous présenterons les résultats du phénotype clinique, cognitif et psychosocial des participants ayant un SSR. Les résultats de notre étude montrent que les participants ayant un SSR présentent des capacités intellectuelles similaires à celles de la population générale. Des difficultés cognitives et psychologiques ont été retrouvées chez les participants ayant un SSR. Cependant, ces difficultés ne s’expriment pas de la même manière chez les adolescents et les adultes ayant un SSR. Une importante variabilité interindividuelle était observée dans le groupe d’adultes ayant un SSR dû à un défaut de méthylation du locus IGF2/H19 dans la région 11p15. Des liens entre le phénotype et le génotype des participants ont également été observés chez les adolescents : les adolescents ayant une mUPD7 semblaient présenter davantage de difficultés. Ces résultats offrent une meilleure compréhension du SSR et ouvrent des perspectives en matière de prises en charge du SSR.

Dans le cadre du Plan France Médecine Génomique 2025, les plateformes SeqOIA et AURAGEN proposent des séquençages très haut débit du génome dans la pratique clinique pour des indications médicales sélectionnées. Dans le domaine du cancer, deux préindications, portées par le Groupe Génétique et Cancer-Unicancer (GGC), concernent l’oncogénétique constitutionnelle et s’adressent aux patients atteints de cancer avec des antécédents familiaux très évocateurs de prédisposition et aux patients atteints de cancers isolés sur le plan familial mais de survenue très précoce et/ou multiples.

Nous rapportons ici le bilan de la Réunion de Concertation Pluridisciplinaire nationale (RCP) GGC PFMG2025 créée en 2019 avec deux objectifs : en amont, sélectionner les patients éligibles à l’analyse ; en aval, discuter des résultats du séquençage du génome et de leurs conséquences en termes de prise en charge ou d’explorations secondaires. C’est aussi une RCP de recours pour d’autres préindications lors de la découverte de données incidentes constitutionnelles sur les gènes de prédisposition aux cancers.

Elle réunit, une fois par mois en visioconférence, un assistant de RCP, les représentants des deux plateformes, les correspondants du GGC, un oncogénéticien de chaque région, les biologistes interprétateurs, et les cliniciens présentant les cas. En 2 ans, 331 familles, présentées par 36 équipes de génétique, ont été discutées en RCP d’amont. Un séquençage de génome a été retenu pour 230 d’entre elles et recusé pour 65. Pour 36 familles, des analyses ou des renseignements complémentaires ont été demandés. A ce jour, 101 dossiers complets ont été reçus sur les plateformes (38 pour AURAGEN et 63 pour SeqOIA). Les résultats de 67 familles (36 cas isolés, 31 cas familiaux) ont été discutés en RCP d’aval. Seul un nouveau variant pathogène a été identifié. Pour 41 dossiers, l’analyse s'est avérée non conclusive. Enfin, pour 25 familles des explorations complémentaires ont été demandées (étude ARN, analyse tumorale...) afin de préciser l’impact des variants identifiés.

En conclusion, avec 21 RCP réalisées depuis Septembre 2019, cette RCP remplit sa mission de sélection et de discussion des dossiers en assurant un accès au séquençage très haut débit sur tout le territoire pour les pré-indications d’oncogénétique. Le faible nombre de résultats concluants peut en partie s’expliquer par notre capacité encore insuffisante à exploiter totalement les données de séquençage du génome. La perspective de progrès dans l’analyse de ces données, en particulier pour les variants structuraux, pourrait permettre de réanalyser certains dossiers. De même, la possibilité de séquencer les tumeurs des patients, en parallèle de l’analyse constitutionnelle, serait une aide indéniable à l’interprétation. Enfin, la structuration des données collectées, à visée de recherche, est un enjeu majeur pour progresser dans le domaine des prédispositions génétiques aux cancers.

Le syndrome de Lynch (SL) est la forme la plus fréquente de cancer colorectal (CCR) héréditaire. Son diagnostic repose sur la détection d’un variant pathogène monoallélique germinal sur un des gènes de la voie de réparation des mésappariements de l’ADN (système MMR, MisMatch Repair). Les cancers de ces patients présentent un phénotype MSI (instabilité des microsatellites) et/ou une perte d’expression des protéines MMR (dMMR) en immunohistochimie (IHC). Quelques études suggèrent l’existence de cryptes coliques morphologiquement normales mais perdant l’expression d’une des protéines MMR chez les patients atteints de SL. Ces cryptes appelées « cryptes coliques MMR déficientes » seraient pathognomoniques du SL. Il y a toutefois peu de données dans la littérature, notamment sur leur fréquence précise et la manière optimale de les détecter. Les objectifs de ce travail ont été de (i) préciser les caractéristiques des cryptes dMMR chez des patients avec SL afin de proposer un protocole de détection optimal; (ii) rechercher si la détection de ces cryptes dMMR pourrait être un outil diagnostique intéressant dans les cas d’interprétation difficile comme les patients avec un syndrome de « Lynch-like » (SLL); ou lorsque le caractère pathogène du variant détecté est impossible à affirmer (variant de signification incertaine ou VSI). Tous les patients ont été sélectionnés rétrospectivement, en fonction du matériel disponible, parmi les patients atteints de CCR dMMR/MSI suivis en oncogénétique dans les hôpitaux APHP. Sorbonne Université. L’étude a porté sur 15 malades atteints d’un SL (5 MLH1 ; 7 MSH2 ; 3 MSH6); 7 malades atteints de SLL et 7 patients avec un VSI dans un gène MMR. Pour chaque patient, dix lames d’IHC ont été techniquées à l’aide de l’anticorps dirigé contre la protéine MMR perdue par la tumeur sur 1 ou 2 blocs de muqueuse colique normale adjacente et à distance du CCR. Pour chaque bloc, le nombre réel de cryptes dMMR a été comptabilisé et un ratio de cryptes (nombre de cryptes dMMR/nombre total de cryptes analysées) a été déterminé. Des cryptes dMMR ont été identifiées chez 80% des patients avec SL. Elles tendaient à être plus fréquentes au sein de la muqueuse à distance, et à augmenter avec l’âge. Des cryptes dMMR ont été identifiées chez 1 patient avec SLL, ainsi candidat pour une exploration moléculaire approfondie à la recherche d’une anomalie complexe. Enfin, des cryptes dMMR ont été identifiées chez 4 patients avec VSI constituant un argument supplémentaire en faveur de la pathogénicité des variants détectés. Notre étude a permis de confirmer la présence de cryptes dMMR chez 80% des patients avec SL et d’établir un protocole immunohistochimique de détection optimale de ces lésions. Par ailleurs, nos données suggèrent que cet outil s’avère pertinent dans les cas d’interprétation difficile comme les SLL ou VSI. La présence de ces lésions pourrait aider au diagnostic d’authentique SL même si elle n’aurait de valeur que positive.

Alors que les cellules souches pluripotentes induites (iPSCs) sont largement utilisées pour leur capacité de différenciation en tout type cellulaire, elles ne le sont que rarement pour leur capacité de méthylation de novo. C’est cette caractéristique des iPSCs que nous exploitons pour développer des modèles cellulaires d’épimutation constitutionnelle du gène MLH1 responsable de syndrome de Lynch.

Le syndrome de Lynch est un syndrome de prédisposition héréditaire au cancer, en particulier du côlon, du rectum et de l’endomètre. La plupart des patients présentent un variant génétique constitutionnel d’un gène codant l’une des protéines impliquées dans la réparation des mésappariements de l’ADN (système MisMatch Repair) : MLH1, MSH2, MSH6 ou PMS2. Cependant pour certains patients, c’est une épimutation qui est responsable du phénotype. Il s’agit alors d’une hyperméthylation du promoteur du gène MLH1 ou MSH2, associée à une inactivation transcriptionnelle du gène. Nous nous intéressons plus particulièrement aux épimutations du gène MLH1, dont les mécanismes moléculaires à l’origine de la méthylation sont mal connus. Ces épimutations peuvent être primaires, correspondant à des événements épigénétiques purs labiles dans les lignées germinales, ou secondaires, c’est-à-dire associées à une altération génétique en cis transmise à la descendance sur un mode Mendélien.

La cohorte de patients porteurs d’une épimutation constitutionnelle du gène MLH1 recrutés au CHU de Lille regroupe actuellement une cinquantaine de patients (recrutement national grâce aux généticiens moléculaires et cliniques du GGC, Groupe Génétique et Cancer). Nous avons identifié, au sein de plusieurs familles de cette cohorte, de nouveaux variants génétiques qui ségrègent avec l’hyperméthylation (Leclerc et al., Genetics in Medicine 2018). Afin de démontrer le lien de causalité entre ces variants et l’hyperméthylation, nous développons des modèles cellulaires de ces épimutations à partir d’iPSCs humaines issues de fibroblastes de donneur sain, grâce à la technologie CRISPR-Cas9.

Ces modèles cellulaires permettront également (1) de caractériser les mécanismes moléculaires impliqués dans la méthylation du promoteur du gène MLH1 ; (2) de tester de nouvelles thérapeutiques déméthylantes et des stratégies d’epigenome editing. Ces modèles seront comparés à des iPSCs issues de la reprogrammation de cellules de patients.

mail : julie.leclerc@chru-lille.fr ; julie.leclerc@inserm.fr

Introduction. Avec l’évolution des technologies de séquençage haut-débit, la détection des variants par analyse de panel de gènes dans le cadre du diagnostic génétique de prédisposition aux cancers est devenue très sensible. Cependant, ces analyses sont généralement effectuées sur la séquence codante et les jonctions intron-exon au niveau de l’ADN. L’étude des ARN messagers (ARNm) peut mettre en évidence une anomalie d’épissage causée par une mutation intronique profonde, ou une quantité d’ARNm diminuée causée par un variant pathogène dans le promoteur ou autre région régulatrice de l’expression d’un gène. Nous avons évalué deux méthodes d’analyse des ARNm par séquençage haut débit, une analyse d’un panel de gènes et une analyse globale du transcriptome, sur des échantillons avec altération d’épissage déjà identifiée par séquençage Sanger.

Matériels et Méthodes. Les ARN ont été extraits de lignées lymphoblastoïdes traitées à la puromycine. L’enrichissement et la préparation des banques ont été réalisés par la méthode SureSelect XT-HS2 RNA (Agilent) sur 16 échantillons pour un panel à façon de 62 gènes, et par le kit TruSeq Stranded mRNA (Illumina) sur 8 échantillons pour le transcriptome. Le séquençage a été effectué en High Output 2x150pb sur NextSeq 500 (Illumina) et l’analyse bioinformatique avec l’outil SpliceLauncher et visualisation sur IGV. Les variants d’épissage connus étaient sur les gènes APC (n=1), ATM (n=1), BRCA1 (n=3), BRCA2 (n=5), DICER1 (n=1), MLH1 (n=2), MSH2 (n=1), PTEN (n=1), RB1 (n=2). Les anomalies étaient variées : sauts d’une partie, d’un ou de plusieurs exons, rétentions de début ou fin d’intron, exon cryptique.

Résultats. Toutes les anomalies d'épissage attendues ont pu être visualisées sur IGV avec les deux méthodes lorsque les données étaient analysables (3 échantillons du panel de gènes n’ont pas été exploitables). Cependant, la profondeur de lecture étant plus faible en analyse de transcriptome, les jonctions anormales attendues étaient supportées par moins de 100 reads pour 3 échantillons sur 8, et elles n’auraient pas été distinguées du bruit de fond sans une recherche ciblée sur ces altérations connues. SpliceLauncher a attribué une statistique significative aux jonctions anormales attendues pour 7 échantillons sur 13 pour l’analyse en panel de gènes, et 3 sur 8 pour l’analyse du transcriptome. Il rapportait avec une statistique significative en moyenne 18 évènements d'épissage anormaux par échantillon pour le panel de gènes, et 2 évènements par échantillon pour le transcriptome.

Conclusion. Une méthode de RNAseq ciblé sur les gènes d’intérêt est aujourd’hui plus adaptée à la mise en place du diagnostic génétique de prédisposition aux cancers par séquençage haut débit d’ARNm, en complément de l’analyse génomique pour les cas fortement évocateurs. L’analyse bioinformatique reste à optimiser pour une utilisation dans un cadre diagnostique.

Background: ETV6-RUNX1 B-cell precursor leukemia (BCP-ALL) is a pediatric leukemia which emerges from a multi-hit leukemogenesis process. Schematically, two sequential genetic events occur. The first one consists in the formation of the ETV6-RUNX1 fusion gene from the t(12;21)(p13;q22) chromosomal translocation. The second event implicates abnormal high incidence of recombination events due to RAG recombinase aberrant activity (a complex composed of RAG1 and RAG2 proteins), resulting in the acquisition of secondary genetic aberrations, which leads to leukemia. Here, we questioned a putative causal and genetic direct link between those 2 events. We focused on the impact of the transcription factors ETV6-RUNX1 and RUNX1 on the upregulation of RAG1.

Methods and Results: By chromatin immunoprecipitation-sequencing, we identified two regulatory regions, a promoter at -80bp from RAG1 gene and an enhancer at -1200bp, bound by ETV6-RUNX1 and RUNX1 in human BCP-ALL patients’ pre-B blasts and pre-B cell lines. Using luciferase assays, we validated the responsiveness of these RAG1 regulatory regions to ETV6-RUNX1 and RUNX1 and determined the DNA-binding sequences of RUNX1. By CRISPR-activation assays, we determined that both chromatin regions are physiologically transcription active sites in pre-B cells and control RAG1 expression. Moreover, ETV6-RUNX1 preferentially binds the enhancer whereas RUNX1 predominantly binds the RAG1 promoter. Finally, we demonstrated that RAG1 mRNA induction caused by ETV6-RUNX1 is associated with an aberrant increase of RAG recombinase activity in pre-B lymphoblasts.

Conclusions: Our finding uncovers a genetic missing step in the multi-hit model of ETV6-RUNX1-related leukemogenesis between the ETV6-RUNX1 fusion protein, the normal RUNX1 transcription factor and RAG recombinase aberrant activity. We propose a multi-step model of ETV6-RUNX1 leukemogenesis: Step 1 consists in the ETV6-RUNX1 translocation that usually occurs in utero. In step 2, ETV6-RUNX1 and RUNX1 directly induce abnormal RAG1 expression. In step 3, a dysregulated immune response occurs during infections or inflammation. Step 4 is the cumulative action of step 2 and step 3 which results in a RAG aberrant increased activity, and generates in step 5 inappropriate genomic rearrangements that will convert the ETV6-RUNX1 preleukemic clone into overt leukemia. This finding is crucial because it genetically, functionally and causatively links two events of the multi-hit BCP-ALL leukemogenesis.

En 2017, suite à un appel à projet national lancé par le Ministère des Solidarités et de la Santé dans le cadre du Plan France Médecine Génomique (PFMG2025), les deux premiers laboratoires LBM-FMG, SeqOIA et AURAGEN, ont été sélectionnés par un jury international. Ils ont démarré leur activité en 2019, couvrant l’ensemble du territoire métropolitain et Outre-Mer, pour 61 préindications validées par la HAS dans le champ des maladies rares (MR), de l’oncogénétique et de la cancérologie. Le déploiement du séquençage à très haut débit (STHD) en diagnostic dans le parcours de soins des patients est un défi de taille à l’échelle nationale, impliquant des changements conséquents dans les pratiques médicales. Après une phase de structuration importante, la quasi-totalité des 61 préindications sont désormais opérationnelles.

Nous présentons les différentes recommandations et actions mises en place par le PFMG2025 au cours de ces deux dernières années pour faciliter le parcours de soin génomique.

Les recommandations concernent notamment les modalités de STHD chez les fœtus décédés, la gestion des données constitutionnelles pour les pré-indications de cancérologie, et l’organisation des circuits postanalytiques, par la mise en place pour les MR des Réunions d’Interprétation Clinico-Biologiques (RICB-FMG).

Les actions majeures sont : 

-          Un accompagnement individuel de chaque porteur de préindications

-          Une aide à la prescription par le financement en 2020 de 24 postes d’assistants de prescription pour 12 mois dans le champ des MR, par la DGOS dans le cadre du PNMR3, pour faciliter les prescriptions. Cette action est renouvelée en 2021 et étendue à la cancérologie.

-          Un projet pilote pour la création de 8 RCP-FMG-MR génomiques d’amont dans les MR. Après une phase d’évaluation, ce dispositif pourra être déployé sur l’ensemble du territoire.

-          Une aide à la constitution d’un réseau d’interprétateurs par la création d’un annuaire de 500 volontaires (exerçant dans 50 structures différentes, dont 44 établissements de santé) pour participer à l’analyse biologique des données de STHD et la mise à disposition d’une convention cadre, qui permet désormais aux LBM-FMG SeqOIA et de solliciter des praticiens extérieurs à leur GCS pour participer à l’activité d’interprétation de leurs données.

Des réflexions sont également actuellement en cours pour disposer d’un set minimum de données cliniques minimal pour assurer la qualité des prescriptions tout en évitant les saisies multiples et de la qualité des données pour leur réutilisation en recherche. Un projet d’interopérabilité entre les outils de e-prescription du PFMG2025 avec l’application BaMaRa de la BNDMR et le Dossier Communicant de Cancérologie (DCC) est ainsi en cours. La mise en place du Collecteur et Analyseur de Données (CAD) va également mener à des réflexions sur les futures modalités de réanalyse de données et de développement de nouveaux outils d’analyse dans le cadre du soins.

Les sarcomes des tissus mous (STM) représentent 1% des cancers de l’adulte et 15% des cancers de l’enfant. Malgré un traitement locorégional bien conduit, 40% des patients vont développer une rechute métastatique. Les options de traitement sont alors limitées et la médiane de survie chez ces patients reste faible (entre 12 et 18 mois) sans amélioration depuis les années 1970. Des travaux récents ont mis en évidence que la réalisation d’un séquençage génétique peut permettre d’identifier une altération génomique actionnable chez près de 50% des patients atteints de STM. 

L'essai MULTISARC est un essai clinique multicentrique national randomisé de médecine génomique personnalisée incluant des patients atteints de STM avancés avec deux bras : « avec séquençage » versus « pas de séquençage ». MULTISARC est un des 4 projets pilote du Plan France Médecine Génomique 2025 visant à identifier et lever les verrous technologiques qui pourraient bloquer le déploiement du diagnostic génétique dans le cadre d’un parcours de soin opérationnel et efficace. Pour répondre à l’objectif principal qui est d’évaluer la faisabilité du séquençage de l’exome et du transcriptome avec diffusion de résultats dans un délai de 7 semaines, le circuit biologique suivant a été mis en place. Les échantillons prélevés sur différents centres sont qualifiés et techniqués sur la plateforme de biologie de l’Institut Bergonié (IB) ; l’ADN et l’ARN extraits sont séquencés sur la plateforme de séquençage d’Evry ; les résultats sont traités par la plateforme bio-informatique de l’IB avec des critères précis et présentés de façon structurée aux biologistes via un outil d’aide à l’interprétation, GenVarXplorer développé à l’IB. Ce même outil permet également une présentation des variants génétiques d’intérêt diagnostique ou thérapeutique en réunion de concertation pluridisciplinaire afin de proposer un accès à des molécules ciblées dans chacun des sous-essais de MULTISARC en fonction des altérations mises en évidence.

Cet essai permettra également de déterminer si le choix des traitements guidé par le séquençage génomique est une stratégie qui améliore la survie des patients. Ainsi, grâce à un partenariat public-privé avec 4 industriels, 10 thérapies ciblées sont disponibles en monothérapie ou en combinaison dans le cadre de sous-essais de phase II dont l’objectif est d’évaluer l’efficacité de la thérapie ciblée en évaluant le taux de non-progression à 6 mois.

Grâce aux efforts de toutes les équipes impliquées depuis la mise en œuvre de l'étude en octobre 2019, 160 patients ont été randomisés dans les 15 centres ouverts aux inclusions dont 80 patients sont randomisés dans le bras « avec séquençage ». Les échantillons de 83 patients ont été analysés. Parmi eux, 42 ont au moins une altération « ciblable » dans le cadre de l’essai, au sein desquels 12 d’entre eux ont terminé leur première ligne de traitement et ont donc ainsi pu être inclus par la suite dans un des sous-essais de phase II.

Certaines situations évocatrices d’une prédisposition au cancer restent inexpliquées malgré les diagnostics moléculaires reposant sur le séquençage des régions codantes de panel de gènes. L’exploration du génome indique que persistent des facteurs génétiques fortement pénétrants pouvant expliquer la multiplicité des cancers individuels ou dans une famille. En effet, les variations structurales ou changements de copie de gènes (SV et CNV), ou bien les éléments mobiles, dans des zones régulatrices de l’expression sont autant d’évènements complexes peu accessibles par les techniques conventionnelles de séquençage. Nous avons évalué la capacité du séquençage en lectures longues après enrichissement des locus entiers d’un panel de gènes à détecter ces évènements complexes. L’ADN de témoins sélectionnés sont : 13 CNV (8 délétions, 5 duplications), 8 Indels (dont une sur un pseudogène), 1 insertion de séquence Alu (insAlu) et 2 SV potentiels. Les locus de gènes ont été enrichis deux fois avec des sondes de capture après multiplexage de 4 ou 12 échantillons. Le séquençage a été réalisé sur un Sequel II en HiFi. Les read consensus ont été générés par CCS, puis démultiplexés (Lima). Après alignement (pbmm2), l’appel des variants a été réalisé avec HaplotypeCaller (HC), DeepVariant (DP) et pbSV. Le multiplexage avant capture de 12 échantillons montre les meilleures performances avec en moyenne 15x de couverture pour un on target de 14% et une longueur de lecture de 6 350pb (min=4 250 max=14 350), un échec de séquençage (1 CNV). L’ensemble des indels sont détectées par notre analyse ainsi que l’insAlu. Parmi les CNV intragéniques, six sur sept sont identifiés par notre approche. Les CNV touchant le locus entiers (n = 2) et les CNV dont au moins une extrémité dépasse probablement le locus (n = 3), n’ont pour l’instant pu être confirmés. Sur les 2 SV potentiels, un SV est pleinement caractérisé par notre pipeline, le second présente une séquence sur l’alignement mais n’est pas appelé. Au final notre approche permet de détecter la majorité des évènements complexes et son utilisation en routine diagnostique nécessite une amélioration des performances de capture et une optimisation du pipeline bioinformatique pour intégrer des approches de comptage des lectures. Notre approche autorise l’intégration dans le séquençage des régions de régulation à distance des gènes une fois leurs annotations maitrisées afin d’améliorer encore le rendement diagnostique dans ces situations à risque de cancer.

Introduction : Le séquençage du génome court fragment (GS), notamment en trio (GSt), est en passe de devenir le gold standard du diagnostic moléculaire des maladies mendéliennes associées aux troubles du neurodéveloppement (TND). En effet, le GS apporte actuellement un rendement diagnostique supplémentaire d’environ 10 % par rapport au séquençage d’exome en permettant notamment d’analyser les variations dans les régions non codantes et les variations de structure. Cependant, le défi majeur du GS reste l'interprétation clinico-biologique de ces nombreuses variations. Le RNA-sequencing (RNAseq) peut compléter le GS par une analyse quantitative et qualitative (gène de fusion par exemple) de l’ensemble des ARN, permettant d’explorer les conséquences transcriptionnelles des variations identifiées par GS, en particulier des VSI (variations de signification incertaine), avec un rendement diagnostique supplémentaire d’environ 7.5% à 36% par rapport au GS seul. Ce taux variable dépend des maladies rares explorées et du tissu utilisé.

Notre objectif était d’évaluer l’apport supplémentaire du RNAseq-solo dans le diagnostic moléculaire des TND à partir d’ADN et d’ARN sanguins.

Méthodes : Entre octobre 2018 et octobre 2019, 61 patients atteints de TND sans diagnostic moléculaire après séquençage haut débit (pannels ou exome) ont été inclus. L’analyse des données a suivi 3 stratégies distinctes : GSt, GSt+RNAseq-solo et GS-solo+RNAseq-solo. Pour chaque patient, les stratégies ont été réalisées avec une double lecture et en aveugle. Les résultats ont été discutés et comparées entre eux lors de réunion de levée d’aveugle.

Résultats : les données de RNAseq n’étant pas disponibles pour 8 patients (mauvaise qualité d’ARN ne permettant pas le séquençage), 53/61 patients (87%) ont bénéficié des 3 stratégies d’interprétation. La cause moléculaire a été identifiée chez 6/53 patients (11 %), dont 5/6 retenus par les 3 stratégies. Chez le 6^ème patient, seule la stratégie GSt+RNAseq-solo a permis l'identification d'un variant intronique profond causal entrainant l’activation d’un site cryptique d’épissage et la création d’un exon cryptique. Des VSI ont été identifiées chez 21/53 patients (40%). Pour 12 SNV survenus de novo et retenus par la stratégie GSt seule, le RS-solo a exclu un effet sur l'épissage, ne donnant pas d’argument pour leur causalité.

Conclusion : Le GSt est une stratégie efficace pour résoudre les cas négatifs après ES, puisque la cause moléculaire a été identifiées dans 6/53 cas (11%). Bien que l’apport supplémentaire du RNAseq sur sang semble être faible chez les patients atteints de TND (1/53 ; 2%), il semble très utile pour l'interprétation des variations introniques (12/53 ; 23%), qui représenteraient la majorité des variations identifiées par GS.

Les réarrangements chromosomiques en 1q21.1 sont associés à un large spectre phénotypique, allant d’un phénotype normal à une déficience intellectuelle légère à modérée avec anomalies congénitales variables et dysmorphie. Ils sont souvent hérités de parents sains et le conseil génétique est difficile.

Nous décrivons les données d’une cohorte de 34 patients avec un Copy Number Variation (CNV) en 1q21.1, comprenant 24 duplications, 8 délétions et 2 triplications et rapportons les données de 208 cas décrits dans la littérature. Les objectifs étaient d’identifier les éléments cliniques les plus souvent associés à ces déséquilibres et déterminer l’expression phénotypique chez les cas, étant donné la difficulté de prédire leur pathogénicité, comprendre leur implication dans le phénotype des patients et apporter une aide au conseil génétique et des recommandations dans le cadre du diagnostic prénatal.

La majorité des patients présentaient un retard de développement ou un retard des apprentissages et des anomalies neuropsychiatriques. Des anomalies cardiaques étaient fréquemment décrites. La dysmorphie commune entre les trois CNV comprenait un hypertélorisme, un nez bulbeux et un front proéminent. Ces CNV étaient principalement hérités de parents apparemment sains et presque la moitié était distaux, chevauchant une région minimale commune de 1,2 Mb. Des anomalies échographiques étaient observées jusque dans 25% des cas.

Nous avons précisé les conséquences de ces CNV et confirmé qu’ils sont pathogènes, malgré l’expressivité variable et la pénétrance incomplète associées. Un suivi à long terme incluant le dépistage des anomalies cardiaques et neuropsychiatriques chez tout patient nouvellement diagnostiqué est recommandé, ces atteintes étant fréquentes. Le conseil génétique dans le cadre du diagnostic prénatal doit être discuté en considérant l’impossibilité de prédire les atteintes que présentera un fœtus ni leur sévérité, mais une interruption médicale de grossesse peut se discuter en présence de facteurs de sévérité ou de mauvais pronostic.

Contexte : L’étude du génome en NGS améliore la connaissance des grands réarrangements génomique et les limites de résolution de l’observation des chromosomes du caryotype : nouvelles clefs pour comprendre les relations génotype phénotype . l’ACPA pour le diagnostic de la déficience intellectuelle et ou des syndromes malformatifs, identifient des variations de nombre de copie (CNVs) de taille variable : taille d’un exon à celle d’un chromosome. L’interprétation de la pathogénicité des CNVs repose sur plusieurs critères (taille, composition en gène, transmission etc) cf guides de bonne pratique en ACPA. Cependant il persiste des interrogations sur la pathogénicité de grand CNVs, type CNVs de plus de 3 Mb hérités de parents normaux. Ces doutes peuvent survenir dans un contexte d’urgence notamment le diagnostic prénatal. Il existe très peu de données dans la littérature sur des cohorte de sujets Européens proche de nos patients.

Méthode : En l’absence d’une base de données de CNVs de sujets normaux pour notre population, nous avons lancé un projet collaboratif au sein de l‘ACLF et du réseau Achropuces afin d’initier le bilan de la distribution des CNVs par taille et par chromosome observés dans les analyses réalisées depuis 2007. La 1ére étape a permis de recueillir dans nos différents centres les données des CNVs de 71357 dossiers afin d’en évaluer la distribution des taille. et la proportion globale de grand CNVs à propos et 207000 CNVs. Nous avons ensuite collecté les observation des grands CNVs Hérités.

Résultats : Durant la 1ere  phase 207000 CNVs ont été détectés. Parmis ces CNVS plus de 12 % ont une taille supérieure à 1 Mb, dont environ 56 % ont une taille entre 1 et 2 Mb, 22 % entre 2 et 3 Mb, 18,5 % plus de 3 Mb, 13 % plus de 5 Mb et 7 % ont plus de 10 Mb de taille. Durant la 2ème étape nous avons pu collecter les données des observations de 86 patients porteurs de grands CNVs de plus de 3 Mb avec 40 délétions et 44 gain respectivement, hérités d’un parent dont le phénotype est dit sain. Le mode de transmission est plus fréquemment d’origine maternel en cas de duplication. Nous allons détailler le phénotype des parents et enfants et discuter les discordances des phénotypes afin d’en trouver les causes. Une première étude a été basée sur 26 dossiers de patients avec des CNVs supérieurs à 5 Mb. Les tailles moyennes des CNVs de plus de 5 Mb sont globalement de 10,21 Mb pour les duplications et de 8,9 Mb pour les délétions. Une étude clinique et biologique des 86 familles est maintenant proposée avec de nouveaux cas associés. Toutes les paires chromosomiques sont représentées excepté les chromosomes 17 dans cette cohorte de grands CNVs. Les résultats de cette étude collaborative au sein du réseau de nos laboratoires  et de nos cliniciens sont discutés à travers les données de la littérature. 

L’exposition aux radiations ionisantes reçues au cours d’examens diagnostiques est un facteur de risque de cancer du sein. Ce risque augmente avec l'augmentation des doses reçues à la poitrine et diminue quand l'âge aux expositions augmente. Cette association entre exposition aux radiations ionisantes et cancer du sein semble également varier en fonction de la présence ou non d’une prédisposition familiale au cancer du sein. En effet, une augmentation du risque associée aux radiographies pulmonaires a été montrée chez des femmes ayant une mutation sur les gènes BRCA1 ou BRCA2 (BRCA1/2) comparé aux non-porteuses. Très peu d’études sur l’effet de ces expositions chez les femmes ayant une prédisposition au cancer du sein et avec un test BRCA1/2 négatif existent.  L'effet des expositions aux radiations ionisantes dans un tel contexte est donc inconnu et son évaluation pourrait avoir un intérêt clinique.

Par conséquent, nous avons évalué l'effet de l'exposition aux radiations à faible dose chez des femmes non porteuses d’une mutation BRCA1/2 de l’étude GENESIS. Nous avons également évalué si le fait de porter un variant rare, vraisemblablement délétère, dans un gène de la réparation de l'ADN autre que BRCA1/2 modifiait l'effet de l'exposition aux radiations. Les femmes de GENESIS atteintes d’un cancer du sein ont été identifiées par les consultations d’oncogénétiques du Groupe Génétique et Cancer (Unicancer). Les témoins sont des amies ou des collègues des cas appariées sur l’année de naissance des cas à +/- 3 ans.

Nous avons comparé les radiations reçues à la poitrine de 1 552 cas de cancer du sein et 1 363 témoins. Les participantes à l’étude ont renseigné leurs antécédents d'expositions aux radiations dans un questionnaire détaillé standardisé. 74% d’entre elles ont été séquencées pour 113 gènes de la réparation de l'ADN. Des modèles de régression logistique et multinomiale ont été utilisés pour évaluer les associations avec le cancer du sein.

Avoir été exposée aux radiations ionisantes au thorax multiplie par deux le risque de cancer du sein (odds ratios (OR):2,05; 95%IC:1,55-2,73), avec une augmentation du risque de 3% par exposition (OR:1,03; 95%IC:1,01-1,04). Avoir 20 ans ou moins lors de la première exposition ou avoir été exposée avant la première grossesse menée à terme ne semble pas modifier ce risque. Etre née après 1960 (OR:2,54; 95%IC:1,63-3,98) ou être porteuse d’un variant rare dans un des gènes de la réparation de l'ADN (OR:3,31; 95%IC:2,14-5,12) modifie l'effet de l'exposition aux radiations (P_{hétérogénéité}=0,024 et 0,0038 respectivement). Le risque associé à ces expositions est multiplié par environ 5 chez les femmes porteuses de 3 variants ou plus (OR:4,61; 95%IC:2,34-9,08) comparé aux non porteuses.

Ces résultats suggèrent que les techniques d'imagerie par rayonnements ionisants devraient être évitées autant que possible chez les femmes à haut risque de cancer du sein testées négatives pour une mutation BRCA1/2.

Nous aborderons dans cette présentation, les enjeux psychologiques et éthiques de l’indétermination de sexe à la naissance.

L’essentiel de notre réflexion sera autour de l’identité : Comment (ade)venir  au monde quand on ne peut pas être pensé, nommé, prénommer ? Qu’est-ce qui détermine notre identité ? ou l’identité est-elle possible sans être sexuée ? cela nous amenera a discuter de la normalité, de l’anormalité et du pathologique. Nous aborderons enfin la notion d’autonomie avec la question du consentement libre et éclairé. Quel consentement est-il possible d’obtenir ? Celui des parents pris dans la déflagration de la découverte et l’annonce de l’intersexualité à la naissance ? Celle du bébé, futur enfant, adolescent, adulte ?  

Introduction: La “Shared Decision Making” (SDM) est un modèle de prise de décision partagée utilisé dans le contexte clinique, selon lequel le professionel de santé et le patient échangent activement des informations et examinent ensemble les différentes options de traitement et/ou de prévention dans le but de prendre ensuite une décision en partenariat (Gerber, et al 2014). Pour que cette démarche ait du succès, il faut que le professionel de santé crée un climat de confiance permettant au patient de s’exprimer librement. Lorsque le professionel de santé utilise des outils décisionnels, la démarche “SDM” permet au patient d’en apprendre davantage sur sa maladie, l’encourage à collaborer et l’aide à formuler ses préférences, notamment celle de s’orienter sur la réalisation d’un test génétique. Objectif: Nous avons décidé d’évaluer la “prise de décision” en oncogénétique par les patients suite à leur entrevue avec un conseiller en génétique. Nous nous proposons de comprendre quelles stratégies sont disponibles pour optimiser et améliorer la prise de décision dans les consultations en oncogénétique. Méthodologie: Nous avons réalisé un questionnaire anonymisé comprenant 17 questions sur la prise de décision, que nous avons soumis à nos patients sur une période de 2 mois. Les patients pouvaient répondre au questionnaire soit directement à l’issue de la consultation, soit le retourner par email. Résultats: 50 patients ont accepté de participer à cette étude qui a eu lieu en Suisse. Il ressort que de manière générale, la prise de décision est un acte devant être réfléchi, mais qui n’est pas forcément aisé du point de vue du patient. Nous préciserons la satisfaction du patient vis-à-vis de l’aide reçue et partagée avec le professionel de santé, les motivations qui influencent la prise de décision (composante familale, agressivité de la tumeur), et de l’impact de la culture et de la religion du patient pour la réalisation de tests génétiques. Conclusions: Bien que la démarche sur la prise de décision soit appropriée sur le plan éthique, les patients sont rarement associés à la “prise de décision” comme ils le souhaiteraient. Son application dépend avant tout de l’attitude et des compétences du professionel de santé, et des facteurs familiaux et culturels. Il est important que la démarche en “prise de décision” soit mise en œuvre avec souplesse, car les besoins des patients peuvent changer avec le temps et ils sont différents d’un patient à l’autre. 

La gangliosidose à GM1 est une maladie de surcharge lysosomale, due à des mutations bi-alléliques inactivatrices au sein du gène GLB1, qui code pour la beta-galactosidase. Cette enzyme lysosomale permet de cliver les résidus beta-galactosyl des gangliosides à GM1 et de certains glycoconjugués. Le déficit en beta-galactosidase entraîne une accumulation intra-cellulaire de gangliosides, notamment au niveau cérébral, responsable d’une neuro-dégénérescence.  A ce jour, aucun traitement curatif ayant prouvé son efficacité n’a été approuvé dans le cadre de cette maladie. Le développement de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de cette pathologie représente donc un véritable enjeu. Quelques essais thérapeutiques sont en cours, dont un essai de thérapie génique actuellement en phase d’évaluation clinique en Europe et aux Etats-Unis, basé sur l’apport d’une copie saine exogène du gène GLB1 par vecteur AAV (FR0013233475 – LYS).

Nous rapportons ici le cas d’un enfant porteur d’une gangliosidose à GM1 de forme infantile tardive (type II), hétérozygote composite pour le gène GLB1 (GLB1/NM_000404 c.75+2dup, c.907G > A), pour lequel nous avons étudié le développement d’une toute nouvelle stratégie de thérapie génique. Cette thérapie repose sur l’édition du génome dans le but de corriger directement dans l’ADN endogène du patient les mutations génétiques responsables de la pathologie. Nous utilisons deux outils d’édition du génome de dernière génération, le « base editing » et le « prime editing », respectivement surnommés « CRISPR 2.0 » et « CRISPR 3.0 ».  En effet, le 26 juin 2021, il a été démontré qu’une autre pathologie héréditaire, l’amyloïdose à transthyrétine, pouvait être prise en charge avec succès in vivo par la technologie CRISPR (en injection intra-veineuse chez les patients), ouvrant la voie à des perspectives thérapeutiques inespérées pour les patients souffrant de maladies génétiques rares ou orphelines.

L’analyse de l’ADN fœtal libre circulant (cffDNA) est réalisée dans les laboratoires de diagnostic pour les suspicions d’aneuploïdies, de génotypage RhD et de détermination du sexe fœtal. L’application de l’étude du cffDNA au diagnostic non invasif (DPNI) des maladies monogéniques reste une exception et la plupart de ces applications se concentrent sur l’exclusion des maladies à risque de transmission paternelle. Seuls quelques laboratoires proposent le DPNI d’exclusion dans un cadre de diagnostic de routine à ce jour, mais aucun en France. Dans nos précédentes publications (1,2), nous avons décrit un protocole expérimental standardisé pour la détection qualitative non invasive de variants pathogènes paternels ou de novo par droplet digital PCR.

Depuis janvier 2017, 198 demandes de DPNI concernant 175 familles nous ont été adressées pour lesquelles 202 tests ont été réalisés. Les indications incluaient les grossesses présentant un risque de 25 ou 50 % de maladie monogénique à risque de transmission paternelle ainsi que les grossesses associées à un risque accru de maladie monogénique dû à un variant de novo, soit en raison de signes d'appel échographiques soit d'un éventuel mosaïcisme germinal parental dans le contexte d'un enfant précédemment atteint. Le temps moyen de développement de nouveaux tests était de 14 jours [7-43] entre la commande du test et la validation des contrôles qualité. Les tests ont été conçus et validés pour 57 variants dans 16 gènes différents, en plus des 24 tests développés pendant l'étude de validation (1,2). Deux demandes ont été spontanément annulées et dans un seul cas, le test ciblant le variant c.2033dup dans le gène NF1 n'a pas pu être conçu en raison d'un motif de répétition polyC. Au total, 193 résultats (98,5 % des DPNI) ont été rendu en une moyenne de 6 jours et un prélèvement invasif a pu être évité pour 119 familles. Aucun faux positif ni faux négatif n’a été rapporté.

Nous avons mis en œuvre avec succès une méthode de DPNI d'exclusion efficace, robuste, rapide et abordable de variants paternels ou de novo et proposons ce test dans notre arsenal diagnostique. Le court délai d'exécution n'a eu aucun impact sur la prise en charge conventionnelle des patients en cas de besoin. Elle a été largement adoptée par les couples et les cliniciens, l'éligibilité pouvant être étendue théoriquement à toute maladie monogénique.

(1) Gruber A, Pacault M, El Khattabi LA, Vaucouleur N, Orhant L, Bienvenu T, et al. Non-invasive prenatal diagnosis of paternally inherited disorders from maternal plasma: detection of NF1 and CFTR mutations using droplet digital PCR. Clin Chem Lab Med. 25 avril 2018 ;56(5):728–38.

(2) Orhant L, Anselem O, Fradin M, Becker PH, Beugnet C, Deburgrave N, et al. Droplet digital PCR combined with minisequencing, a new approach to analyze fetal DNA from maternal blood: application to the non-invasive prenatal diagnosis of achondroplasia. Prenat Diagn. mai 2016;36(5):397–406.

Introduction

Le séquençage à haut débit (NGS) en panels larges, exomes ou génomes entraîne la caractérisation d’un nombre croissant de variants dont il convient d’interpréter la pathogénicité en vue d’établir leur utilité clinique. L’enjeu actuel n’est plus la génération des données mais bien leur analyse, leur filtration et l’interprétation de variants sélectionnés. L’ANPGM a construit deux parcours de formation académique, CLIN-NGS à destination des cliniciens prescripteurs, et BIO-NGS, formation technique et scientifique sur l’analyse de variants issus de NGS d’exome ou de génome, à destination des biologistes et généticiens médicaux.

Méthodologie

Chaque parcours de formation est spécifique : CLIN-NGS, en e-learning, comprend 3 séquences dédiées à la juste prescription, la présentation technique et l’analyse des résultats. La formation BIO-NGS fait, elle, intervenir 30 oratrices et orateurs, impliquant 8 sociétés savantes ou groupes professionnels dont l’ANPGM mais également l’association BioInfoDiag, le réseau AchroPuce, le réseau NGS-Diag, l’ACLF (Association des Cytogénéticiens de Langue Française), le GGC (Groupe Génétique et Cancer), les filières de santé Maladies Rares et le GFCO (Groupe Francophone de Cytogénomique Oncologique). Ces deux formations sont organisées sous l’égide de la FFGH (Fédération Française de Génétique Humaine), et agréées pour le DPC (Développement Professionnel Continu) sur la base des orientations nationales prioritaires. La formation CLIN-NGS est disponible par périodes de 3 mois plusieurs fois dans l’année, tandis que pour BIO-NGS, deux sessions sont organisées chaque année (printemps-automne).

Progression pédagogique

Si CLIN-NGS, condensée en 3 heures, aborde les notions essentielles du séquençage haut débit, la formation BIO-NGS permet quant à elle sur 14h de formation de s’approprier en profondeur les subtilités du séquençage haut débit, parmi lesquelles un état des lieux des technologies, des stratégies d’analyse des données et pipelines bioinformatiques, les recommandations d’interprétation des variants, ainsi que les notions de pénétrance incomplète et de facteur de risque. La formation comprend également des ateliers pratiques simultanés d’analyse de données (exomes/génomes/RNA-Seq) illustrés par des cas cliniques, organisés par filières de maladies rares ou de dispositifs nationaux (oncogénétique, génétique tumorale).

Résultats

Concernant CLIN-NGS, plus de 60 cliniciens se sont formés sur 18 mois, tandis que pour BIO-NGS, en deux sessions de formation, plus de 140 professionnels ont suivi l’entièreté de la formation. Ils proviennent de l’ensemble des filières maladies rares ou cancer, et présentent l’ensemble des statuts (PUPH, MCUPH, Assistant et CCA, internes et ingénieurs). Les objectifs des formations, le profil des apprenants, les résultats des évaluations pré- et post-formation ainsi que ceux des questionnaires de satisfaction seront présentés.

Contexte : BAP1 (BRCA1-Associated Protein 1) est un gène suppresseur de tumeur. A l’état constitutionnel, des variants avec perte de fonction prédisposent à un syndrome tumoral (mélanome et cancer du rein).

Méthodes : Grâce à une collaboration internationale, nous avons recruté 11 individus atteints d’un trouble du neurodéveloppement, porteurs d’un variant hétérozygote faux-sens de novo de BAP1, probablement pathogène et affectant le domaine catalytique de la protéine dans 10/11 cas. A partir de lymphocytes T d’individus atteints, nous avons évalué l'impact des variants sur la stabilité et l'activité déubiquitinase de BAP1, en testant la restauration par transfection de constructions ADNc sauvages et mutantes de BAP1. Des analyses par CHiP-Seq des cellules mononucléées sanguines ont permis de déterminer l’impact épigénétique des variants.

Résultats : L'analyse fonctionnelle a révélé que les variants faux-sens de BAP1 localisés dans le domaine catalytique altèrent la déubiquitination de l’histone H2A dans le modèle cellulaire et dans les cellules T isolées des enfants atteints, suggérant ainsi une perte de fonction de BAP1. L’analyse par ChIP-seq de l'acétylation de l'histone H3 K27 a indiqué que les variants de BAP1 induisent des modifications de l'état de la chromatine à l'échelle du génome, avec un enrichissement en gènes appartenant au système ubiquitine-protéasome.

Conclusions : Ces résultats permettent de définir un nouveau syndrome en lien avec des variants faux-sens de BAP1. Ces variants modifient le remodelage de la chromatine par une ubiquitination anormale des histones et entraînent une probable dérégulation transcriptionnelle de nombreux gènes du développement. BAP1 fait désormais partie des rares exemples de gènes dont différents variants peuvent entraîner à l’état constitutionnel soit un trouble du développement, soit une prédisposition tumorale.

Introduction

Les troubles spécifiques du langage et des apprentissages (TSLA) touchent environ 5 à 10 % des enfants en âge scolaire, soit un à 2 enfant par classe (source : site du ministère de la santé et des solidarités). Ils correspondent à une atteinte d’une fonction cognitive spécifiques et sont divisés en 5 catégories : la dyslexie, la dysphasie, la dyspraxie, la dyscalculie et le TDAH (DSM-5). De réelles avancées de diagnostics cliniques et de prise en charge ont eu lieu ces dernières années grâce à une meilleure description de ces troubles dans le DSM-5 et l’avènement des prises en charge rééducationnelles (neuropsychologie, orthophonie, ergothérapie, orthoptie, etc).

En France, en l’absence de diagnostic syndromique évident, une Analyse Chromosomique sur Puce à ADN (ACPA) peut être proposée, plus ou moins associé chez les filles à la recherche d’un syndrome de l’X fragile. Néanmoins, les exemples de gènes décrits dans la DI et également décrits chez des patients avec TSLA se multiplient. Quelques équipes internationales ont proposé une analyse d’exome chez les enfants ou adultes présentant des TSLA sévères, et identifient un certain pourcentage de patients avec une maladie monogénique, dans des formes familiales ou sporadique.

Matériel et Méthodes

Dans ce contexte, nous avons initié un projet pilote dans le cadre du soin, visant à proposer une analyse d’exome chez les enfants ou adultes adressés en consultation de génétique pour bilan de TSLA sévères bien documentés. Une approche en trio est proposée pour les cas sporadiques et une approche d’apparentés distants pour les cas familiaux.

Résultats

A ce jour, 40 patients ont été inclus, 26 cas sporadiques, 14 formes familiales. Tous les patients présentent une atteinte multidys, à l’exception de 4, qui présentent un TSLA simple. 20 patients présentent également un trouble déficit de l’attention avec hyperactivité. Parmi les 25 patients analysés, des variations probablement pathogènes ont été identifiées chez 2 patients (gène CDK13 et SMARCC2) et des variations de signification inconnue dans des gènes d’intérêt ont été identifiés chez 9 patients (CACNA1E, SCN8A, SMC3, HCN1, CREBBP, HIVEP2, MED12, JMJD1C, CLIC2, TRAPP et GRIN2B).  Un bilan neuropsychologique est proposé au parent porteur de la variation candidate le cas échéant en l’absence de phénotype de TSLA sévère à l’interrogatoire, pour aider à la classification des variations.

Discussion

Les gènes identifiés sont des gènes d’expression cérébrale mais impliqués dans des phénotypes habituellement plus sévères, en faveur d’un élargissement du spectre phénotypique, ou des gènes non OMIM morbide. Ces résultats préliminaires suggèrent également un taux diagnostic supérieur chez les patients multidys ou présentant des troubles du comportement associés. L’augmentation du nombre de patients étudiés pourra permettre d’affiner ces résultats, et de déterminer la place à donner au séquençage de l’exome dans les TSLA.

Des mutations du gène PQBP1 (Polyglutamine-binding protein 1) sont responsables d’une forme de déficience intellectuelle (DI) liée à l'X, le syndrome de Renpenning. PQBP1 code une protéine impliquée dans la régulation de l’expression des gènes au niveau transcriptionnel et post-transcriptionnel. Pour étudier les conséquences des mutations dans PQBP1, nous avons réalisé des études transcriptomiques dans 1) des lignées cellulaires lymphoblastoïdes (LCL) de patients portant des variants pathogènes de PQBP1 et 2) dans des cellules souches neurales humaines (hNSC) où PQBP1 a été inactivé (knock-down, KD) avec un siRNA. Ceci a conduit à l'identification d'une centaine de gènes dont l'expression est dérégulée. En particulier, nous avons identifié une augmentation de l'expression d'une isoforme non canonique d'un autre gène de DI lié à l'X, UPF3B_S. 

UPF3B joue un rôle crucial au cours du développement du cerveau et est un acteur important du système NMD (Nonsense mRNA Mediated Decay). Afin d'étudier le rôle de l’isoforme UPF3B_S, actuellement inconnu, nous avons comparé son interactome protéique et celui de l’isoforme UPF3B_S. Nous avons confirmé que, si UPF3B_S interagit toujours avec les complexes exon-jonction (EJC), elle n'interagit pas avec les autres protéines du NMD (UPF2 et UPF1), ce qui pourrait suggérer en effet dominant négatif de cette isoforme. Cependant, aucune diminution notable du système NMD n'a été observée dans les LCL du patient ou dans les cellules KD pour PQBP1. Le rôle d’UPF3B_S reste inconnu mais nous avons identifié plusieurs interacteurs protéiques spécifiques à cette isoforme, dont certains impliqués dans la réponse immunitaire.

En parallèle, nous avons utilisé l'augmentation de l'ARNm d’UPF3B_S comme marqueur moléculaire pour tester la pathogénicité des variants de signification inconnue identifiés dans PQBP1 chez des individus avec DI. Nous avons pu confirmer cette augmentation d’expression dans les LCL d’autres patients porteurs de variants pathogènes et mis au point des études de complémentation dans des cellules HeLa en surexprimant l'ADNc de PQBP1 sauvage ou muté. Ces approches nous ont permis d’étudier l’effet d’une dizaine de variants faux-sens de signification inconnue. Enfin, nous avons validé que cette augmentation pouvait être mise en évidence directement sur un prélèvement sanguin (Paxgene). Nous avons montré que ces trois approches étaient efficaces pour tester l'effet des variants, du moins pour les variants situés sur le côté C-terminal de la protéine, la dernière étant plus compatible avec une pratique diagnostique en milieu hospitalier.

En conclusion, nos travaux, étudiant comment une perte de fonction de PQBP1 peut affecter l'expression des gènes, et en particulier l'isoforme UPF3B_S, nous renseigne sur les mécanismes pathologiques impliqués dans le syndrome de Renpenning mais permet également de proposer un test fonctionnel pour les variants de signification inconnue identifiés dans PQBP1.

Le facteur de transcription ARX (Aristaless-Related Homeobox) joue un rôle fondamental dans le développement cérébral. Le phénotype des hommes hémizygotes porteurs de variants pathogènes dans ce gène est bien connu : tous présentent une déficience intellectuelle (DI) et/ou une encéphalopathie épileptique, associée ou non à des malformations cérébrales (anomalies du corps calleux, troubles de la gyration). Les femmes hétérozygotes sont asymptomatiques dans la grande majorité des cas. Cependant, dans les formes familiales, certaines femmes conductrices ont été rapportées avec une DI et/ou une agénésie du corps calleux (ACC). De plus, 7 cas sporadiques de patientes avec des troubles du neuro-développement ont été rapportés dans la littérature avec un variant pathogène de novo du gène ARX.

Afin de préciser le phénotype des femmes présentant une mutation pathogène du gène ARX (à l’exclusion des expansions des chaînes polyA), nous avons collecté les données cliniques et génétiques de 8 nouvelles patientes dont le variant ARX est survenu de novo, et avons fait une revue de la littérature des 63 cas féminins déjà rapportés (56 cas familiaux et 7 cas de novo). 

Parmi ces 8 patientes, 5/8 (62,5%) présentaient une encéphalopathie épileptique, tandis que les 3 autres avaient une déficience intellectuelle et/ou une épilepsie. Toutes présentaient une ACC. 

Ces résultats sont comparables aux 7 patientes de la littérature porteuses de variants ARX de survenue de novo, dont 6/7 présentent une encéphalopathie épileptique. Une seule a simplement des difficultés d’apprentissage. Une imagerie est disponible pour 6 des 7 patientes et  4/6 présentent une ACC. 

Concernant les cas familiaux rapportés dans la littérature, 41/56 (73%) femmes sont asymptomatiques, parmi lesquelles 33% ont une ACC isolée. 12/56 (21%) présentent une déficience intellectuelle, associée à une épilepsie dans 54,5 % des cas et /ou une ACC dans 80% des cas. 3 cas sur les 56 (5,4%) présentent une encéphalopathie épileptique sévère. 

Les variants pathogènes des cas survenus de novo sont des faux-sens localisés dans l'homéodomaine, ou des variants tronquants, ce qui est également le cas pour les cas familiaux les plus sévères.

Cette étude permet (i) de confirmer l'existence d'un phénotype sévère d'encéphalopathie épileptique chez les femmes porteuses d’un variant pathogène du gène ARX, (ii) de préciser la fréquence de la DI chez les femmes conductrices (iii)  et de souligner l’importance de l’étude de ce gène devant une ACC, associée ou non à des troubles du neuro-développement.

Contexte : RORB code pour un facteur de transcription dont le ligand est inconnu. Son expression est limitée au système nerveux central. Des études menées sur des modèles murins ont montré l’importance du gène RORB dans le système nerveux. Les premiers patients décrits présentaient une microdélétion 9q21.13 comprenant RORB avec un tableau clinique associant un retard du développement et une épilepsie fréquente. Deux autres publications ont rapporté des patients porteurs d'autres types de variants pathogènes du gène RORB avec une description du phénotype incluant une déficience intellectuelle et une épilepsie comme trait commun. Notre objectif est de délimiter le type de crises, les syndromes épileptiques et le profil neurocognitif d’une cohorte de patients porteurs de variants de RORB.

Méthodes : Un appel à collaboration internationale nous a permis d’analyser les phénotypes détaillés (description des crises, EEG, IRM) et les génotypes de 30 patients.

Résultats : 30 patients ont été inclus (15 patients masculins, âge médian : 9,5 ans (1an-21 ans)). Les différents variants de RORB comprenaient 4 microdélétions, 9 variants non-sens (frameshift and nonsense), 2 variants d'épissage, 2 variants délétions dans la trame (inframe) et 10 variants faux-sens. Les variants de RORB étaient de novo chez 15 patients (50%) et étaient hérités chez 9 patients (par la mère pour 4 patients et par le père pour 5 patients). Le mode de transmission était inconnu pour 6 patients.

Des crises d’épilepsie ont été rapportées chez 26/30 (87%) patients, avec un âge médian au début de l'épilepsie de 3 ans (4 mois-12 ans). Le syndrome épileptique le plus fréquent était l'épilepsie-absence, incluant l'épilepsie absence de l’enfant (n=6), l'épilepsie absence de l’adolescent (n=1), l'épilepsie absence à début précoce (n=4), l'épilepsie absences avec myoclonies (n=3), les myoclonies palpébrales avec absence (n=4). Un patient présentait une épilepsie myoclonique, deux autres patients avaient une épilepsie focale, et un dernier seulement de rares crises fébriles. Trois individus présentaient une épilepsie généralisée combinant plusieurs types de crises dont des crises toniques, et un patient présentait des pointes-ondes continues du sommeil. Une déficience intellectuelle a été décrite chez 25 des 30 patients (83%), étant légère chez 13 patients, modérée chez 10 patients, et sévère chez 2 patients.

Conclusion : Le phénotype des patients porteurs du variant RORB est caractérisé par des syndromes épileptiques généralisés, avec comme principale type de crises des absences, associé à une déficience intellectuelle légère à modérée. Étant donné le niveau d'expression élevé de RORB dans les réseaux thalamo-corticaux, les variants pathogènes de RORB pourraient altérer les états oscillatoires, favorisant la survenue des absences. Des études fonctionnels sont en cours pour tester les conséquences de certains variants dans des neurones en culture.

La déficience intellectuelle (DI) est un trouble neurodéveloppemental avec une contribution génétique importante, caractérisé par une grande hétérogénéité génétique. Si l'avènement du séquençage haut-débit a révolutionné l'identification de variants dans la DI, leur interprétation est devenue un enjeu majeur, notamment pour les variants faux-sens qui restent à l’heure actuelle classés comme Variants de Signification Inconnue (VSI). La mise au point de tests fonctionnels visant à tester l’effet des VSI est donc essentiel, et permet d'une part de rendre un diagnostic aux familles concernées mais également de mieux caractériser la fonction des protéines impliquées dans la DI. Nous illustrons cette question en présentant ici une approche intégrative pour reclasser les VSI dans le gène DYRK1A. Le syndrome DYRK1A est une des formes de DI les plus fréquentes (0,5% des patients DI) et inclue entre autres une microcéphalie, un retard de langage ainsi qu’une dysmorphie faciale. DYRK1A code pour une kinase à double spécificité Tyrosine et Serine/Thréonine impliquée dans de nombreux processus cellulaires. Nous avons dans un premier temps mis au point une approche intégrative composée d’un score clinique spécifique du syndrome DYRK1A, d’une signature de méthylation de l’ADN ainsi que de différents tests fonctionnels in vitro permettant d’évaluer l’impact des variants sur la stabilité, la localisation cellulaire ainsi que l’activité kinase de DYRK1A. Cette approche nous a permis de reclasser une douzaine de VSI et de mettre en évidence un potentiel variant gain de fonction dans DYRK1A (la totalité des mutations rapportées jusqu’à présent étant des perte-de-fonction). Pour mieux comprendre les conséquences des mutations perte-de-fonction, nous avons inactivé DYRK1A dans un modèle de précurseurs neuronaux humains (hNSC). Après avoir établi l’interactome de DYRK1A dans ces cellules et identifié de nouveaux partenaires protéiques, nous avons caractérisé les gènes dont l’expression était altérée après une inactivation de DYRK1A. Parmi les gènes cibles identifiés, nous avons pu observer un enrichissement en protéines transmembranaires ou composantes de la matrice extracellulaire, et en protéines impliquées dans la régulation du cycle cellulaire. De plus, nous avons pu mettre en évidence qu’une inactivation de DYRK1A entrainait une diminution de la prolifération des précurseurs neuronaux ainsi qu’une baisse d’expression de la protéine P21, un acteur important du cycle cellulaire, et une diminution de l’activation des protéines de la voie des MAP kinases ERK1/2.

En conclusion, notre étude a permis non seulement de mettre en place un pipeline permettant de caractériser l’effet de n’importe quel VSI identifié dans DYRK1A, mais également de caractériser les conséquences de ces mutations dans un modèle de précurseurs neuronaux en culture, permettant de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques impliqués dans le syndrome DYRK1A.

Le gène APP (Amyloid-β precursor protein, 21q21.3) code pour le précurseur du peptide Amyloide β (Aβ), dont l’agrégation dans le parenchyme cérébral entraine une maladie d’Alzheimer (MA) et l’agrégation dans les vaisseaux corticaux et lepto-méningés entraine une angiopathie amyloïde cérébrale (AAC), à l’origine de saignements intracérébraux. MA et AAC sont souvent associées dans les formes sporadiques comme monogéniques de MA et/ou AAC. Les duplications du locus APP sont responsables d’AAC et/ou MA à début précoce ( < 65 ans). Ces CNV impliquent toujours APP en entier, avec ou sans les gènes voisins, et sont associés à des taux sanguins d'ARN messager d’APP environ 1,5 fois plus élevés que ceux des témoins. Chez les porteurs d’une duplication d’APP, la taille et le contenu génique du CNV n’est pas directement corrélé à la clinique. Cependant, les patients atteints de trisomie 21, qui présentent classiquement une MA précoce, développent moins fréquemment des hématomes cérébraux, suggérant la présence de mécanismes protecteurs. Nous rapportons ici la première triplication du locus APP et discutons de son impact.

Le cas index est un homme de 41 ans adressé pour l'évaluation d'un déclin cognitif progressif (MMSE 18/30). L'IRM cérébrale et les biomarqueurs du liquide cérébro-spinal étaient évocateur d’une MA avec AAC. Son père est décédé à l'âge de 48 ans d’un hématome cérébral dans un contexte de CAA évoluant depuis ses 37 ans et de déclin cognitif progressif évoquant une MA. L’analyse par QMPSF a révélé 4 copies du gène APP chez le cas index. Sa mère, 68 ans, non affectée, était porteuse de 2 copies du gène, suggérant un génotype 3 + 1 chez le patient et son père, génotype confirmé par FISH métaphasique. En aCGH (Agilent 180K), la triplication 21q21.3 de 506 kb (chr21:27,156,233-27,662,338;hg19) était restreinte au gène APP. Les niveaux d'ARNm sanguin d’APP du cas index, évalués par RT-ddPCR, étaient doublés par rapport aux sujets contrôles (N=10) et supérieur à la moyenne des porteurs d’une duplication d’APP (N=9).

Il s'agit du premier cas de triplication du locus APP, provoquant un doublement du niveau d'ARNm d’APP, dans une famille présentant une MA avec AAC autosomique dominante, parmi les plus précoces et sévères comparé aux descriptions des porteurs de duplications. Cette observation suggère que le mécanisme décrit dans les duplications d’APP (augmentation de la production d’APP et, par conséquent, du peptide Aβ issu de son clivage, conduisant à des dépôts amyloidies précoces) est encore accentué par la présence d’une quatrième copie du gène. Ce type de sensibilité au dosage génique, illustré par une triplication conduisant à un phénotype proche, mais plus sévère, que de celui de la duplication correspondante, constitue un exemple relativement rare en génétique médicale, à l’instar des duplications/triplications du gène SNCA dans les synucléopathies.  

Les épidermolyses bulleuses forment un groupe hétérogène de maladies génétiques caractérisées par une importante fragilité cutanéo-muqueuse : bulles, érosions…. La forme dystrophique, caractérisée par une anomalie quantitative ou qualitative du collagène 7, est transmise selon les modes dominant (EBDD) ou récessif (EBDR). Le phénotype est habituellement modéré dans les formes dominantes même si quelques rares cas ont été associés à des manifestations sévères.

Le cas index (CI), une petite fille âgée de 4 ans, née de parents non apparentés originaires de Tunisie, présente une EBD modérée révélée par une aplasie cutanée congénitale des membres inférieurs d’évolution rapidement favorable en quelques mois. Son père mentionne également des bulles des extrémités survenant aux frottements. Il a des ongles dystrophiques. L’ensemble suggère une EBDD. Le couple consulte dans le cadre d’une grossesse en cours.

Chez le cas index, le séquençage haut débit d’un panel de gènes a permis l’identification de deux variants dans le gène COL7A1, à l’état hétérozygote composite : c.6187C>T p.(Arg2063Trp) localisé dans l’exon 74 et hérité de la mère, et c.4011G>A p.(Pro1337Pro) dans l’exon 33 et hérité du père. Les deux variants sont pathogènes et décrits chez des patients atteints d’EBD dans une forme récessive (Hovnanian et al 1997 PMID Varki et al 2007 PMID 16971478). Ce résultat nous a conduit à reconsidérer le diagnostic d’EBD dominante dans cette famille.

Puisque la forme clinique d’EBD modérée du père du CI ne semblait en effet pas imputable au seul variant c.4011G>A, les explorations génétiques de cette famille ont été complétées par un séquençage haut débit de l’ensemble des exons du gène COL7A1 chez le père révélant  un second variant hétérozygote localisé en trans, c.87del p.(Thr30Profs*74), dans l’exon 2.  Ce variant n’est ni publié ni rapporté dans les bases de données de polymorphismes.  Selon la classification ACMG, le variant c.87del peut être considéré comme pathogène (PVS1 + PM2 + PM3 + PM4).

Ainsi, les résultats inattendus de l’analyse moléculaire ont conduit 1) à reconsidérer le mode de transmission de cette EBD modérée. Initialement autosomique dominante, la transmission est finalement autosomique récessive ; 2) à préciser le conseil génétique pour le couple : risque de 50% d’avoir un enfant atteint d’EBDR, la transmission du variant maternel c.6187C>T et du variant paternel c.87del étant associée à un risque de forme sévère.

Le diagnostic prénatal a permis d’identifier les variants c.6187C>T et c.4011G>A à l’état hétérozygote composite chez le fœtus suggérant une EBD modérée. La grossesse a été poursuivie et l’enfant, de sexe masculin, a présenté une forme d’EBDR plus modérée que celle du CI.

Cette observation montre l’intérêt majeur du séquençage haut débit en trio en cas de mode de transmission alternatif pour un même gène et souligne l’importance de la concertation clinico-biologique dans certaines situations.

Le syndrome GACI (Generalized arterial calcification of infancy) est une maladie autosomique récessive rare caractérisée par l’association variable de calcifications artérielles et péri-articulaires et d’un rachitisme hypophosphatémique (RHP). S’il est généralement diagnostiqué en prénatal ou dans la première année de vie, il peut également être découvert plus tard voire à l’âge adulte. La majorité des nouveau-nés avec syndrome GACI décèdent précocement de complications cardiovasculaires. Les formes avec survie > à 6 mois voire révélées tardivement sont aujourd’hui mieux reconnues, et identifiées sur le plan moléculaire par une variation pathogène de ENPP1 (ecto-nucléotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1) ou ABCC6 (multidrug resistance-associated protein 6). Il existe en effet un chevauchement avec le pseudo-xanthome élastique (PXE associé à ABCC6) ayant élargi le spectre clinico-moléculaire de ce cadre syndromique. Nous rapportons 8 patients avec GACI associés à un variant pathogène de ENPP1, suivis actuellement dans notre filière de santé maladies rares OSCAR. Nous avons exclu de cette cohorte descriptive les patients décédés dans la première année de vie.

Le diagnostic a été porté entre l’âge de 3 semaines et 61 ans. Nous analysons les profils cardio-vasculaires, squelettiques, ORL, cutanés et leur retentissement fonctionnel. Les formes précoces (n=4) se manifestent initialement par des complications cardiovasculaires (n=3) liées aux calcifications étendues des artères de moyen et de gros calibre (n=4). Les formes tardives (n=4) sont révélées par un RHP résistant au traitement médical (avec des déformations sévères récidivantes malgré la chirurgie chez 2 d’entre eux). Tous ces patients « GACI survivants » présentent un RHP dans leur évolution(n=8), auquel s’associent de façon variable :  surdité (n= 5), HTA (n=6), néphrocalcinose (n=2), calcifications vasculaires (n=6), articulaire (n=4) ou viscérales (n=4), retard des acquisitions (n=2), stries angioïdes (n=2) et des anomalies dentaires (n=2). Les patients ont été traités par biphosphonates (n=6), anti hypertenseur (n=6 ), phosphore oral (n=7 ), un-alpha (n= 5), vitamine D (n=8), traitement anti-épileptique (n=1). De nombreuses calcifications vasculaires et viscérales ont régressé après un an, avec ou sans traitement par biphosphonates, ce qui suggère une évolution propre de la maladie après 1 an.

L’hétérogénéité des présentations appelle à évoquer précocément ce diagnostic devant des signes atypiques comme des calcifications articulaires ou viscérales, des stries angioïdes, ou un rachitisme hypophosphatémique non classique.

Seul un suivi prospectif longitudinal permettrait de mieux caractériser la correspondance génotype/phénotype/pronostic et d’évaluer le bénéfice des traitements conventionnels, pour optimiser la prise en charge au long cours et préparer l’avènement de thérapeutiques ciblées.

L’hétérotopie nodulaire périventriculaire de type 1 (PVNH1) est une maladie rare dominante liée à l’X, due à une perte de fonction du gène FLNA et l’épilepsie en est sa manifestation principale. Des atteintes cardiovasculaires (CV) et des anomalies du tissu conjonctif (CTD) peuvent s’y associer mais leurs fréquences et distributions sont mal connues.

L’objectif est d’évaluer les caractéristiques CV et CTD chez les patients présentant une perte de fonction confirmée du gène FLNA.

Une approche rétrospective systématisée portant sur 32 critères cliniques et paracliniques a été utilisée pour définir leur fréquence et leur distribution, au-delà du tableau neurologique. Nous avons évalué les présentations cliniques des patients présentant au moins un signe CV ou CTD, à partir de trois cohortes indépendantes : 10 patients du Centre de Référence des Maladies Vasculaires Rares, 23 patients du laboratoire national de diagnostic de référence pour les filaminopathies-A, et 59 patients issus de notre revue de la littérature.

La présence d’une hétérotopie nodulaire périventriculaire était confirmée chez 95% (n= 87/92) et n’a pas pu être recherchée chez 4 patients.  La moitié des patients ne présentaient pas de symptôme neurologique. 3/4 avaient une présentation syndromique (CV et/ou CTD). Les anomalies CV se distribuaient, en anévrismes ou dilation aortiques pour ¾ des patients, persistance du canal artériel pour 1/3 et communications interventriculaire et interauriculaire pour 1/3. Les anomalies CTD touchaient 3/4 des patients dont 67% d’hyperlaxité articulaire et 40% d’hyperélasticité cutanée.

Aucune relation génotype/phénotype n’a pu être mise en évidence, mais un enrichissement de variations faux-sens dans le domaine CH1 de la protéine a été identifié.

Notre étude confirme que les anomalies CV et CTD sont fréquentes et associées chez les patients PVNH1 et que l’atteinte neurologique n’est pas systématiquement présente. Ces atteintes CTD et/ou CV devraient être recherchées devant toute PVNH1, en raison de la prévalence et de la gravité de la maladie aortique dans cette affection. Par ailleurs, devant un tableau clinique d’aortopathie syndromique nous proposons que l'analyse moléculaire du FLNA soit réalisée même en l'absence d’épilepsie ou autre signe neurologique. Une IRM cérébrale pourrait être réalisée pour étayer l’hypothèse de PVNH1 notamment en cas de variant de signification incertaine dans FLNA. Enfin, malgré l'hérédité dominante liée à l'X, nos données suggèrent qu’un phénotype évocateur chez un patient masculin ne devrait pas exclure cette hypothèse diagnostique.

Rationale: Vascular Ehlers-Danlos syndrome (vEDS) is a rare autosomal dominant inherited connective tissue disorder characterized by spontaneous arterial ruptures, usually occurring in young adulthood. A phenotypic heterogeneity has been described, partly explained by the type of variant in the causal COL3A1 gene. Notably, a higher mortality rate is suspected in young affected men, suggesting the influence of sex hormones. Several Col3a1 knock-in mouse models have shown a lower survival rate in males caused by aortic rupture.

Objectives: Investigation of the effect of castration or the addition of testosterone on the occurrence of aortic rupture in our Col3a1^+/G182R mouse model.

Methods: The survival and the aortic structure in Col3a1^+/G182R knock-in male or female mice with or without castration ± hormone substitution were assessed. Transcriptomic analyses of aortic tissue were performed in Col3a1^+/G182R and wild type (WT) males or females using Gene set enrichment analysis (GSEA).

Results: Early orchidectomy (orx) at 5 weeks of age in Col3a1^+/G182R male mice improved the survival rate at 16 weeks compared to sham-operated controls (89% vs 67%, p=0.08) whereas ovariectomy (ovx) in Col3a1^+/G182R female did not modify it (96% vs 89%, ns). Subcutaneous administration of angiotensin II (Ang II) (0.5 mg/kg/min) considerably worsened the survival rate in Col3a1^+/G182R sham-operated male (0% survival rate at 10 days) but mortality was delayed and less severe in orx male mice (27% at 14 days). Ovx did not influence the Ang II – induced mortality rate, suggesting a specific effect of testosterone. Indeed, subcutaneous administration of testosterone in Col3a1^+/G182R ovx female mice significantly worsened the survival at 16 weeks (52% vs 96%, p=0.0006). Aortic diameter of Col3a1^+/G182R female mice was smaller than that of Col3a1^+/G182R male mice, but the collagen content was similar in both sexes and not influenced by castration on this short-term period. Aortic transcriptomic analysis showed 131 differentially-expressed genes (DEG) between Col3a1^+/G182R and WT male mice, among them 17 genes expressed in the endothelium and 7 related to the endothelin-1 and nitric oxide pathway. The same comparison in female mice retrieved the upregulation of 21 DEG belonging to the extracellular matrix (ECM) network, among them Fbn1 encoding fibrillin, Col1a1 and Col1a2 encoding the most abundant fibrillar collagen in the arterial wall. GSEA analyses confirmed the upregulation of the endothelin-1 and nitric oxide pathway in males and the remodeling of ECM in females.

Conclusion: This study confirms the implication of testosterone in causing arterial fragility in this vEDS mouse model with a complex mechanism of DEG suggesting an important role of the endothelium in the pathophysiology of the disease.

Les cytopathies mitochondriales regroupent une grande variété de pathologies dont le dénominateur commun est un déficit de la chaîne respiratoire mitochondriale. Les troubles neurologiques entrainés par ces déficits énergétiques sont bien connus mais il existe peu de description des troubles psychiatriques qu’ils entraînent.

Les troubles les plus fréquemment rapportés dans les cytopathies mitochondriales sont des troubles dépressifs, anxieux, bipolaires et psychotiques. Ces symptômes psychiatriques précèdent parfois de plus de 10 ans le diagnostic de la pathologie mitochondriale suggérant que les symptômes psychiatriques pourraient apparaitre précocement. Les objectifs de l’étude étaient de décrire les troubles psychiatriques et neuropsychologiques ainsi que la qualité de vie d’enfants atteints de cytopathies mitochondriales.

Matériel et méthodes : une cohorte de 12 enfants a été recrutée prospectivement entre février 2019 et février 2020 dans le Centre de Références des Pathologies Mitochondriales d’Angers (France). Les participants ont bénéficié d’une évaluation psychiatrique, avec entretien semi-structuré et passation d’échelles psychiatriques d’évaluation globale (BPRS : Brief Psychiatric Rating Scale et EGF : Evaluation Globale du Fonctionnement), de dépression (CDI : Children Depression Inventory), de troubles anxieux (RCMAS : Revised Children's Manifest Anxiety Scale), d’hyperactivité/inattention (échelle de Conners parents et enseignants) et de qualité de vie (PedsQL adapté à l’âge). Une évaluation neuropsychologique a également été réalisée avec test d’efficience intellectuelle (WISC-V) et un Inventaire comportemental des fonctions exécutives (BRIEF).

Résultats : Quatre enfants (33,3 %) avaient des symptômes dépressifs. Six enfants (50 %) ont signalé des symptômes d'anxiété lors de l'entretien psychiatrique et 3 enfants (25 %) souffraient effectivement d'anxiété selon l'échelle RCMAS. Par rapport aux autres enfants atteints de maladies chroniques, les individus de cette cohorte ont rapporté un score global de qualité de vie inférieur et des scores inférieurs dans les sous-échelles physiques et sociales. Concernant le profil neuropsychologique des enfants, le score moyen à la WISC-V dans notre cohorte était de 87,3± sd=25,3 [52 ;120]. Deux enfants, soit 20% des 10 enfants évalués avec cette échelle, avait un score de QI total situé dans la zone de déficience (QIT < 70).

Conclusion : Cette étude montre que les cytopathies mitochondriales peuvent entraîner des troubles psychiatriques ainsi que des dysfonctionnements neuropsychologiques chez les enfants et les adolescents dont le cerveau est en développement. Elle met en évidence la nécessité de réaliser des évaluations psychiatriques régulières dans cette population.

MTHFR deficiency is a severe autosomal recessive inborn error of folate metabolism leading to hyperhomocysteinemia and low methionine due to the dysfunction of the remethylation pathway of homocysteine to methionine.

MTHFR deficiency can present at any age. The clinical course varies according to the age of onset: the early-onset presentations (neonatal period and early infancy [≤ 3 months]) and the non-early-onset presentations (late infancy or early childhood [from 3 months to 10 years] and adolescence or adulthood [ > 10 years]). Early-onset patients typically exhibit a life-threatening acute neurologic deterioration. However, data on these patients especially long-term outcomes are scarce. The aims of this study were 1) to study and describe the clinical and laboratory parameters of early-onset MTHFR-deficient patients (i.e. ≤ 3 months of age) and 2) to identify predictive factors of severe neurodevelopmental outcomes.

To this end, we conducted a retrospective multicentric international cohort study on patients with MTHFR deficiency. Characteristics of patients with early-onset MTHFR deficiency were described at time of diagnosis and at the last follow-up visit. Logistic regression analysis was used to identify predictive factors of severe neurodevelopmental outcome in a broader subset of patients with early and non-early-onset MTHFR deficiency.

The study cohort, recruited from 32 international metabolic centres, consisted of 64 patients including 32 with early-onset presentation. More than 70% of the early-onset MTHFR-deficient patients exhibited neurologic symptoms (including hypotonia, microcephaly, seizures) and feeding difficulties at time of diagnosis. Eyes issues (i.e. poor or absent eye contact) and respiratory failure were reported in 38% and 30% of patients respectively. Initial brain MRI abnormalities  included ventricle dilatation (67%), cortex atrophy (56%), external CSF spaces dilatation (56%) and myelination delay (44%). At the last follow-up visit (median follow-up time of 8.1 years), 76% of treated patients exhibited a severe neurodevelopmental outcome. Among the whole study population, pre-symptomatic diagnosis was independently associated with a significantly better neurodevelopmental outcome (adjusted OR 0.004, [0.002-0.232]). The analytic neurologic examination was normal for all of them at the last follow-up visit.

Paediatricians and geneticists need to be aware of this rare and severe but potentially treatable inborn error of metabolism. Treatment should be initiated as early as possible, before irreversible brain damage. This study provides a clear evidence for benefits of pre-symptomatic diagnosis and subsequent appropriate therapeutic management, highlighting the need for systematic newborn screening and family screening in high-risk families for MTHFR deficiency.

A20 est une enzyme d'édition de l'ubiquitine codée par le gène A20 (ou TNFAIP3, tumor necrosis factor a-induced portien 3). A travers son activité E3 ligase et déubiquitinase, A20 régule plusieurs substrats de la voie NF-kappaB, tels que RIP1, NEMO et TRAF6. La protéine A20 joue un rôle central dans la régulation de l'inflammation et de l'immunité en inhibant cette voie de signalisation. Les premières mutations d’A20 décrites en 2016 conduisaient à une haploinsuffisance, donnant ainsi le nom haploinsuffisance A20 (HA20) à cette maladie auto-inflammatoire (MAI) de transmission autosomique dominante. Le phénotype de HA20 est partiellement chevauchant avec celui de la maladie de Behçet mais se caractérise par un âge de début de maladie précoce ; il associe des accès récurrents de fièvre, des ulcères buccaux et génitaux, une atteinte gastro-intestinale avec diarrhée, des arthralgies ou polyarthrites et des uvéites antérieures bilatérales. Avec plus de 25 mutations tronquantes de A20 rapportées à ce jour, HA20 est une MAI monogénique fréquemment diagnostiquée. Cependant, la signification pathogénique des variations faux-sens de A20 a été peu étudiée est reste difficile à établir.

Dans cette étude, nous avons identifié chez six patients indépendants présentant une MAI, cinq nouvelles variations de A20 dont le retentissement fonctionnel a été évalué par des tests cellulaires in vitro : deux variations responsables d’un décalage de cadre de lecture et trois faux-sens. Les deux variations tronquantes c.716dup (p.Ala240Cysfs*14) et c.1504del (p.Arg502Glyfs*195), entraînent une haploinsuffisance due à une dégradation des transcrits A20 par non-sens mRNA decay. La variation faux-sens c.707T>C (p.Leu236Pro) (de classe 3 selon les recommandations de l’American College of Medical Genetics), est responsable d’une dégradation accrue de la protéine mutée (suivi de la stabilité de la protéine et de la dégradation par le protéasome). La baisse d’expression de la protéine A20-Leu236Pro a été par ailleurs confirmée dans les PBMCs provenant des patients. En plus du défaut d’expression, la protéine A20-Leu236Pro présente un défaut fonctionnel avec une moindre suppression de l'activité NF-kappaB que la protéine A20 normale. Quant aux deux autres variations faux-sens identifiées : c.464C>T (p.Thr155Met) et c.237C>G (p.Ser79Arg), de classe 3, elles n’étaient responsables d’aucune anomalie dans les tests in vitro utilisés (étude de l’expression de la protéine et de l’activité NF-kappaB).

Au total, cette étude souligne l’importance d’évaluer le retentissement fonctionnel des variations faux-sens identifiées dans le gène A20 chez les patients chez qui un diagnostic de HA20 est suspecté : les résultats de ces analyses conditionnent la prise en charge thérapeutique des patients et le conseil génétique.

Introduction : L’holoprosencéphalie (HPE) est une malformation cérébrale cliniquement et génétiquement hétérogène. Dans un cadre syndromique, elle peut être associée à diverses malformations fœtales, parfois non détectables lors des échographies de dépistage prénatal.

Méthodes : Nous rapportons le cas d’un fœtus porteur d’une HPE semi-lobaire diagnostiquée à l’échographie, pour lequel un examen fœtopathologique ainsi qu’un séquençage complet de l’exome en trio a été réalisé suite à une interruption médicale de grossesse.

Résultats-Discussion : L’autopsie fœtale a confirmé la malformation cérébrale de type HPE semi-lobaire et a de plus révélé une agénésie complète du pancréas. L’analyse de l’exome a mise en évidence le variant faux-sens c.1603C>T, p.(Arg535Cys) dans le gène CNOT1, apparu de novo chez le fœtus. Dans la littérature 5 enfants porteurs de ce même variant dans CNOT1 ont été décrits. Tous les patients présentaient une HPE et 4 sur les 5 patients décrits avaient une insuffisance pancréatique endo- et exocrine ou une agénésie du pancréas. Le gène CNOT1 code pour une sous-unité du complexe CCRN4-NOT, impliqué dans la dégradation post-transcriptionnelles des ARNm, et est exprimé au stade précoce du développement embryonnaire. En 2019, De Franco et al., suggèrent un effet précoce de ce variant sur la voie Sonic Hedgehog à l’origine d’une inhibition de la répression de SHH et d’un blocage de la différenciation des cellules pluripotentes en cellules pancréatiques.

Conclusion : Cette observation est la première description fœtale du phénotype associant HPE et anomalie du développement pancréatique lié au variant récurrent c.1603C>T, p.(Arg535Cys) dans CNOT1. L’agénésie pancréatique, difficilement détectable lors des échographies obstétricales, est cependant un élément diagnostique essentiel et conforte l’importance de l’examen fœtopathologique pour orienter les analyses génétiques.

Le syndrome Kabuki (SK) est une maladie génétique rare avec une prévalence de 1/32000 naissances mais qui est fréquente chez les fœtus avec malformation. Le diagnostic clinique du SK peut être difficile au cours de la première année de vie ou lorsque les caractéristiques dysmorphiques sont atypiques. L’identification de variants pathogènes de novo dans les 2 gènes connus du SK (KMT2D et KDM6A) représente alors une confirmation du diagnostic. Notre laboratoire propose ainsi une analyse moléculaire des gènes responsables du SK ainsi que d’autres gènes régulant la méthylation via une approche haut débit par panel de gènes cibles. Depuis sa mise en place, cette stratégie moléculaire a confirmé le diagnostic clinique du SK dans environ 70.7% des cas (29/41 patients SK), parmi lesquels 96,5% (28/29) présentent un variant de classe 4 ou 5 dans KMT2D et seulement 3,4% (1/29) dans KDM6A. Cependant, l’absence de confirmation moléculaire dans 29.3% des cas (12/41) soulève la question suivante : existe-t-il un variant non détecté par les techniques utilisées ou s’agit-il d’un autre gène ?

Récemment, des profils uniques de méthylation de l'ADN génomique de certains gènes ou épi-signatures ont été établis (Aref-Eshghi E, Am. J. Hum. Genet, 2020). Afin de répondre à la question posée, une étude du profil de méthylation de l’ADN des 11/12 patients « négatifs » pour ces 2 gènes a été réalisée, en collaboration avec le Dr Sadikovik via la plateforme EpiSign-CAN. Au préalable, une reprise minutieuse des données cliniques a permis un classement en 2 groupes : patients «SK typiques» (n=3) et «SK atypiques» (n=8). Les résultats montrent que seuls les patients «SK typiques» présentent une signature épigénétique similaire à celle préalablement établie lors de l’analyse des patients avec un variant KMT2D ou KDM6A, ce qui suggère un diagnostic différent pour les «SK atypiques».

La ré-analyse des données de séquençage des 3 patients «SK typiques» avec épisignature spécifique, à l’aide du pipeline bio-informatique MOBIDL (https://github.com/mobidic/MobiDL) plus performant pour la détection des indels et ensuite l’analyse des variations du nombre de copies, ont permis d’identifier 2 nouveaux variants KMT2D. Un variant tronquant, délétion de 20 nucléotides dans l’exon 34 : c.9962_9993del ; p.(Arg3321Hisfs*91)) et une délétion d’au moins une partie de l’exon 35. Ce résultat permet de confirmer le diagnostic du SK pour 2 patients sur 3. Une analyse moléculaire étendue aux régions introniques profondes et régulatrices pourrait aider à identifier le variant causal chez le troisième.

Compte tenu du faible effectif de notre étude, il serait intéressant de répliquer ce résultat sur un échantillon plus large, afin de pouvoir généraliser l’épisignature dans le SK. Une telle approche apporterait une aide précieuse et complémentaire au NGS, et permettrait la sortie de l’impasse diagnostique pour les patients SK et probablement aussi pour des patients atteints d’autres chromatinopathies.

La paralysie du regard horizontal avec scoliose progressive (HGPPS) est un syndrome extrêmement rare. Il s'agit d'une pathologie autosomique récessive, caractérisée par l'absence de mouvements oculaires horizontaux conjugués et une scoliose débilitante progressive pendant l'enfance et l'adolescence. Le HGPPS est associé à des mutations dans le gène ROBO3. Dans cette étude, l'objectif était d'identifier l'étiologie génétique dans une cohorte de patients tunisiens diagnostiqués cliniquement comme atteints de HGPPS.

Treize patients tunisiens issus de six familles consanguines non apparentées ayant des manifestations cliniques de HGPPS ont fait l'objet d'une étude clinique détaillée sur une période de 10 ans. Nous avons investigué les variants en cause utilisant dans un premier temps, le séquençage Sanger, puis, dans un deuxième temps, le séquençage de l’Exome complet (WES).

Quatre mutations homozygotes distinctes ont été identifiées dans le gène ROBO3. Deux de ces mutations ont été identifiées pour la première fois à savoir le variant c.3412C > T au niveau de l’exon 23 chez deux patients originaires de la même région ainsi que le variant c.2833dupG présent au niveau de l’exon 19 et détecté chez 4 patients. L’utilisation des outils de prédiction et l’analyse clinique ont confirmé leur effet pathogène. Les deux autres variants ont été décrits auparavant chez des patients Tunisiens, dont le variant c.284T > C au niveau de l’exon 4 et le variant c.1450T > C au niveau de l’exon 9. Les variants trouvés par WES ont été validés par séquençage Sanger confirmant leur mode de ségrégation.

Il s'agit de la plus grande cohorte de patients tunisiens avec HGPPS dans laquelle des mutations dans le gène ROBO3 ont été identifiées. Ce travail a permis d’élargir le spectre de mutations pour le syndrome HGPPS en Tunisie et dans le monde, ce qui permettra de mettre en place un diagnostic prénatal et un conseil génétique pour les familles à risques, ainsi qu’une prise en charge précoce des patients.

Objectif. Le syndrome CMMRD (Constitutional Mismatch Repair Deficiency) est un syndrome de prédisposition au cancer lié à la présence d’une mutation bi-allélique (homozygote ou hétérozygote composite) dans l'un des quatre principaux gènes de réparation des mésappariements (gènes MMR) PMS2, MSH2, MSH6 ou MLH1. Il est associé à l'apparition précoce de cancers, en particulier les glioblastomes (GBM) survenant à un âge pédiatrique. Notre objectif était de décrypter les spécificités moléculaires des gliomes apparaissant dans ce contexte.

Méthodes. Une analyse complète des données cliniques, histopathologiques et génomiques (séquençage de l'exome entier) a été réalisée chez 12 enfants atteints d’un CMMRD, pour lesquels nous disposions de matériel tumoral congelé (10 GBM et 2 astrocytomes anaplasiques).

Résultats. Huit patients présentaient un phénotype ultra-muté avec plus de 100 variants somatiques non synonymes (NS) d'un seul nucléotide (SNV) par mégabase (Mb). Aucune corrélation n'a été observée entre le nombre de mutations et le sexe, l'âge, la survie globale ou le gène MMR muté. Des mutations somatiques dans le domaine exonucléase de POLE ou POLD1 ont été identifiées chez respectivement 8 patients et 1 patient. Les 4 tumeurs sans altération somatique de POLE ne présentaient pas un phénotype classique ultra-hypermuté (nombre de NS coding SNV/Mb : 2, 4, 77, 80). Tous les patients porteurs d'une mutation POLE avaient plus de 20 NS SNV/Mb avec une VAF supérieure à celle de la mutation POLE initiatrice (médiane 40 [range 23-96). Ces deux résultats suggèrent que le phénomène d'accélération de la survenue des mutations a commencé avant l'apparition de la mutation somatique de POLE. En effet, l'analyse des différents bursts de mutations montre que les signatures mutationnelles des tumeurs, dominées par les signatures MMR, n’ont été que légèrement modifiées après l'apparition de la mutation POLE. Des altérations somatiques récurrentes précoces (VAF supérieure à celle de la mutation somatique de POLE) et définies comme pathogéniques ont été observées dans SETD2 (9/12), TP53 (9/12), NF1 (9/12), EPHB2 (8/12) et DICER1 (7/12). Seule la moitié des tumeurs surexprimait PDL1 en immunohistochimie et cette surexpression n'était pas associée à une charge de mutation tumorale plus élevée.

Conclusion. Les gliomes associés au CMMRD ont une oncogenèse spécifique avec des voies de signalisation et des mutations différentes de celles habituellement observées dans les GBM pédiatriques ou adultes de survenue sporadique. Les altérations fréquentes dans les voies MAPK ou DNA-PK, par exemple, peuvent suggérer l'utilisation d'autres thérapies ciblées en dehors des inhibiteurs de PD1.

Les tests de panel de gènes estimant le risque de cancer et leurs résultats peuvent être source d’interprétation difficile et de détresse chez les patients. L’objectif de cette étude était d’évaluer dans quelle mesure les cliniciens en oncogénétique repèrent les difficultés psychosociales liées au risque génétique de cancer chez des femmes à haut risque de cancer du sein. Il s’agissait également d’évaluer si un repérage adéquat, une sous- ou surestimation des difficultés pouvaient résulter en une détresse plus importante chez ces femmes, et si le niveau de détresse pouvait être affecté par le type de résultat de test.  

L'étude est prospective observationnelle et menée auprès de dyades patiente-clinicien dans des services d’oncogénétique en Allemagne, Espagne et France, impliquant 709 patientes (taux de participation, 83.4%) et 31 cliniciens (taux de participation, 100%). L’accord patiente-clinicien sur les difficultés psychosociales perçues a été mesuré à l’aide du questionnaire portant sur les "Aspects Psychosociaux liés au Cancer Héréditaire (PAHC)" complété indépendamment par les cliniciens et les patientes après la consultation initiale. Ce questionnaire porte sur différents domaines de difficultés liées à la prédisposition héréditaire, l’impact du test sur le plan pratique, la communication familiale, les enfants et le fait de vivre avec le cancer. Les taux (nombre et pourcentage) et les degrés (coefficients Kappa) d’accord ont été calculés. Les niveaux de détresse ont été mesurés grâce à l’échelle "Anxiété et Dépression (HADS)” après la consultation initiale (T1) et de remise de résultat (T2).

Les degrés d’accord sur la perception des difficultés par les patients et les cliniciens sont apparus très modestes, avec des coefficients Kappa allant de 0.001 à 0.17. Les difficultés ont été généralement sous-estimées, dans la plupart des domaines du PAHC. Les niveaux de détresse des patientes, faibles en moyenne, se sont révélés stables de T1 à T2, quels que soient le jugement adéquat ou inadéquat des cliniciens à propos de la présence ou non de difficultés, ou le type de résultat de test génétique. Néanmoins, des scores au HADS de plus de 12 soulignant la nécessité d’une orientation psychologique ont été observés chez près de 30% des patientes. Ces niveaux de détresse > à 12 ont été observés spécifiquement là où le clinicien sous-estimait ou évaluait correctement la présence de difficultés émotionnelles.

Ces résultats suggèrent la nécessité d’améliorer l’appréciation des besoins d’orientation psychologique des patientes s’adressant en oncogénétique face au risque élevé de cancer du sein. Améliorer l’évaluation des difficultés émotionnelles mais aussi le processus d’orientation vers un accompagnement psychologique lorsque des difficultés ont été correctement repérées permettrait de minimiser la détresse chez les patientes qui en présentent au cours de la démarche en oncogénétique.

Le rétinoblastome est une tumeur maligne pédiatrique de la rétine résultant de l’inactivation biallélique du gène suppresseur de tumeur RB1 dans une cellule rétinienne ou, dans de rares cas, à l’amplification somatique du gène MYCN. Dans près de la moitié des cas, il existe une prédisposition génétique avec la présence au niveau constitutionnel d’un variant pathogène du gène RB1 alors que le rétinoblastome non héréditaire est principalement causé par l'inactivation des deux allèles RB1 au niveau somatique. Plusieurs polymorphismes ont été rapportés comme biomarqueurs du risque de rétinoblastome, de son agressivité ou de son invasion. L’analyse génétique de l’ADN tumoral à la recherche des deux variants pathogènes du gène RB1 est l’examen le plus informatif. A ce jour, cette analyse n’est possible que chez les patients traités par énucléation. Cependant, l’augmentation de l’utilisation de traitements conservateurs a fait chuter le taux d’énucléation. De récentes études ont montré que l'ADN tumoral circulant issu de l’humeur aqueuse peut être analysé chez les patients atteints de rétinoblastome. Nous avons mis au point une nouvelle méthode de séquençage haut débit analysant un panel de gènes avec utilisation de barcodes moléculaires, aussi appelés UMI (Unique molecular identifiers), permettant une détection très sensible de la prédisposition génétique et des biomarqueurs du rétinoblastome en une seule analyse. Il s'agit de la première utilisation des UMI pour la génétique du rétinoblastome. Ce panel de gènes permet de détecter les variants ponctuels de RB1, y compris les variants en mosaïque faible, les réarrangements de grande taille de RB1 dont la perte d’hétérozygotie, les amplifications de MYCN, et des facteurs modificateurs du risque de rétinoblastome ou autres biomarqueurs.  Il a été évalué sur 30 échantillons provenant de 23 patients atteints de rétinoblastome. Cette technique permet d’étudier l’ADN extrait de différents fluides biologiques : de l’ADN génomique extrait de sang total, de l’ADN tumoral extrait de fragment tumoral, d'humeur aqueuse ou de plasma. L'accès à l'ADN tumoral circulant améliore le diagnostic de la prédisposition génétique chez les patients bénéficiant d’un traitement conservateur et donne accès à des biomarqueurs pouvant guider la stratégie thérapeutique.

On estime que 2 à 4% des cancers du rein surviennent dans un contexte de prédisposition génétique. Selon les recommandations françaises établies par le réseau PREDIR (PREDispositions aux tumeurs du Rein), en cas de suspicion d’une prédisposition génétique au cancer du rein, les laboratoires effectuent l’analyse d’un panel de gènes incluant à minima les gènes VHL, FLCN, FH, MET et SDHB en raison du risque reconnu de cancer du rein associé à la détection d’un variant pathogène.

Selon l’évolution des connaissances, les laboratoires incluent régulièrement de nouveaux gènes « recherche » à ce panel. Les variants dans ces gènes sont rendus au prescripteur à la discrétion des laboratoires effectuant l’analyse.

Nous avons repris rétrospectivement les analyses des patients analysés en NGS sur 18 gènes : VHL, SDHB, FLCN, MET, FH, BAP1, SDHC, SDHD, SDHA, SDHAF2, TMEM127, MAX, CDC73, PTEN, MITF, HNF1b, CDKN2B, PBRM1, TP53. L’objectif principal de ce travail était d’étudier la fréquence de détection et la répartition des anomalies au sein de notre panel et de discuter l’intérêt d’une analyse systématique de certains gènes.

              Au total, 742 patients avec un cancer du rein ont été analysés. L’âge moyen au diagnostic était 45 ans, 117 patients présentaient des tumeurs multiples, 130 une histoire familiale de cancer du rein, 56 des signes associés pouvant faire évoquer une forme syndromique. L'histologie était renseignée pour 834 des 857 tumeurs.

Le séquençage a permis la détection d’un variant pathogène ou probablement pathogène (VP) chez 33 patients (4,5%) et la détection de variants de signification inconnue (VSI) chez 55 (7,4%). Dix-neuf VP ont été détectés dans les principaux gènes de prédisposition ainsi qu’une majorité de VUS (56%).

La détection d'un PV était significativement associée à la présence d'une autre tumeur ou de signes associés chez le cas index, et à des antécédents familiaux. Elle était plus fréquente dans certains types histologiques.

L’analyse en NGS nous a permis d’analyser en parallèle plusieurs gènes susceptibles d’être impliqués dans les prédispositions héréditaires au cancer du rein, quels que soient l’histologie et le contexte clinique dans le cadre des indications du réseau PREDIR. Cette approche semble particulièrement efficace dans les formes syndromiques et certains sous types histologiques et a parfois permis de corriger certains diagnostics.  Le nombre important de VSI implique de développer les études tumorales ou d’autres approches pour mieux classer ces variants. Le rendement de détection est meilleur si l’on augmente le nombre de gènes analysés mais reste globalement faible, faisant suspecter une part importante de facteurs génétiques et/ou environnementaux inconnus à ce jour. Un travail national est en cours pour harmoniser les pratiques entre laboratoires, définir le « meilleur » panel à proposer chez les patients susceptibles d’avoir une prédisposition au cancer du rein et leur proposer une surveillance adaptée.

Introduction :

Les carcinomes rénaux papillaires (papRCC) sont des tumeurs rares, représentant 15 à 20 % des carcinomes à cellules rénales (RCC). Parmi eux, on distingue classiquement 2 sous-types histologiques, le type 1 (papRCC type 1) et le type 2 (papRCC type 2), pouvant co-exister au sein d’une même tumeur (papRCC mixte). Cliniquement, les papRCC type 2 semblent associés à un moins bon pronostic. Une évolution métastatique survient dans 6-10% des cas, avec un pronostic sombre. Le profil mutationnel des papRCC a été peu exploré mais l’étude menée par The Cancer Genome Atlas en 2015 sur 157 tumeurs a montré que les gènes les plus fréquemment mutés étaient MET, FAT1, SETD2 et NF2.

L'objectif de notre étude était de définir une signature mutationnelle spécifique des papRCC métastatiques en vue d’identifier des facteurs prédictifs et de potentielles cibles thérapeutiques pour ce cancer dont le pronostic reste très péjoratif.

Matériel et méthodes :

A partir d’une cohorte monocentrique rétrospective de 242 patients atteints de papRCC, opérés dans les hôpitaux Necker ou Georges Pompidou (Paris) entre 2010 et 2020, nous avons identifié 24 patients (10%)  ayant développé des métastases synchrones (n=11) ou métachrones (n=13).

Pour chacun, nous avons collecté les données clinicopathologiques et avons étudié les profils génétiques et immunohistochimiques des tumeurs primaires.

Nous avons réalisé l’étude génétique somatique (ADNs tumoraux extraits de fragments congelés ou FFPE) par NGS grâce à un panel maison (Twist Bioscience®) ciblé de 29 gènes impliqués dans la tumorigenèse rénale. Les immunohistochimies ont été réalisées par Tissue MicroArray utilisant 14 anticorps ciblant FH, SMARCB1, SMARCA4, TFE3, MET, BAP1, PBRM1, 4-EBP1-P, S6K-P, PDL1, CD3, CD8, CD163 et CD20.

Résultats :

Parmi les 24 papRCC primaires analysés, deux étaient de type 1, 7 de type 2, deux mixtes, 12 inclassables et un biphasique.

Des variations somatiques pathogènes (VP) ou probablement pathogènes (VPP) ont été identifiées dans 58% des tumeurs primaires analysées (14/24). Le nombre d'anomalies identifiées était multiple dans 8 cas. Des VP/VPP ont été trouvées dans les gènes SMARCB1 (n=4), NF2 (n=4), MET (n=3), BAP1 (n=3), VHL (n=3), SETD2 (n=2), PBRM1 (n=2), FH (n=1), KDM6A (n=1), TP53 (n=1), TSC1 (n=1) et TSC2 (n=1). Les résultats du phénotypage immunohistochimique sont en cours d'analyse.

Conclusion :

Les anomalies des gènes SMARCB1 et NF2 sont les plus fréquemment retrouvées dans notre série de papRCC métastatiques, avec une fréquence de 17% pour chacun d'eux. Dans l'étude du TCGA qui comprenait seulement 5 tumeurs métastatiques sur 157 papRCC étudiés, des mutations de ces gènes avaient également été rapportées mais avec une fréquence moindre (2.5% et 6.4% respectivement). Nos résultats suggèrent donc que des mutations des gènes SMARCB1 et NF2 pourraient être des facteurs prédictifs précoces d'évolution métastatique chez les patients atteints de papRCC.

Au cours de la dernière décennie, le séquençage haut débit pangénomique (STHD) a révolutionné le diagnostic et la recherche médicale. Son utilisation massive a permis d’identifier de nombreux nouveaux gènes responsables de maladies rares (MR). Par ailleurs, depuis quelques années, le STHD est transféré en diagnostic en France, et depuis 2016 dans le cadre du Plan France Médecine Génomique 2025 (PFMG2025) qui ambitionne de réaliser à terme un séquençage de génome entier chez 17.000 patients atteints de MR par an. La réanalyse des données, la constitution et/ou la participation à des bases de données (de variations génomique gènes d’intérêt) et le partage de données à l’échelle nationale et internationale sont des enjeux médicaux, scientifiques et stratégiques majeurs. C’est dans ce contexte que le CAD (Collecteur Analyseur de Données) a été créé.  Il a pour objectif de rassembler l’ensemble des données génomiques issues du PFMG2025 et proposera des outils d’aide à l’interprétation à la fois dans le cadre du soin et de la recherche.

Dans le cadre du soin, la réanalyse des données peut être réalisée pour chaque patient individuellement à la demande du prescripteur, devant l’apparition de nouveaux signes cliniques ou de nouvelles hypothèses diagnostiques. Une réanalyse systématique et prospective des données de l’ensemble des patients dont les résultats ont été négatifs/non conclusifs s’avère particulièrement efficace. Dans la déficience intellectuelle par exemple, chaque réanalyse annuelle des données d’exome identifie le diagnostic chez environ 5-7% de ces patients.

Dans le cadre de la recherche, l’enjeu est également crucial puisqu’un élément clé pour confirmer un lien de causalité entre une MR et un nouveau gène candidat est d'identifier plusieurs individus non apparentés présentant des phénotypes chevauchants et porteurs de variations génomiques dans le même gène avec le même modèle d'hérédité. La réanalyse ciblée des données à la demande des chercheurs sur une hypothèse donnée ou la mise à disposition de bases de données de variations candidates d’intérêt (telles que de novo-db par exemple) ont déjà fait la preuve de leur intérêt, de même que le partage de ces variations sur des plateformes internationales (telles que Matchmaker Exchange).

A l’échelle du CAD, et dans l’hypothèse d’une réanalyse prospective massive des données pour lutter contre l’impasse diagnostique et favoriser la recherche dans les MR, deux axes majeurs du PNMR3, des réflexions s’imposent pour déterminer la stratégie et les outils à déployer à l’échelle nationale. Un groupe de travail dédié dans le cadre du PFMG2025 a été mis en place à cet effet. Nous proposons de présenter ses réflexions, ses orientations et les stratégies proposées pour optimiser la réanalyse, les bases et le partage des variations génomiques d’intérêt dans le cadre du PFMG2025.

Introduction: Le séquençage d’exome/genome (ES/GS) entraine régulièrement d’implications de nouveaux gènes ou l’extension phénotypique de gènes déjà connus en pathologie humaine. La réanalyse prospective complète des données d’ES/GS a démontré son efficacité avec un rendement diagnostique additionnel de 10.5% à 32%, mais se heurte à des difficultés organisationnelles importantes pour les laboratoires de diagnostic. Des alternatives moins chronophages ont été discutées comme des réanalyses complètes à la demande du patient et/ou du clinicien, ou ciblées devant l’apparition de nouveaux signes cliniques ou hypothèses diagnostiques. Il est possible d’interroger une grande quantité de données génomiques de façon ciblée, par une ligne de commande nommée grep. Celle-ci n’a été utilisée à ce jour, qu’en cancérologie afin de rechercher des fusions de gènes ou des insertions Alu. Nous présentons une stratégie de réanalyse innovante basée sur une veille bibliographique prospective intensive associée à une recherche ciblée par ligne de commande grep directement appliquée à notre base de données de plus de 6000 exomes.

Méthodes: Depuis avril 2019, nous soumettons quotidiennement 5 mots-clés d’intérêt sur PubMed : intellectual disability, (neuro)developmental delay, (neuro)developmental disorder. Chaque gène nouvellement identifié en pathologie humaine ou dans un nouveau phénotype a été « greppé » dans les 6000 VCF de notre base de données d’ES, avec une ligne de commande Linux et un script à façon afin de collecter toutes ses variations.

Résultats: En 24 mois, 199 gènes sont « greppés » dans 6000 ES dont 2366 cas index avec anomalies du développement/déficience intellectuelle (1550 avec un résultat négatif ou non concluant) et 656 de leurs apparentés. Parmi ces 199 gènes, au moins 78 étaient nouvellement impliqués en pathologie humaine, ou dans un phénotype différent. 89 variations candidates sont identifiées chez 88 cas index. Après discussion pluridisciplinaire, validation Sanger et ségrégation familiale, un diagnostic causal est confirmé pour 26/199 greps (13%) chez 31/1550 cas index (2%) ; des variations de signification incertaine (VSI) sont identifiées pour 24/199 greps (12%) chez 38/1550 cas index (2,5%), dont 37.5% sont inclues dans des collaborations internationales. Le délai entre la publication et le compte-rendu était en moyenne de 2.1 mois. Les journaux Am J Hum Genet, Brain, J Med Genet et Genet Med étaient les plus contributifs conduisant à 32% des diagnostics.

Conclusion: Cette stratégie de réanalyse s’avère efficace et conduit à des diagnostics rapides. Une veille bibliographique prospective intensive appliquée à une base de données d’ES importante apparait efficace et s’avère moins laborieuse qu’une réanalyse périodique complète pour les laboratoires. L’utilisation d’outils de veille bibliographique automatisés, par intelligence artificielle par exemple, pourrait être une piste intéressante à explorer pour optimiser cette stratégie.

Les anomalies du développement sont extrêmement hétérogènes, mais les caractéristiques cliniques typiques associées aux syndromes OMIM, avec gènes bien connus, représentent une aide précieuse dans l'identification des variants génétiques. Cependant, les investigations génétiques de première intention telles que le séquençage ciblé, les panels de gènes ou le séquençage de l'exome peuvent ne pas mener à un diagnostic moléculaire, entraînant une multiplication de tests diagnostiques.

Nous avons recruté 15 personnes avec un diagnostic clinique typique OMIM avec un mode de transmission autosomique récessif et un seul variant hétérozygote identifié par des tests génétiques de première intention (8/15), ou avec une transmission autosomique dominante ou liée à l'X et sans variant causal identifié (7/15). Nous avons appliqué une analyse en deux étapes comprenant le séquençage du génome en solo (GS) complétée par une analyse transcriptomique (ARNm-seq) dans des échantillons sanguins ou de fibroblastes si nécessaire.

Le GS à lui seul a identifié cinq variants (SNVs/indels) causals, tous manqués par les tests ciblés de première intention, et quatre variants structurels (SVs) (dont deux délétions (6,5 kb et 4,2 kb), une translocation équilibrée et un réarrangement complexe). L'analyse de l'ARNm-seq a permis de valider l’effet délétère de deux réarrangements complexes détectés par GS et qui ont pu être résolues par cartographie optique et GS long read. Il a également permis de mettre en évidence un SV et un SNV intronique profond non identifié auparavant par GS seul.

Nous montrons que les pathologies OMIM typiques avec des résultats de première intention négatifs ou non concluants peuvent être résolus par un déploiement séquentiel de GS et ARNm-seq. Ces approches nous ont permis de confirmer un diagnostic moléculaire dans 87% (13/15) de notre cohorte. Dans l'ensemble, GS et ARNm-seq peuvent être intégrés dans la routine de diagnostic, permettant d'établir de nouveaux diagnostics moléculaires non identifiables par des approches standard.

L’évolution des techniques de caractérisation génomique et épigénétique a toujours été l'un des fers de lances de la biologie moléculaire moderne et a incontestablement permis des découvertes scientifiques majeurs au cours des dernières décennies. En effet, les technologies de séquençage n'ont cessé d'innover et d'évoluer pour fournir des outils puissants capables d’explorer le génome et l'épigénétique à travers une myriade d’applications qui font dorénavant partie de l’arsenal de dispositifs utilisables aussi bien en recherche que dans les laboratoires d’analyses médicales. Ainsi l’arrivé de nouvelles technologies capables de détecter des altérations indécelables avec les appareils de séquençage déjà en place, avec un coût moindre, un débit plus élevé et/ou une vitesse plus rapide a toujours suscité un grand intérêt pour faire progresser la biologie moléculaire. Ces dernières années, l'intérêt du séquençage par Nanopores s'est progressivement accru dans ce domaine du fait de ces caractéristiques uniques. Techniquement, le séquençage par Nanopore est basé sur la détection en temps réel du changement de courant ionique provoqué par le passage d'un acide nucléique à travers un pore nanométrique intégré dans une membrane électriquement résistante. La technologie de séquençage par Nanopore permet ainsi de distinguer les différents types de nucléotides et donc de séquencer les acides nucléiques sans étapes de synthèses mais aussi de détecter directement les modifications de bases tel que la méthylation des cytosines sans traitement chimique.

Basé sur l’expérience que nous avons acquis de l’utilisation du séquençage par Nanopore depuis 2018 au sein du service d’oncogénétique de l’institut Curie et en particulier sur le méthylome, le low-coverage whole-genome sequencing et la résolution de variants structuraux complexes, nous proposons de faire le point sur ce type de séquençage et sur ses potentielles utilisations applicables en routine diagnostic.

Malgré certaines limitations importantes comme une précision de lecture moindre par rapport aux technologies de séquençage short-read couramment utilisées, le séquençage par Nanopore possède néanmoins des caractéristiques uniques couplées à une simplicité d’utilisation, a un rendu de résultat extrêmement rapide et à son impressionnante possibilité très récemment décrite d’enrichissement contrôlé informatiquement (ou adaptive sampling en anglais). Son utilisation était jusqu’à maintenant plutôt réservé à un usage en recherche mais il y a fort à parier que le séquençage par Nanopore vienne progressivement s’implémenter dans nos laboratoires d’analyses médicales pour des indications précises, seul ou en complément d’autres techniques d’analyse moléculaire déjà en place.

L'infertilité masculine est un problème de santé majeur présentant une importante étiologie génétique. Malgré les apports récents du séquençage haut débit qui a permis l’identification de nombreux facteurs génétiques, l'efficacité diagnostique globale de l’infertilité reste faible. En effet, alors que des défauts génétiques ont été associés à plus de 50 % des anomalies rares et graves du spermogramme, les rendements diagnostiques pour les formes communes et modérées d'infertilité masculine, telles que l'oligozoospermie, demeurent inférieurs à 20 %. Comme seule la transmission mendélienne monogénique est actuellement étudiée, nous avons émis l'hypothèse que la faible efficacité diagnostique pourrait être au moins partiellement due à une étiologie complexe. Ainsi, nous suggérons que de nombreux cas inexpliqués d'infertilité masculine pourraient être liés à des défauts oligogéniques, c'est-à-dire à l'accumulation de plusieurs variants délétères hétérozygotes dans des gènes distincts, mais fonctionnellement connectés. Nous avons testé cette hypothèse en étudiant la fertilité et les paramètres spermatiques chez des souris mâles possédant entre une et quatre mutations tronquantes hétérozygotes, qui, dans leur forme bi-allélique, induisent des syndromes d’anomalies morphologiques multiples du flagelle (MMAF). Nos résultats indiquent une détérioration progressive des paramètres de morphologie et de motilité des spermatozoïdes en corrélation directe avec le nombre de mutations hétérozygotes, chaque nouveau variant diminuant davantage la qualité du spermatocytogramme. Il s'agit du premier rapport d’une hérédité oligogénique de l’infertilité masculine, et les résultats présentés ici suggèrent fortement que l'hétérozygotie oligogénique pourrait expliquer une proportion significative des causes de l'asthénotératozoospermie. Ce projet ouvre la voie à d'autres études, chez la souris - pour confirmer que l'accumulation de défauts génétiques hétérozygotes est associée à d'autres anomalies du sperme comme l'azoo/oligozoospermie et chez l'homme, pour évaluer l'importance des défauts oligogéniques dans l'infertilité masculine idiopathique, afin d'améliorer l’efficacité des diagnostiques génétiques.

Apport de l’exome dans le diagnostic étiologique des blocages de la maturation spermatique.

F Ghieh, AL Barbotin, C Leroy, N Swierkowsky-Blanchard, J Fortemps, C Le Sciellour, C Hue, B Herve, S Jaillard^,, M Albert, M Bailly, V Izard, F Marcelli, J Pravisoran, V Serazin, M Delcroix, HJ Garchon, A Louboutin, B Mandon-Pepin, S Ferlicot, F Vialard

Introduction : Les arrêts de maturation testiculaires (AM) sont à l’origine de la forme la plus sévère d’infertilité masculine, « l’azoospermie non-obstructive », avec absence de production de spermatozoïde. L’identification des étiologies de cette pathologie est donc un enjeu dans le cadre de la prise en charge des patients, pour lesquels une biopsie testiculaire (BT) est réalisée. Avec l’émergence des nouvelles technologies d’analyse du génome: analyse chromosomique sur puce à ADN (ACPA) et/ou l’analyse de l’exome (WES), différentes anomalies génétiques sont rapportées comme à l’origine des AM chez les patients. En revanche, aucune de ces analyses génomiques n’a été introduite dans la routine clinique de prise en charge des patients.

Matériel et méthodes : 26 patients avec AM homogènes sur l’ensemble des tubes séminifères ont été inclus dans cette étude. Pour chaque patient, une SNP-ACPA et un WES ont été réalisés. Tous les variants considérés comme pathogènes ont été validés par méthode Sanger, et une étude de l’expression de la protéine sur coupe testiculaire des patients et de contrôles a été réalisé.

Résultats : Aucune anomalie du nombre de copies n’a été identifiée en ACPA permettant d’expliquer l’AM, pour l’ensemble des patients. En réalisant le WES, il a été identifié des mutations homozygotes et hétérozygotes composites chez 15 patients.

Discussion et perspectives : Ces résultats ont confirmé l'étiologie génétique de la plupart des patients avec AM, avec une fréquence supérieure à 50 % dans l'ensemble de la cohorte, et 100 % en ne considérant que les patients consanguins. Ils confirment la très grande hétérogénéité génétique des arrêts de maturation testiculaires. Les variants identifiés dans cette étude affectent non seulement des gènes méiotiques déjà associés à l’AM dans la littérature, mais aussi de nouveaux gènes testiculaires décrits seulement chez la souris. Ces résultats plaident pour proposer un WES aux patients atteints d'AM identifié après la BT afin d'éviter une deuxième chirurgie, même si, à l'heure actuelle, il faut prendre en considération la complexité d'une telle procédure. Davantage de données sont encore probablement nécessaires pour proposer un WES avant la chirurgie, même si une telle analyse doit être rapidement mise en place pour les patients consanguins.

Même en l’absence d’informations de nature généalogique, les données génomiques peuvent être utilisées pour estimer les coefficients d’apparentement et de fraternité — la probabilité de partager deux allèles héritées d’un ancêtre commun — de deux individus. Les matrices qui contiennent les valeurs de ces coefficients pour toutes les paires d’individus d’un échantillon sont appelées, respectivement, matrices d’apparentement et de fraternité. Une grande variété de méthodes ont été proposées pour leur estimation ; elles peuvent être calculée également pour des individus considérés comme non apparentés. Elles sont utiles dans un grand éventail de situation, par exemple pour l’estimation de l’héritabilité (additive et de dominance) ou pour la prise en compte d’une structure de population dans les analyses d’association avec le génome entier.

La méthode d’estimation la plus simple qui a été proposée pour des données génétiques, dite « méthode des moments », peut-être facilement transposée au cas de données de séquence ; cependant, pour des données de séquences peu profondes (inférieure à 10x) elle produit des estimateurs biaisés. Nous proposons ici une méthode simple et robuste pour estimer et compenser le biais de ces estimateurs.

Les propriétés de la méthode sont illustrées sur des données simulées à partir des données généalogiques de la population isolée du Cilento (Italie), ce qui permet d’obtenir un échantillon d’individus avec un large éventail de coefficients d’apparentement et de fraternité connus. Notre méthode est plus rapide que les logiciels existants pour l’estimation de l’apparentement sur des données de séquence peu profondes, et d’une précision comparable. De plus les méthodes existantes nécessitent l’application de logiciels tiers, ou reposent sur des modèles statistiques qui pourraient ne pas toujours être pertinents. En revanche, notre package R LoKi, disponible sur github à l’adresse https://github.com/genostats/LoKi/, est autonome et sa flexibilité lui permet de traiter des données de faible profondeur issues de scénarios divers.

L’annonce d’un diagnostic de maladie génétique à un patient implique souvent pour lui la nécessité morale, voire légale, d’en informer sa parentèle à risque. L’objectif de cette Information Génétique de la Parentèle (IGP) est i) de permettre une prise en charge plus précoce des apparentés malades en limitant l’errance diagnostique,  ii) de mettre en place des mesures préventives en informant les futurs parents.

Les enjeux médicaux et éthiques entourant l’IGP en font une problématique universelle, à laquelle les pays ont répondu différemment pour des raisons culturelles, de pratique médicale, d’organisation du système de santé et de cadre légal.

En France la réglementation encadre de manière très stricte l’IGP, qui est légalement obligatoire depuis 2011. A partir d’une situation décrite comme particulièrement difficile par certains patients et associations de malades, est né IGPrare, une recherche collaborative et transversale fondée sur l’expérience de malades ayant dû informer leurs apparentés (soutenue par l'Agence de Biomédecine). L’objectif est de comprendre les mécanismes en jeu lors de l’IGP et de proposer des améliorations concrètes.

En synergie avec cette étude de la situation française, il nous a paru nécessaire de documenter à l’échelle européenne les difficultés rencontrées, mais aussi de mettre en lumière la diversité des solutions médicales, réglementaires ou associatives mises en place pour y répondre.

Favoriser l’échange de solutions originales entre pays européens afin de niveler par le haut les pratiques médicales est d’ailleurs au cœur de l’activité d’Eurordis, la fédération européenne d’associations de maladies rares, dont 80% sont génétiques. Partenaire naturel d’un tel projet, Eurordis y apporte ses compétences, sa légitimité et ses ressources logistiques, depuis l’élaboration et la diffusion du questionnaire au travers de son réseau, jusqu’au partage des résultats européens et français.

Nous focalisons nos recherches sur une dizaine de maladies dans six pays d’Europe, pour lesquels nous documentons le cadre légal, les modalités pratiques de réalisation de l’IGP et les expériences des patients auprès d’une cinquantaine d’associations.

Les volets français et européen ont été élaborés de façon à pouvoir se dérouler en parallèle et alimenter mutuellement leurs réflexions. Ainsi les solutions européennes viendront enrichir les débats autour de l’optimisation de l’IGP en France, réciproquement les associations européennes pourront partager les informations collectivement produites et se saisir des mécanismes déterminants de l’issue du volet français. 

Par son approche multi-maladie et européenne, IGPrare propose une analyse approfondie des mécanismes qui sous-tendent l’efficacité et l’acceptabilité de l’IGP en y intégrant notamment les paramètres culturels et législatifs influençant l’issue de cette démarche. A terme, l’objectif est de favoriser les solutions qui garantissent une meilleure qualité de vie et de prise en charge médicale.

Introduction : L'évolution génétique rapide que nous avons eu ces dernières années a permis de mieux comprendre et de mieux gérer les maladies communes et rares et a eu un impact considérable sur le traitement et la réponse à la thérapie.  Ce développement a commencé principalement en raison de l'achèvement du projet du génome humain en 2003, qui a déclenché des avancées biotechnologiques majeures qui n'ont pas encore cessé. Par conséquent, la génétique a commencé à être considérée comme une discipline prédominante, qui peut avoir un impact sur la pratique clinique quotidienne. En effet, en raison des progrès de la génomique, un nombre croissant de directives cliniques suggèrent désormais l'intégration de tests génomiques et/ou thérapeutiques dans les soins systématiques de routine. La génétique devenant de plus en plus fondamentale dans la compréhension et la gestion des pathologies, il est nécessaire de comprendre quelle est la manière la plus efficace de prendre en charge les personnes affectées ou à risque de pathologies génétiques. Dans ce contexte, l'équipe qui s'occupe de ces patients a évolué avec l'émergence de la profession de conseillers en génétique. Cette dernière est apparue en Europe en 1980, mais elle est encore très discutée et n'est pas encore reconnue dans tous les pays européens. Objectif - L'objectif de cette recherche est d'étudier à la fois comment une équipe devrait être composée dans la prise en charge des patients atteints ou à risque de pathologies génétiques et quel devrait être le rôle du conseiller en génétique - son champ d'action et ses compétences – en Europe. Méthodologie : Nous avons réalisé une étude européenne, en soumettant un questionnaire en ligne aux médecins généticiens sur les points forts et les domaines potentiels d'amélioration sur la profession de conseiller en génétique. Après une étude bibliographique, un questionnaire en ligne composé de 15 questions a été élaboré sur la plateforme Qualtrics. Dans la première partie du questionnaire, la démographie a été étudiée, et dans la deuxième partie, la procédure du conseil génétique a été étudiée. La dernière partie concerne la composition de l'équipe et en particulier sur le rôle du conseiller en génétique. Résultats - 123 généticiens ont participé à cette étude. Il en est ressorti l'importance de la présence du conseiller en génétique dans l'équipe multidisciplinaire et ce que devraient être les compétences et les qualifications du conseiller en génétique. Grâce à ces données, il a été possible de mettre en évidence les différentes approches européennes. Bien que cette nouvelle profession ait des difficultés de reconnaissance dans certains pays, il semble clair que ces professionnels hautement compétents sont essentiels dans les soins aux patients et dans l'équipe multidisciplinaire.

Le syndrome de Phelan-McDermid (SPM) est un trouble neurodéveloppemental rare et complexe caractérisé par un retard global de développement, des troubles du langage variant du retard d’apparition à l’absence totale de langage, une déficience intellectuelle, des symptômes autistiques et de nombreuses comorbidités somatiques notamment rénales, ophtalmologiques, gastriques. Le SPM est lié à l‘haplo insuffisance du gène SHANK3 localisé en 22q13.3 du fait d’une délétion hétérozygote de la région ou d’un variant tronquant de SHANK3. SHANK3 code une protéine d’échafaudage de la région dense post-synaptique des neurones glutaminergiques. Une méta-analyse a montré que les mutations SHANK3 concernent 0.69 % des patients atteints de TSA et sont présentes chez 2.12 % des patients présentant une déficience intellectuelle modérée à sévère. 

En vue de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques aux patients présentant un SPM, une étude de notre groupe a sélectionné 202 composés pharmacologiques, dont certains référencés comme approuvés par la Food and Drug Administration pour leur capacité potentielle à augmenter la transcription de SHANK3 dans les neurones glutamatergiques différenciés à partir de cellules souches humaines. Quatre composés sont apparus comme permettant d’augmenter significativement le niveau d’ARNm SHANK3 et de la protéine et, par conséquent, d’augmenter sa transmission glutamatergique. Nous avons ensuite généré des IPSc à partir de quatre individus atteints d’un TSA, porteurs de variants tronquants de SHANK3. Nous avons ainsi validé l'efficacité de ces composés dans le contexte génétique des patients. Un des composés identifiés est le carbonate de lithium (Li +).

Prescrit chez une jeune fille de 17 ans atteinte d’un TSA portant une mutation frameshift dans SHANK3, nous avons observé une amélioration significative de sa capacité à communiquer, de sa motivation sociale  (diminution du score total à la Social Responsiveness Scale après 3 mois de traitement). D’autres études rapportent une efficacité du lithium sur d’autres symptômes, en particulier les troubles du comportement. Par ailleurs, des modèles cellulaires et animaux porteurs de mutations SHANK3 confirment que le Lithium restaure l’homéostasie des synapses et réduit les comportements répétitifs chez la souris.

Le centre d’excellence autisme et trouble du neurodéveloppement (InoVAND), le laboratoire de cytogénétique de l’hôpital Robert Debré (Paris) - référant pour les TSA et SPM, et les équipes  du Pr T. Bourgeron à l’institut Pasteur vont initier un essai thérapeutique de phase II dont l’objectif principal est d’évaluer l’effet du Li + à 12 semaines sur le déficit de communication sociale chez les patients  ayant un SPM et un TSA.

Nous présenterons ici les conditions de cet essai thérapeutique à savoir ses objectifs, ses critères d’évaluations, et ses critères d’inclusion et d’exclusion. Nous partagerons également les écueils et difficultés rencontrés dans la mise en place du projet.

Les RASopathies sont un groupe de pathologies de troubles du développement causées par des mutations germinales dans des gènes codant des protéines de la voie RAS-MAPK. Leur dérégulation peut avoir des conséquences majeures sur le développement. L’utilisation de techniques de séquençage haut débit pour le diagnostic prénatal de ces pathologies a permis d’améliorer le rendement de leur diagnostic moléculaire et de préciser les anomalies fœtales associées (1).

Cette étude dresse le bilan de trois années de diagnostic prénatal du syndrome de Noonan et autres RASopathies réalisé en soins courant.

La cohorte se compose de 104 prélèvements fœtaux adressés au laboratoire pour suspicion de syndrome de Noonan et autres RASopathies. La présence d’un variant pathogène ou probablement pathogène a été recherchée par séquençage haut débit d’un panel de 32 gènes (A2ML1, ACTB, ACTG1, BRAF, CBL, CCNK, CDC42, EPHB4, FGD1, HRAS, KAT6B, KRAS, LZTR1, MAP2K1, MAP2K2, MAP3K8, MRAS, NF1, NRAS, NSUN2, PPP1CB, PTPN11, RAF1, RASA1, RASA2, RIT1, RRAS, SASH1, SHOC2, SOS1, SOS2, SPRED1). Les variants sont classés selon les recommandations de l’ACMG (2). Les données échographiques au moment du diagnostic, les issues de grossesses et les éventuelles données cliniques postnatales ont été recueillies pour l’ensemble des échantillons.

Nous avons retenu 17 (16%) variants (probablement) pathogènes au sein des gènes du panel. 47% concernent le gène PTPN11. Deux variants sont identifiés au sein des gènes HRAS, RAF1 et SOS1 et un variant au sein des gènes NRAS, RIT1 et SOS2. L’analyse de la ségrégation familiale montre que la majorité de ces variants sont de novo. Un variant de signification incertaine est identifié au sein du gène RAF1 et est en cours d’exploration. Comme récemment décrit (1)(3), les fœtus atteints de RASopathies présentent le plus souvent de multiples signes d’appel échographique parmi lesquels : une clarté nucale augmentée (≥3,5 mm), la présence de sacs jugulaires persistants, un anasarque foeto-placentaire, des œdèmes sous cutanés, un épanchement pleural uni ou bilateral, une ascite, des malformations cardiaques et/ou rénales, un polyhydramnios. Un seul autre cas de variant SOS2 prénatal a été décrit très récemment (4).

Le spectre mutationnel et d’anomalies fœtales de cette cohorte française est très comparable à ce qui a été précédemment rapporté dans la littérature. Cependant, les anomalies échographiques ne sont pas spécifiques des RASopathies. La question se pose de la réalisation d’emblée d’une analyse d’exome à la recherche d’autres pathologies dont les signes d’appel échographiques pourraient être similaires mais avec le risque de découvertes incidentes (5)(6).

(1) Stuurman et al. J Med Genet. 2019;56:654-661. 

(2) Richards et al. Genet Med. 2015;17:405–424

(3) Sparks et al. N Engl J Med. 2020;383:1746-1756.

(4) Gentile et al. Am J Med Genet A. 2021;185:1897-1902.

(5) Lord et al. Lancet. 2019;393:747-757.

(6) Petrovski et al. Lancet 2019;393:758-67.

Les présentes recommandations s’inscrivent dans la continuité de celles de l’ANPGM (BP-ANPGM_009 : élaboration d’un compte rendu de résultats obtenus par NGS) qu’elles étendent pour les examens de séquençage haut-débit à caractère pangénomique (exome, génome, transcriptome…).

Elles comportent une notice technique abordant les principales problématiques rencontrées dans cette gamme d’examen ainsi que trois comptes rendus, fournis à titre d’exemples (un pour le séquençage d’exome, deux pour le séquençage de génome).

Le contenu des comptes rendus est soumis aux exigences normatives et réglementaires, en particulier, la Norme NF EN ISO 15189 et le SH-REF02, ainsi que l’arrêté du 27 mai 2013 définissant les règles de bonnes pratiques applicables à l'examen des caractéristiques génétiques d'une personne à des fins médicales.

Ces recommandations décrivent les notions qui doivent figurer sur la première page du compte rendu (identification de l’examen, indication de l’examen,  méthode d’analyse, résultat, interprétation et conclusion) ainsi que les items qui peuvent être ajoutés en annexe du compte rendu (méthode analytique, limites techniques, performances de l’examen, périmètre effectif de l’interprétation des données, qualité, politique analytique et post-analytique du laboratoire).

Ces recommandations abordent également la gestion des variations de signification incertaine (VSI), la gestion des variations secondaires et incidentes ainsi que la gestion de la flexibilité des comptes rendus.

Ces nouvelles recommandations s’inscrivent dans l’évolution continuelle des examens de séquençage, et permettent d’avoir une trame qui respecte les réglementations et qui peut s’adapter à l’organisation de chaque laboratoire.

Introduction : Le bilan étiologique des anomalies du développement et de la déficience intellectuelle (AD/DI) a grandement bénéficié des technologies de séquençage d’exome (ES) et de génome (GS). Au cours des dernières années a émergé la question des diagnostics moléculaires multiples (DMM), allant de 1,8% à 7,1% des diagnostics positifs identifiés par ES/GS dans la littérature. Nous présenterons les résultats d’une étude prospective et rétrospective dédiée à l’identification et la caractérisation des diagnostics moléculaires multiples (DMM) au sein d’une cohorte de 2346 patients atteints d’AD/DI.

Méthodes : Entre 03/2014 et 12/2020, notre laboratoire a rendu 730 diagnostics positifs identifiés par ES chez des patients atteints d’AD/DI. A partir de 01/2019, la recherche approfondie de DMM sur les données d’ES a été mise en place, d’une part en prospectif et d’autre part en rétrospectif sur l’ensemble des données d’ES rendues entre 03/2014 et 12/2018.

Résultats : Dans la cohorte prospective (01/2019 à 12/2020), parmi les 421 ES positifs, 18 (4,3%) présentaient un DMM et 17 (4%) incluaient une variation de signification inconnue (VSI) avec une forte probabilité d’être reclassée ; le taux diagnostique global était de 8,3%. Dans la cohorte rétrospective (03/2014 à 12/2018), parmi les 309 ES positifs, la réanalyse de 126 ES est à ce jour disponible (ES rendus avant 2017), incluant 3 DMM (2,4%) et 6 DMM avec une VSI (4,8%) ; le taux diagnostique global était de 7,1%. L’analyse rétrospective est encore en cours pour les résultats rendus en 2017 et 2018, et sera disponible dans les semaines à venir. Les modes de transmission, types de variations, proportion des variations du nombre de copies, le caractère hérité, la contribution des VSI, la temporalité des DMM et les caractéristiques des patients seront discutés.

Discussion : Les taux de DMM, respectivement 4,3% (8,3% en incluant les VSI) et 2,4% (7,1% en incluant les VSI) pour les cohortes prospective et rétrospective, sont en rapport avec la littérature. Deux des 3 DMM retrouvés lors de l’analyse rétrospective n’avaient pas été identifiés lors du rendu diagnostique initial car le gène n’était pas encore impliqué en pathologie humaine. Les taux de DMM s’avèrent variables car ils dépendent de la prise en compte de ce concept par l’équipe d’interprétation, de la mise à jour de données cliniques évolutives, de la connaissance croissante des gènes impliqués en pathologie humaine (gènes non encore connus, VSI non encore reclassées) et de l’amélioration des outils bio-informatiques. Les DMM semblent être sous-estimés dans les AD/DI alors même qu’ils impactent significativement les patients et leurs familles pour le conseil génétique, le dépistage anténatal et un suivi personnalisé. Ils participent également à une meilleure définition des spectres phénotypiques. Les DMM identifiés par réanalyse des données positives interrogent sur la nécessité de réanalyser les ES positifs, à la demande ou systématiquement.

La déficience intellectuelle (DI) est un trouble neuro-développemental fréquent touchant 1 à 3% de la population et d’origine majoritairement génétique. Par séquençage à haut débit d’exome chez des patients atteints de DI sévère puis après un appel à collaboration internationale sur GeneMatcher, le gène SEMA6B a été identifié comme un bon candidat pour la DI. Quatorze variations dont onze jamais décrites dans la littérature (quatre faux-sens, six frameshift et quatre non-sens dont deux récurrents) ont ainsi été identifiées chez seize patients non apparentés atteints de déficience intellectuelle sévère à modérée sans dysmorphie reconnaissable ni malformation. Les patients avaient un langage limité à quelques mots ou absent, des troubles de motricité globale et de motricité fine, des stéréotypies et une épilepsie pour la majorité d’entre eux. Des données d’imagerie cérébrale étaient disponibles pour 7 patients, mentionnant des anomalies modérées et non spécifiques chez 3 d’entre eux : atrophie corticale, atrophie cérébelleuse, corps calleux fin ou court, syndrome d’interruption de la tige pituitaire. Le gène SEMA6B code la protéine sémaphorine 6B, une protéine chimiorépulsive inhibant la croissance axonale lors du développement du système nerveux central. Afin de démontrer l’implication de ce gène dans un phénotype neurodéveloppemental, nous avons initié des études fonctionnelles en générant des constructions plasmidiques contenant la forme sauvage ou mutée du gène Sema6b (cDNA murin). Ces constructions ont été surexprimées dans des lignées cellulaires (HEK293T) puis dans des cultures primaires de neurones hippocampiques de souris. Dans un premier temps, nous avons évalué l’impact de ces mutations sur la stabilité des protéines par Western Blot dans les cellules HEK293T et sur leur localisation subcellulaire par immunocytochimie dans les cellules HEK293T et les cultures neuronales. Les conséquences induites par les variations du gène Sema6b sur la morphogenèse et la synaptogenèse ont également été évaluées via l’étude de différents paramètres neuronaux tels que la morphologie, l’arborisation dendritique ou encore la densité synaptique dans les cultures de neurones après analyse en microscopie confocale. Les résultats montrent un impact des variations non-sens sur la localisation subcellulaire de la protéine que ce soit dans les lignées cellulaires HEK293T ou dans les neurones. De plus, les variations semblent altérer la densité synaptique des neurones et la maturation des épines dendritiques. Ces résultats suggèrent que l’expression d’un variant protéique de SEMA6B pourrait altérer la morphogenèse neuronale. Cette étude permet donc de valider la pathogénicité de ces variations et plus largement de démontrer le rôle de la sémaphorine 6B dans la physiopathologie de la DI.