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C11
09:00 - 12:00

4EME SYMPOSIUM TRANSCRIPTION, EPISSAGE ET DIAGNOSTIC

Modérateurs : Christèle DUBOURG (MCU-PH) (Rennes), Claude HOUDAYER (Rouen Cedex)
09:00 - 09:01 SESSION 1: EPISSAGE, PREDICTIONS IN SILICO.
09:00 - 09:10 #28187 - EP01 Les isoformes de p53 comme facteur modificateur du syndrome de Li-Fraumeni ?
EP01 Les isoformes de p53 comme facteur modificateur du syndrome de Li-Fraumeni ?

Le syndrome de Li-Fraumeni (LFS) résulte d’une altération délétère constitutionnelle du gène TP53 et prédispose à un large spectre tumoral. Le gène TP53 est régulé par plusieurs promoteurs et est soumis à un épissage alternatif complexe à l’origine d’isoformes capables de se réguler entre elles, mais le diagnostic moléculaire repose à ce jour uniquement sur l’interprétation des conséquences des variants sur la forme canonique de p53 (FLp53alpha). Nous souhaitons tester l’hypothèse d’un impact des variations de TP53 sur le taux des différentes isoformes et qu’un déséquilibre de ces isoformes pourrait moduler l’activité de p53 et expliquer une partie de la variabilité phénotypique.

Nous avons mis au point une RT-ddPCR (Droplet Digital RT-PCR) pour évaluer l’expression de l’ensemble des transcrits de TP53 comparée à l’expression d’un gène contrôle, ainsi que 2 longues RT-ddPCR permettant d’analyser en parallèle l’expression de 6 transcrits. À l’aide de cette approche, nous avons analysé l’expression des isoformes de TP53 dans plusieurs lignées lymphoblastoïdes de patients avec variation hétérozygote de TP53. Nous avons pu détecter les isoformes longues (FL) et courtes (DeltaN) en version alpha, beta et gamma, bien que les isoformes alternatives soient très peu représentées dans ce tissu.

Nous avons testé l’impact d’une délétion complète de TP53 et d’une délétion emportant le promoteur P1 et l’exon 1. Ces 2 délétions entraînent une diminution d’expression de TP53 de 50 %, en comparaison au génotype wt.

La délétion P1-ex1 entraîne une diminution de moitié des formes longues et des formes courtes. Ce résultat est similaire à celui observé avec la délétion totale. Le manque de sensibilité ne nous permet néanmoins pas de conclure à l’absence d’utilisation du promoteur P2 en cas de délétion du promoteur P1.

Nous avons ensuite évalué l’impact d’une variation d’épissage c.375G > A, détruisant le site donneur d’épissage, à l’origine d’une délétion de 200 nucléotides sur l’ARNm par utilisation d’un site cryptique dans l’exon 4. Cette variation entraîne également une diminution d’expression de TP53 de 50 % mettant en évidence une dégradation par le système NMD. De façon intéressante, cette variation est localisée dans le promoteur P2 au niveau d’un élément de réponse à p53 et pourrait donc potentiellement affecter la production des isoformes courtes DeltaN. À l’aide de notre essai, nous avons détecté 100 fois plus de ces isoformes que dans les autres lignées. Nous avons alors entrepris de déterminer s’il s’agit réellement de formes courtes ou d’une rétention totale de l’intron 4. Nous avons ainsi mis en évidence un épissage plus complexe avec des transcrits additionnels détectés à faible taux (rétention intronique partielle…).

Ces premiers résultats illustrent la complexité de la régulation des différentes isoformes de p53 et montrent qu’il est possible d’appréhender l’impact des variants sur leur niveau d’expression à l’aide d’un test simple basé sur la ddPCR.


Jeanne LOUIS (ROUEN), Françoise CHARBONNIER, Marion ROLAIN, Céline DERAMBURE, Claude HOUDAYER, Isabelle TOURNIER, Gaëlle BOUGEARD
09:10 - 09:20 #28784 - EP02 Le séquençage du génome : un accès à l’étude du rôle des variants introniques profond dans les maladies rares.
EP02 Le séquençage du génome : un accès à l’étude du rôle des variants introniques profond dans les maladies rares.

Le positionnement du séquençage de génome dans la démarche diagnostique après une étude ciblée des gènes connus pour être impliqués dans la pathologie suspectée pose la question de son apport dans le cadre du diagnostic/soin. Les patients négatifs pour les investigations ciblées peuvent être présentés à une RCP d’amont en vue de la réalisation d’un séquençage de génome par SeqOIA ou AURAGEN. Nous attendons donc que le séquençage de génome détecte des variations inaccessibles aux précédentes techniques, ce résumé se concentre sur les variations introniques profondes.

            Un séquençage de génome identifie en moyenne 5.2 millions de variations ponctuelles et petites insertions-délétions, quasiment toutes introniques ou intergéniques. Les connaissances actuelles se concentrent sur la mesure ou la prédiction d’impact sur l’épissage de variations ponctuelles introniques. Très peu de connaissances sont disponibles sur la qualification ou la quantification de l’impact de variations intergéniques. A partir des variations interprétées de ClinVar, nous avons évalué l’intérêt de deux scores actuels (SpliceAI et CADDv1.6) pour discriminer systématiquement les variations introniques pathogènes ou probablement pathogènes, des variations bénignes ou probablement bénignes.

SpliceAI permet de catégoriser une variation pathogène ou probablemnet pathogène avec une sensibilité de 47% et une spécificité de 98%. En particulier, la prédiction juste de gain de site accepteur ou donneur est plus complexe que les pertes. Nous avons complété ce score par l’usage du CADDv1.6 pour améliorer la sensibilité de prédiction. Après une période d’évaluation par le groupe de praticiens AURAGEN, des seuils ont été proposé pour que les variations figurent dans le rapport de synthèse. En moyenne, 5-10 variations par examen sont rapportées. A l’échelle génomique, les annotations restent disponibles pour chaque variation dans l’interface de tri de variations.

Cette approche a permis dès les premiers mois d’identifier des variations introniques d’intérêt diagnostic.

-       Variation en trans d’une variation codante d’une pathologie récessive probable (PKHD1, c.8643-597A>G ; RTTN, c.1802+47G>A ; SETX, c.5549-107A>G ; VAMP1, c.341-24_341-9delinsAGAAAA ;

-       Variation récurrente pathogène (UFM1, c.-273_-271delTCA) ;

-       Variations profondes dans un gène déjà connu pour être impliqué dans la pathologie suspectée (COL4A5, c.2918-244A>G, et c.3809-1066A>G ; IKBKG, c.519-23A>C).

L’interprétation diagnostique de variations introniques reste difficile mais devient possible. Les cas rapportés ici soulignent l’apport diagnostic de tels variants. Il est important de considérer systématiquement certaines variations, mais aussi de fouiller l’interprétation de variations candidates. Afin de conclure sur la pathogénicité ou non de ces variations introniques profondes des analyses complémentaires réalisées dans les laboratoires experts de diagnostic ou de recherche.


Laurence MICHEL-CALEMARD (LYON), Claire GOURSAUD, Gaetan LESCA, John RENDU, Gaelle HARDY, Quentin CHARRET, Valentin KLEIN, Anne THOMAS, Yasmine ZERDOUMI, Nicolas CHATRON, Charles COUTTON, Isabelle CREVEAUX, Caroline JANEL, Marine LEBRUN, Xénia MARTIN, Céline PEBREL, Harbuz RADU, Gaelle SALAUN, Caroline SCHLUTH-BOLARD, Renaud TOURAINE, Guilaine BOURSIER, Consortium AURAGEN, Virginie BERNARD, Alain VIARI, Damien SANLAVILLE, Julien THEVENON
09:20 - 09:30 #28136 - EP03 SpliceAI-visual : accédez à la pleine puissance de SpliceAI avec l’analyse graphique des scores absolus.
EP03 SpliceAI-visual : accédez à la pleine puissance de SpliceAI avec l’analyse graphique des scores absolus.

Le logiciel SpliceAI apparait comme l’un des meilleurs prédicteurs d’épissage à ce jour (PMID:30661751;32123317;34289339). Il a rapidement conquis la communauté des généticiens moléculaires et son application à l’échelle génomique implique une utilisation simple et une visualisation intuitive. Cependant, l’interprétation des résultats de SpliceAI présente plusieurs limites. Premièrement, l’annotation standard de SpliceAI pour un variant donné se présente sous la forme peu intuitive de 8 nombres : 4 valeurs indiquant la différence de score (delta score) d’un site d’épissage entre l’allèle de référence (REF) et l’allèle alternatif (ALT), associées aux 4 positions nucléotidiques respectives sur l’ARN prémessager des sites altérés. Deuxièmement, les valeurs obtenues correspondent à des données relatives (delta score), ne permettant pas de connaître les valeurs absolues des prédictions de SpliceAI ; ces valeurs absolues sont nécessaires, par exemple, pour présumer du résultat de la compétition de deux sites proches. Troisièmement, les variants de type delins complexe ne sont pas annotés par la version standard de SpliceAI.

Pour remédier à ces limitations, nous avons développé SpliceAI-visual, un outil qui permet de visualiser les prédictions absolues de SpliceAI dans un navigateur génomique. L’utilisation de cet outil est gratuite et s’effectue en ligne sans aucune installation. Cet outil permet d’obtenir les prédictions de SpliceAI pour chaque nucléotide sur l’ensemble du gène, une fois avec la séquence de référence, une fois avec la séquence alternative, où le variant désiré a été introduit. Deux fichiers sont générés (REF, ALT) qui sont compatibles avec les navigateurs génomiques UCSC Genome Browser et IGV. Outre le remplacement des 8 nombres de la sortie analytique de SpliceAI par une visualisation graphique dynamique, cet outil permet (i) d’accéder aux valeurs absolues des prédictions de SpliceAI, facilitant l’interprétation des variants qui altèrent deux sites compétitifs proches, et (ii) de connaître les prédictions de SpliceAI pour des variants non annotés par la version standard de SpliceAI (e.g. deux substitutions en cis, delins complexes, insertions ou délétions de plusieurs kb).

L’utilisation en routine de SpliceAI-visual a facilité l’interprétation de nombreux variants ; il a notamment permis de classer des variants complexes, de guider la position d’amorces de validation fonctionnelle, de visualiser les altérations d’épissage touchant plusieurs exons à la fois, ou de connaître facilement la phase de sites d’épissages prédits.


Jean-Madeleine DE SAINTE AGATHE (PARIS), Boris KEREN, Victoria DE SAINTE AGATHE, Linda MOUTHON, Michel VIDAUD, Éric LE GUERN, Marine GUILLAUD-BATAILLE, Mathilde FILSER, Fabienne CLOT, Lionel ARNAUD, Pierre BLANC
09:30 - 09:40 #28432 - EP04 uORF-creating-mutations in Van der Woude syndrome: why it is important to study 5’UTRs.
EP04 uORF-creating-mutations in Van der Woude syndrome: why it is important to study 5’UTRs.

The Van der Woude syndrome (VWS, MIM 119300), is an autosomal dominant disorder characterized by cleft lip with or without cleft palate, or isolated cleft palate, due to loss-of-function mutations in IRF6 (Interferon Regulatory Factor-6) or GRHL3 (Grainyhead-Like Transcription Factor 3). Most patients show pits on their lower lips. In VWS, most IRF6 alterations are premature stop codons or missense mutations. Pathogenic upstream open reading frame (uORF) mutations are characterized by an out-of-frame upstream start codon (uAUG) located in the 5’UTR and leading to a premature stop codon. uORFs overlap the usual ATG start codon and have a minimum length of 9 nucleotides. We assessed the main features of six uORF-creating mutations identified in VWS patients (two in the lab and four previously described). We also determined all the theoritical SNVs located in IRF6 5’UTR (NM_006147.4) that could create an uORFs and we assessed their potential pathogenicity based on Kozak site in silico prediction.

Only four uORF-creating mutations in IRF6 have been previously associated with VWS to date. We report here two novel mutations creating out-of-frame uAUGs (c.-141C > T p.? and c.-162C > T p.?) that probably reduce IRF6 expression. In our lab, IRF6 mutations are found in about 80% of families with VWS and uORFs-creating mutations represent of 3.2% of them (2/63). Previous studies identifying uORFs-creating mutations did not provide detailed phenotypic data. In our group, in the 6 heterozygotes for c.-141C > T, three had a cleft lip with or without cleft palate and three had only a bifid uvula. The patient heterozygote for c.-162C > T had a posterior cleft with an ankyloblepharon.

Most genes naturally have uORFs in their 5’UTR region, nonetheless we observed that there were no physiological uORF in IRF6. All 6 uORFs identified in VWS had the same termination codon that occurs in exon 3 (56 nucleotides after the usual ATG). To go further, we searched for all potential uAUG-creating SNV in IRF6 5’UTR. We identified 41 of them, including the 6 identified in patients. Except one, none of them is present in the gnomAD control population.  Using a machine-learning-based tool (TIS Predictor, biorxiv.org/content/10.1101/2021.08.17.456657v1, 0 to 1 score range), we then assessed each Kozak similarity score. All 6 uORFs identified in patients had high scores comprised between 0.71 and 0.83, compared to 0.81 for the usual ATG. Among the 35 theoritical SNVs creating an uAUG, 10 may create a potential but weak Kozak site (score range: 0.50-0.71).

In conclusion, uORF-creating mutations can thus be responsible for typical VWS. As untranslated regions are not included in most captured regions in high throughput sequencing strategies, this category of variants may be underdiagnosed in VWS and in human pathology in general.


Magalie LODIN (Paris), Julie GALIMAND, Florence DASTOT-LE MOAL, Sandra MERCIER, Lucile PINSON, Nathalie COLLOT†, Serge AMSELEM, Marie LEGENDRE
09:40 - 10:00 TABLE RONDE DISCUSSION AVEC LES ORATEURS.
10:00 - 10:01 SESSION 2: MINIGENE.
10:00 - 10:10 #28323 - EP05 Mise en place d’un test fonctionnel d’épissage par minigène : application au diagnostic des diabètes monogéniques.
EP05 Mise en place d’un test fonctionnel d’épissage par minigène : application au diagnostic des diabètes monogéniques.

Contexte. Les diabètes MODY sont des diabètes monogéniques (DM) de transmission autosomique dominante représentant 2 à 3% de tous les diabètes. L’identification du gène impliqué a des conséquences pronostiques et thérapeutiques pour le patient et sa famille. 70% des diabètes MODY sont dus à des variants des gènes GCK, HNF1A et HNF4A, et environ 9% de ces variants sont susceptibles d’altérer l’épissage. Ces gènes étant non exprimés dans le sang et les fibroblastes et le tissu d’intérêt (pancréas) étant difficile d’accès, une analyse par RT-PCR n’est pas envisageable pour déterminer leur impact sur l’épissage. Par ailleurs, les prédictions bioinformatiques d’impact sur l’épissage ne sont pas toujours concordantes et demeurent parfois non conclusives. Par conséquent, les minigènes offrent une approche alternative en permettant d’étudier l’épissage sans recourir au transcrit du patient.

Objectif. Mise en place d’un test minigène pour caractériser l’impact sur l’épissage des variants identifiés au laboratoire dans les 3 principaux gènes du MODY.

Méthodes. 1) Sélection des variants d’intérêt : variants exoniques faux-sens, variants au site consensus d’épissage (site accepteur : -20 à +3 ; site donneur : -3 à +6 ; à l’exclusion des variants aux sites canoniques ± 1 et 2) et variants introniques plus profonds. 2) Analyse bioinformatique basée sur 3 algorithmes de prédiction d’épissage ([MES+SSFL], SPiP et SpliceAI) et priorisation des variants avec un impact sur l’épissage prédit 1 algorithme. 3) Test minigène : clonage de la région d’intérêt (exon ± 150 pb) dans le vecteur d’expression (pCAS2), transfection dans la lignée cellulaire HeLa, RT-PCR des transcrits minigène, analyse du profil d’épissage sur gel d’agarose et séquençage Sanger.

Résultats. Parmi 87 variants d’intérêt identifiés dans les gènes GCK, HNF1A et HNF4A, 48 (29 GCK, 11 HNF1A et 8 HNF4A) ont été prédits avec un potentiel impact sur l’épissage par ≥ 1 algorithme. Les résultats préliminaires pour 25 variants (22 GCK et 3 HNF1A) montrent que 22/25 (88%) conduisent à une anomalie d’épissage. Les 22 variants avec un impact sur l’épissage confirmé ont tous été prédits par SPiP et SpliceAI et seulement 16/22 étaient prédits par [MES+SSFL]. Parmi les 3 variants sans impact révélé par le test minigène, 2 étaient prédits comme impactés par SPiP et 1 par SpliceAI ; aucun ne l’était par [MES+SSFL].

Les 22 altérations identifiées sont des sauts d’exons (3 en phase et 1 hors phase) ; des rétentions introniques (9), des pertes de portions exoniques (6) ou des altérations multiples (3) qui altèrent le cadre de lecture.

Conclusion. Les résultats ont permis de confirmer le diagnostic moléculaire de DM chez 61 patients de 37 familles. L’objectif du projet est d’intégrer le test fonctionnel minigène de façon prospective dans le diagnostic moléculaire des 3 gènes majeurs impliqués dans les DM.


Amélie BLONDEL (PARIS), Delphine BOUVET, Julien BURATTI, Cécile SAINT-MARTIN, Christine BELLANNE-CHANTELOT
10:10 - 10:20 #28265 - EP06 Vous avez dit synonyme ? Exemple du variant c.627C>T du gène TMC1.
EP06 Vous avez dit synonyme ? Exemple du variant c.627C>T du gène TMC1.

L’épissage est un mécanisme dynamique complexe qui implique de multiples signaux d’épissage, introniques ou exoniques, présents au niveau des pré-ARNm ainsi que de nombreux facteurs trans régulateurs. Au niveau exonique, toute variation, quel que soit son effet prédit sur la protéine, peut potentiellement altérer ce mécanisme d’horlogerie. Parmi eux, les variants dits synonymes, localisés à distance des sites d’épissage, non prédits comme créateurs de sites d’épissage AG/GT, mais pouvant modifier des motifs cis régulateurs, ne sont pas encore suffisamment pris en compte dans le diagnostic moléculaire.

Nous présentons ici le variant c.627C > T ; p.(Leu209=) du gène TMC1 en exemple d’une analyse moléculaire exhaustive d’un variant synonyme.

La variation c.627C > T, à l’état homozygote, a déjà été décrite dans la littérature internationale chez deux familles Iraniennes dans lesquelles ségrège une surdité non-syndromique récessive liée au gène TMC1. Dans ces publications, ce variant n’avait pas retenu l’attention des auteurs et la transversion c.-258A > C, en cis de cette altération, avait alors été considérée comme étant probablement pathogène avec effet fondateur. A ce stade d’étude, la substitution c.627C > T pouvait être considérée comme probablement bénigne selon les critères ACMG-AMP : PM2, BP4 et BP7.

Ayant identifié le même allèle complexe chez un de nos patients d’origine turque, présentant le même type de surdité, nous avons décidé d’approfondir l’analyse de ce variant c.627C > T. Des études in silico ont prédit une modification d’éléments régulateurs par le variant induisant un saut d’exon, ce qui a ensuite été validé par une analyse minigène. Nous avons également proposé une explication quant à la présence d’une thymine chez plusieurs orthologues qui semblait, a priori, être en désaccord avec un effet délétère de la variation car non conservé. En prenant en compte l’ensemble des données recueillies nous avons pu reclasser cette substitution comme étant une variation causale (classe V) modifiant des éléments régulateurs d’épissage selon les critères ACMG-AMP :PS3, PM2, PM7, PP3 et PP6.

Ce travail, qui aura inéluctablement un impact sur la prise en charge des patients, souligne l’importance de réaliser des analyses exhaustives pour tout type de variation.


Christel VACHÉ (MONTPELLIER), David BAUX, Julie BIANCHI, Corinne BAUDOIN, Valérie FAUGÈRE, Christine FRANCANNET, Michel KOENIG, Vasiliki KALATZIS, Anne-Françoise ROUX
10:20 - 10:30 #28401 - EP07 Les avantages d’une double approche méthodologique, dans l’étude de variants potentiellement perturbateurs de l’épissage ; exemples d’études sur des variants liés aux pathologies du développement et aux cancers digestifs héréditaires.
EP07 Les avantages d’une double approche méthodologique, dans l’étude de variants potentiellement perturbateurs de l’épissage ; exemples d’études sur des variants liés aux pathologies du développement et aux cancers digestifs héréditaires.

Les techniques de séquençage nouvelle génération, (panels, WES, WGS) permettent d’identifier de nouveaux variants pour de nombreux gènes et dans de nombreuses pathologies.

Certains de ces variants sont difficiles à classer et restent de signification inconnue, classe 3 ou VUS.

Parmi ces variants, certains peuvent générer des perturbations de l’épissage et requièrent des études spécifiques afin de déterminer leur réelle répercussion sur l’épissage des transcrits.

Deux approches sont alors possibles : les études de transcrits réalisées à partir de l’ARN du patient et les tests d’épissage faisant intervenir des constructions appelées minigènes permettent d’étudier in vitro ces variants identifiés in silico comme pouvant impacter l’épissage.

Nous souhaitons attirer l’attention sur l’importance des deux approches simultanées dans l’interprétation de(s) l’effet(s) observé(s).

Pour cette étude nous avons considéré deux variants introniques identifiés dans les gènes EFTUD2 et STXBP1 impliqués dans des pathologies du développement et dans les gènes CDH1 et MLH1 impliqués dans certains cancers digestifs héréditaires.

Pour 3 des 4 variants les premiers tests réalisés sur transcrits sanguins n’avaient pas donné d’informations spécifiques alors que le minigène indiquait un effet partiel ou total sur l’épissage. Un design de primers en fonction des résultats obtenus in vitro avec les constructions minigènes, a ensuite permis de mettre en évidence chez les patients l’existence de transcrits spécifiques aux variants étudiés, dus à l’altération de l’épissage. Pour le variant EFTUD2, au vu des résultats non contributifs obtenus par la technique minigène, l’étude des transcrits a permis d’éclaircir le contexte et d’apporter une réponse.

Cette double approche transcrits sanguins et minigènes avec les avantages et limites de chaque technique, permet d’améliorer la détection de l’impact sur l’épissage de nouveaux variants et ainsi de classer ces variants inconnus permettant d’améliorer la prise en charge du patient et des apparentés.


Lénaick DETIVAUD (Rennes), Regis BOUVET, Estelle COMMUNIER, Solène MORVAN, Olivier CARON, Louise CRIVELLI, David MALKA, Mélamie FRADIN, Alinoe LAVILLAUREIX, Laurent PASQUIER, Marie-Dominique GALIBERT, Marie BEAUMONT, Christèle DUBOURG
10:30 - 10:40 #28354 - EP08 Etude comparative de l’impact des variants GT>GC sur l’épissage : mise en évidence d’une différence significative sur la génération de transcrits de type sauvage entre les analyses minigène et les analyses gène complet.
EP08 Etude comparative de l’impact des variants GT>GC sur l’épissage : mise en évidence d’une différence significative sur la génération de transcrits de type sauvage entre les analyses minigène et les analyses gène complet.

En combinant les données issues d'une méta-analyse des variants d’épissage impliqués dans des maladies génétiques humaines et les résultats d’une analyse fonctionnelle par gène complet (full-length gene splicing assay (FLGSA)), nous avons récemment estimé que 15-18% des variants du site d’épissage 5' GT > GC (c.-à-d. +2T > C) peuvent générer jusqu'à 84% de transcrits de type sauvage (Lin et al. Hum Mutat 2019).

Pour cette étude, nous avons sélectionné 20 variants +2T > C pour lesquels des transcrits de type sauvage ont été observés dans une analyse gène complet, et réalisé pour chacun de ces variants deux analyses minigène en utilisant deux vecteurs différents.

Dans le vecteur pET01, les 20 constructions minigène de type sauvage ont toutes permis de générer les transcrits de type sauvage; En revanche pour les 20 variants +2T > C correspondants, seuls 14 (70%) ont permis de générer des transcrits de type sauvage. Dans le vecteur pSPL3, les transcrits de type sauvage ont été observés pour 18 (90%) des 20 constructions minigène de type sauvage, et pour seulement 8 (44%) des variants +2T > C correspondants.

Ainsi, nous avons mis en évidence une forte discordance en terme de génération de transcrits de type sauvage, non seulement entre les analyses FLGSA et minigène, mais aussi entre les différentes approches minigène.

En conclusion, dans le contexte particulier d’un type de variant (+2T > C), nous avons montré les limites des analyses fonctionnelles par minigène, et soulignons l'importance d’étudier la régulation de l’épissage dans le contexte de la séquence entière. Il reste à déterminer si ces résultats peuvent se transposer à d’autres types de variants altérant l'épissage.


Jin-Huan LIN, Hao WU, Wen-Bin ZOU, Emmanuelle MASSON, Yann FICHOU, Gerald LE GAC, Claude FÉREC, Zhuan LIAO, Jian-Min CHEN (BREST)
10:40 - 11:00 TABLE RONDE DISCUSSION AVEC LES ORATEURS.
11:00 - 11:01 SESSION 3 : RNASEQ ET VARIANTS COMPLEXES.
11:00 - 11:10 #28435 - EP10 Place du séquençage d’ARN (RNAseq) dans un laboratoire de diagnostic.
EP10 Place du séquençage d’ARN (RNAseq) dans un laboratoire de diagnostic.

Les laboratoires de génétique sont régulièrement confrontés à des impasses diagnostiques : variants de signification incertaine (VSI) pouvant impacter l’épissage, variant unique dans un gène impliqué dans une pathologie récessive, forte suspicion clinique sans cause identifiée. L’étude des ARN constitue alors une approche complémentaire au séquençage de l’ADN génomique (DNAseq). L’objectif de ce projet est la réalisation d’un séquençage haut débit (NGS) de l’ARN après capture des régions d’intérêt (RNAseq ciblé) sur une cohorte collaborative regroupant 4 secteurs du laboratoire, afin d’en évaluer la faisabilité et l’utilité en diagnostic, par comparaison au séquençage non ciblé (RNAseq total).

La cohorte est composée de 32 patients préalablement étudiés par NGS dans les secteurs déficience intellectuelle (DI), rétinites pigmentaires, myopathies et maladies de la réparation de l’ADN. Elle regroupe 9 témoins positifs porteurs de variations affectant l’ARN, 15 patients porteurs de VSI et 8 patients sans cause moléculaire identifiée. Les ARN totaux ont été extraits de sangs, de fibroblastes cutanés ou de biopsies musculaires. Les librairies ont été préparées à l’aide du kit Agilent Sureselect XT-HS2 RNA en utilisant les sondes de capture SureSelect utilisées pour le DNAseq (panels de 210 à 550 gènes). Les données de séquençage obtenues sur HiSeq4000 ont été analysées à la recherche de variants, de transcrits anormaux et de modification du niveau d’expression. En parallèle, 8 des 32 patients ont été analysés par RNAseq total.

En moyenne, 95% des 40 millions de reads par échantillon obtenus en RNAseq ciblé sont localisés sur les gènes ciblés, à l’exception des 8 ARN issus de muscle (échec d’extraction). Pour les 24 échantillons restants, 83% des gènes ciblés sont exprimés dans les tissus étudiés (ratio d’expression normalisé RPKM > 5), une valeur similaire à celle obtenue en RNAseq total. Les différentes anomalies présentes chez les témoins positifs (saut d’exon, rétention d’intron, dégradation des ARNm non-sens ou NMD) sont identifiées dans les deux techniques, à l’exception d’une duplication hémizygote de deux exons du gène OPHN1. Les conséquences de plusieurs VSI ont pu être précisées : le variant hétérozygote, NM_001356.4:c.543+3_543+6del du gène DDX3X, apparu de novo chez une patiente atteinte de DI, conduit à un saut hors phase de l’exon 6. Un saut hors phase de l’exon 4 du gène ERCC3 a également été mis en évidence chez une patiente atteinte de Xeroderma pigmentosum et porteuse de la variation silencieuse NM_000122.1:c.483C > T p.(Val161=). Les résultats détaillés pour l’ensemble de la cohorte seront présentés.

En conclusion, la majorité des gènes d’intérêt s’est révélée suffisamment exprimée dans les tissus à notre disposition pour étudier la représentativité des variants, l’analyse du taux d’expression et la recherche d’anomalies d’épissage. Le RNAseq ciblé a montré son intérêt pour l’exploration des VSI, à un cout moindre que le RNAseq total.


Julien TARABEUX, Francesca MATTIOLI, Audrey SCHALK, Damien PLASSARD, Céline KEIME, Camille DOURLENS, Bénédicte GERARD, Valérie BIANCALANA, Jean MULLER, Amélie PITON, Nadège CALMELS (Strasbourg)
11:10 - 11:20 Utilisation du RNAseq pour l’interprétation de variations introniques profondes. Kevin CASSINARI (AHU) (Rouen)
(*)Kevin CASSINARI1, Céline DERAMBURE1, Myriam VEZAIN1, Sophie COUTANT1, Juliette COURSIMAULT1, Francois LECOQUIERRE1, Nathalie LE MEUR1, Nathalie DROUOT1, Edwige KASPER1, Stéphanie VASSEUR1, Gwendoline LIENARD1, Thierry FREBOUURG1, Claude HOUDAYER1, , Stéphanie BAERT DESURMONT1, Pascale SAUGIER-VEBER1, Gaël NICOLAS1
1.Department of Genetics, Normandie University, UNIROUEN, Inserm U1245 and CHU Rouen, F-76000 Rouen, France
11:20 - 11:30 #28486 - EP11 Mise au point d’une méthode de séquençage d'ARN longs fragments pour l’étude fonctionnelle de variants pouvant altérer l’épissage de transcrits associés à des phénotypes cliniques hétérogènes : validation par l’étude multi-parallèle de 123 variants.
EP11 Mise au point d’une méthode de séquençage d'ARN longs fragments pour l’étude fonctionnelle de variants pouvant altérer l’épissage de transcrits associés à des phénotypes cliniques hétérogènes : validation par l’étude multi-parallèle de 123 variants.

Près d’un quart des variants introniques et exoniques associés à des phénotypes d’intérêt clinique pourraient conduire à un défaut d’épissage, avec un retentissement plus ou moins important à l’échelle de la protéine et une conséquence plus ou moins marquée au niveau phénotypique. Cette estimation est difficile à vérifier car elle repose sur le croisement de données génétiques et cliniques qui ne sont généralement pas exhaustives. Quoique très importante, elle pourrait en réalité être sous-évaluée. Au-delà de l’exhaustivité de bases de données spécialisées ou de méta-analyses, il faut en effet considérer que les données généralement analysées ne prennent pas en compte l’ensemble des séquences qui participent au processus d’épissage et à sa régulation (sites 5’ et 3’, point de branchement, séquences auxiliaires). L’amélioration très sensible des outils de prédiction in silico ces dernières années ouvre des perspectives intéressantes en terme d’étude systématique de variants susceptibles de modifier l’épissage d’un transcrit d’intérêt. Mais le manque de données expérimentales constitue un frein majeur à la possibilité d’une amélioration plus significative et, surtout, plus globale des prédictions, en particulier pour les variants situés dans des séquences régulatrices. Par ailleurs, les différents algorithmes n’adressent pas la question de la stabilité des différents isoformes, ni celle de l’utilisation possible de sites cryptiques. L’information est qualitative et directement liée à la localisation du variant. Ces différents éléments nous ont conduits à développer une stratégie d’étude multi-parallèle de variants d’épissage basée sur le séquençage d’ARNm pleine longueur.

            Notre stratégie repose sur l’utilisation : i) d’un plasmide optimisé pour le clonage et la transfection de structures géniques (exons codants et intron entiers) allant jusqu’à 8 kb, ii) d’un promoteur non-viral, issu d’un gène d’expression ubiquitaire (POLR2G), iii) de sites de restriction uniques permettant l’insertion modulaire de différentes séquences mutées (produites par synthèse d’ADN) par recombinaison homologue, iv) de code-barres permettant le multiplexage d’une centaine de constructions différentes et l’analyse des transcrits produits dans une phase unique de séquençage, v) de la technologie de séquençage « long-read » PacBio (Sequel) et vi) d’une solution informatique dédiée permettant de caractériser et de quantifier les différents isoformes produits (pipeline snakemake utilisant lima et minimap2).

            Les résultats obtenus au travers de l’étude de quatre gènes modèles (ACKR1, SMIM1, HBB, HFE2) et d’un total de 123 variants, dont une majorité avec un effet connu, permettent de valider l’ensemble de la méthodologie. Ils permettent d’envisager de nouveaux développements tels qu’une analyse fonctionnelle plus approfondie de la variabilité allélique à un locus donné, ou le criblage moléculaire de séquences d’ADN associées au fonctionnement du splicéosome.


Chandran KA (Brest), Sacha SCHUTZ, Jian-Min CHEN, Gaelle RICHARD, Isabelle GOURLAOUEN, Sandrine MAESTRI, Claude FEREC, Yann FICHOU, Gerald LE GAC
11:30 - 11:40 #28496 - EP09 Première duplication multi-exonique du gène CDH1 : A propos d’un cas de cancer du sein lobulaire bilatéral sporadique et d’une caractérisation combinant étude ARN et cartographie optique par le système Bionano.
EP09 Première duplication multi-exonique du gène CDH1 : A propos d’un cas de cancer du sein lobulaire bilatéral sporadique et d’une caractérisation combinant étude ARN et cartographie optique par le système Bionano.

Introduction : Les mutations du gène CDH1 sont associées à la prédisposition héréditaire au carcinome lobulaire du sein et au cancer gastrique diffus. L’approche diagnostique par panel de gènes a permis d’augmenter le diagnostic des mutations du gène CDH1, principalement en l’absence d’une présentation familiale de cancer du sein ou de l’estomac. Les principales mutations sont de type faux-sens. Les grands réarrangements sont rares et ceux décrits sont des délétions. Une unique duplication de l’exon 9 du gène CDH1 a été rapportée par Moridnia et al, en 2018.

Méthodes: Nous rapportons le cas d’une patiente qui a présenté un carcinome lobulaire infiltrant du sein bilatéral diagnostiqué à l’âge de 47 ans. Aucun antécédent de cancer n’a été retrouvé dans la famille. Elle a été explorée par un panel de gènes de prédisposition au cancer du sein. Une duplication des exons 4 à 11 du gène CDH1 a été mise en évidence et confirmée par MLPA. Dans ce travail, nous nous proposons de détailler la stratégie adoptée pour la caractérisation de la duplication et sa classification en variant pathogène. Pour cela, nous avons utilisé une approche combinant l’étude ARN et la cartographie optique par le système Bionano.

Résultats : Une étude ARN a été réalisée par RT-PCR puis séquençage Sanger à partir d’une lignée lymphoblastoïde traitée à la puromycine. Grâce à un premier couple d’amorces spécifique du transcrit pathologique (amorce forward sur l’exon 11 et amorce reverse sur l’exon 5), nous avons pu amplifier une jonction reliant l’exon 11 à l’exon 4, confirmant ainsi qu’il s’agit d’une duplication directe en tandem. Etant donné que le gène CDH1 a une isoforme physiologique avec un saut de l’exon 11 à un taux moyen de 20%, nous avons continué l’étude par un deuxième couple d’amorces ciblant l’exon 9 en forward et l’exon 5 en reverse. Nous avons retrouvé deux jonctions pathologiques : une attendue, reliant l’exon 11 à l’exon 4 et une deuxième reliant l’exon 10 à l’exon 4, témoin du saut physiologique de l’exon 11 au sein de la duplication. Quatre types de transcrits sont possibles : duplication en tandem des exons 4 à 11, duplication en tandem des exons 4 à 10 (absence totale d’exon 11), saut de l’exon 11 au niveau de la première copie de la duplication ou saut de l’exon 11 au niveau de la deuxième copie. Sur le plan protéique, ces schémas donnent deux types de protéines CDH1 tronquées : CDH1 p.Ser572fs ou CDH1 p.Tyr523fs. Ceci conclue au caractère pathogène de la duplication.  L’étude par cartographie optique par le système Bionano a confirmé que la duplication était directe et en tandem et a permis de situer les points de cassures au niveau des régions génomiques Chr16 :68841756 à 688553114 (hg19) sur 15kb.

Conclusion : La duplication des exons 4 à 11 est la première duplication multi-exonique décrite du gène CDH1. Notre stratégie a permis de la classer en variant pathogène. Un conseil génétique et une prise en charge adaptés ont pu être proposés à la patiente.


Molka SEBAI (Paris), Alice FIEVET, Odile CABARET, Céline Sengul KARA, Najat AHMED-ECHRIF, Cassandre FRANCOIS, Clémentine GABILLAUD, Henintsoa RATSIMIALA, Aurélie STOURM, Nathalie AUGER, Roseline TANG, Etienne ROULEAU
11:40 - 12:00 TABLE RONDE DISCUSSION AVEC LES ORATEURS.
Salle 3

Mardi 01 février

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D11
09:00 - 12:00

WORKSHOP DÉFICIENCE INTELLECTUELLE

Modérateurs : Benedicte GERARD (Praticien Hospitalier) (STRASBOURG), Amélie PITON (MCU-PH) (Strasbourg), Pascale SAUGIER-VEBER (MCU-PH) (ROUEN)
Salle 4

Mardi 01 février

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E11
09:00 - 12:00

ANDDI-RARES OUTRE-MER

Modérateurs : Laurent DEMOUGEOT (Chef de Projet AnDDI-Rares) (DIJON), Laurence OLIVIER-FAIVRE (PUPH) (DIJON)
Salle 5
12:30 TEMPS LIBRE POUR DEJEUNER Salle 1
14:00

Mardi 01 février

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A13
14:00 - 14:15

OUVERTURE DU CONGRES

Salle 1
14:15

Mardi 01 février

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A14
14:15 - 16:15

CONFERENCE PLENIERE 1
Thérapies innovantes

Modérateurs : Catherine ANDRE (Responsable d'équipe) (Rennes), Cécile ROUZIER (PH) (NICE)
14:15 - 16:15 Thérapie génomique. Anne GALY (Evry)
14:15 - 16:15 Thérapie génique dans la neuropathie optique de Leber. Patrick YU-WAI-MAN (Professeur) (Cambridge, Royaume-Uni)
14:15 - 16:15 Amylose à transthyrétine, thérapeutiques basées sur l’ARN. David ADAMS (Le Kremlin-Bicêtre)
14:15 - 16:15 Nouvelles thérapies issues de la mer. Laurent MEIJER (Président et Directeur Scientifique) (Roscoff)
Salle 1
16:45

Mardi 01 février

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A16
16:45 - 18:15

SESSIONS SIMULTANEES 01
Neurodéveloppement

Modérateurs : Valérie DUPE (Chargé de recherche Inserm) (Rennes), Solveig HEIDE (NEUROGENETIQUE) (PARIS)
16:45 - 17:00 #28735 - SS001 Caractérisation des organoïdes cérébraux KO MED13L.
SS001 Caractérisation des organoïdes cérébraux KO MED13L.

Le Mediator est un grand complexe corégulateur conservé de la levure à l'homme. Il joue un rôle crucial dans l'assemblage du complexe de pré-initiation de la transcription, en prenant part au recrutement de l'ARN polymérase II. Il s'est révélé être l’un des coordinateurs principaux du développement et de la détermination du lignage cellulaire grâce à des interactions avec divers facteurs de transcription et régulateurs épigénétiques.

Le Mediator est organisé en quatre modules, à savoir la queue, le milieu, la tête et le module kinase. Chez les vertébrés, le module kinase comprend quatre protéines : CDK8, CCNC, MED12 et MED13, ou leurs paralogues respectifs : CDK19, MED12L, et MED13L. Le module kinase présente des interactions et des fonctions spécifiques par rapport aux autres composants du complexe Mediator. Des variants rares des gènes codant les sous-unités de ce module ont été associés à des troubles du neurodéveloppement chez l'humain.

Ainsi, des variants de MED13L ont été identifiés chez des patients présentant une déficience intellectuelle modérée à sévère. Nous avons développé un modèle d'organoïdes cérébral MED13L-KO à partir de hIPSc (human Induced Pluripotent cells). Nous avons caractérisé les organoïdes MED13L KO et sauvages par une analyse de l'expression des gènes et de l'accessibilité de la chromatine au niveau de chaque cellule (single-cell RNA-seq et single cell ATAC-seq).

Nous avons identifié des différences dès les premières étapes du développement, notamment le diamètre des organoïdes et l'expansion des bourgeons neuroépithéliaux. L'analyse transcriptomique unicellulaire a montré, dans les organoïdes sauvages, le développement de neurones corticaux matures des couches supérieures et profondes (BCL11B, SATB2), de neurones glutamatergiques et GABAergiques avec des synapses apparemment fonctionnelles (GRIA1, GRIA2, GRIN2B, GABRB3). Dans les organoïdes MED13L KO, l'analyse de l'expression génétique a révélé que l’invalidation de MED13L a conduit à un engagement rétinien, avec une expression de marqueurs rétiniens (RAX, VSX2) et des photorécepteurs (USH2A). La combinaison des données d'accessibilité à la chromatine des cellules uniques a permis d'identifier des loci de co-accessibilité, reliant les éléments régulateurs à leurs gènes cibles putatifs. Comparativement aux sauvages, nous avons trouvé dans les organoïdes MED13L KO un plus grand nombre d'éléments régulateurs accessibles conduisant à une expression élevée de gènes critiques pour le développement de la rétine, y compris PAX6 et OTX2. Sur la base de ces données, MED13L est probablement critique dans le contrôle négatif des gènes précoces induisant une destinée rétinienne. Ce mécanisme est susceptible d'être critique pour permettre un engagement cortical correct des neurones en développement.


Jamal GHOUMID (Lille), Ryan ZIFFRA, Marie BALERDI, Dianne LABOY CINTRON, Jerome SIGE, Nadav AHITUV
17:00 - 17:15 #28139 - SS002 Etude in vitro des bases génétiques des anomalies cérébrales liées à une déficience en Sonic Hedgehog.
SS002 Etude in vitro des bases génétiques des anomalies cérébrales liées à une déficience en Sonic Hedgehog.

L'holoprosencéphalie (HPE) est une pathologie du développement cérébral embryonnaire précoce causée principalement par un dysfonctionnement de la voie de signalisation Sonic Hedgehog (SHH) chez l’Homme. En accord avec le rôle essentiel de la voie SHH dans la formation et la mise en place des tissus de la ligne médiane antérieure, les variants génétiques délétères causatifs de l’HPE affectent des acteurs de la voie de signalisation SHH. Il est à noter que l'accumulation de variants (oligogénisme) à effets hypomorphes sur l'activité de SHH est largement impliquée dans l’étiologie de l’HPE. A ce jour, et malgré l’implication de 16 à 18 gènes, près de 70 % des patients atteints d’HPE demeurent sans diagnostic moléculaire. Notre objectif principal est d'améliorer l’efficacité de ce diagnostic moléculaire ainsi que la compréhension de la physiopathologie de l’HPE.

Afin de modéliser l’HPE et les premières étapes du développement cérébral, nous tirons parti de la capacité des cellules souches pluripotentes induites (iPSCs) humaines à se différentier en tissu neurectodermique, i.e., le tissu primordial du cerveau embryonnaire. Ainsi, nous avons établi au laboratoire la différenciation des iPSCs en neuroectoderme (NE), tissu qui par défaut adopte une identité dorsale (dNE, caractérisé par l’expression des marqueurs dorsaux correspondant). SHH agissant in vivo sur un neurectoderme ventral, nous avons ensuite orienté cette différentiation neurectodermique vers un tissu neurectodermique ventralisé (vNE, caractérisé par l’expression des marqueurs ventraux) en traitant le vNE à l’aide de molécules SHH. Cette approche nous a permis d’établir un modèle in vitro récapitulant les propriétés du tissu embryonnaire affecté dans l’HPE.

Par la suite, et afin de déterminer la sensibilité de ce modèle aux perturbations de la voie SHH, et donc sa pertinence pour nos études, nous avons étudié l'impact de la déficience graduelle en SHH dans le vNE en utilisant la Cyclopamine (inhibiteur de la voie SHH). Nous avons ainsi observé que l’inhibition pharmacologique de la voie SHH entraîne une diminution de la population de cellules présentant l’expression des marqueurs ventraux et l’apparition de cellules exprimant les marqueurs dorsaux, et ce de matière dose-dépendante. Ce résultat indique que la Cyclopamine est un inhibiteur efficace de la différenciation ventrale de neuroectoderme dépendant de la voie SHH, et établit l’intérêt de ce modèle cellulaire pour l’étude des causes et conséquences moléculaires de l’HPE.

Nous utiliserons ce système expérimental pour l’établissement de signatures transcriptomiques caractéristiques de l’HPE afin d’établir une nouvelle méthode de diagnostic moléculaire indépendante du diagnostic génétique. Ce système expérimental sera également utilisé dans des études fonctionnelles afin de disséquer les mécanismes physiopathologiques de l’HPE.


Veranika PANASENKAVA (Rennes), Farah DIAB, Helene GUYODO, Christèle DUBOURG, Sylvie ODENT, Marie DE TAYRAC, Erwan WATRIN, Valérie DUPÉ
17:15 - 17:30 #28172 - SS003 Le diagnostic génétique moléculaire des formes rares d’épilepsie : évaluation du rendement diagnostique du séquençage à haut débit d’un panel de gènes impliqués dans les épilepsies monogéniques, et conséquences pratiques d’un tel diagnostic.
SS003 Le diagnostic génétique moléculaire des formes rares d’épilepsie : évaluation du rendement diagnostique du séquençage à haut débit d’un panel de gènes impliqués dans les épilepsies monogéniques, et conséquences pratiques d’un tel diagnostic.

Introduction : Les épilepsies constituent un groupe de pathologies fréquentes : elles concernent environ 1% de la population, essentiellement pédiatrique. La part génétique des épilepsies s’élève à près de 80%, dont la majorité sont d’origine polygénique. Les évolutions récentes des technologies de séquençage des génomes ont permis d’identifier un grand nombre de gènes impliqués dans les épilepsies monogéniques.

 

Objectif : L’objectif de ce travail était, d’une part, de déterminer l’apport diagnostique du panel PAGEM (PAnel des Gènes d’Epilepsies Monogéniques), chez des patients pour lesquels un diagnostic d’épilepsie mendélienne était suspecté, et, d’autre part, d’étudier les conséquences pratiques d’un tel diagnostic.

 

Matériels et méthodes : Nous avons mené une étude clinique rétrospective, après séquençage à haut débit d’un panel de 115 gènes impliqués dans les épilepsies mendéliennes, chez des patients aux phénotypes électro-cliniques recueillis de façon précise, et recrutés à l’échelle nationale. Il s’agissait de cas familiaux ou sporadiques.

 

Résultats : Dans notre cohorte de 558 patients issus de 50 centres français, le rendement diagnostique global s’élevait à 32,3% (180/558). Nous avons identifié un total de 186 variants diagnostiques, dont 10 CNVs (8 délétions et 2 duplications), et 4 variants en mosaïque, dans 58 gènes différents. Les gènes les plus fréquemment impliqués étaient KCNQ2, GRIN2A, SCN1A, ATP1A3, KCNT1 et PRRT2. La majorité des variants identifiés étaient de novo (72/104). Les épilepsies précoces conduisaient à un taux diagnostique significativement plus élevé, avec un rendement diagnostique atteignant 41,4% chez les patients ayant débuté leurs épilepsies avant l’âge de 3 mois (63/152). Le rendement diagnostique était particulièrement élevé pour les encéphalopathies épileptiques, dont les encéphalopathies avec POCS, et pour les syndromes de Doose et de Dravet. Cinq démarches de diagnostic prénatal ont été menées dans notre centre suite à ces diagnostics moléculaires, et plusieurs patients ont bénéficié d’adaptations thérapeutiques efficaces.

 

Conclusions : L’approche ciblée par panel de gènes constitue un excellent outil diagnostique pour les épileptologues, et la caractérisation génétique des patients épileptiques joue un rôle essentiel pour la formulation d’un conseil génétique et l’adaptation de la prise en charge thérapeutique. A l’ère de cette médecine personnalisée, les techniques d’analyses pangénomiques sont néanmoins en passe de remplacer les approches ciblées par panel de gènes du fait d’un rapport coût/diagnostic qui devient meilleur.


Pauline MONIN (LYON), Audrey LABALME, Nicolas CHATRON, Carole GOUJON, Hélène GUILBERT, Marie LUINO, Pierre-Antoine ROLLAT-FARNIER, Claire BARDEL, Thomas SIMONET, Dorothée VILLE, Eleni PANAGIOTAKAKI, Julitta DE REGNAULD DE BELLESCIZE, Alexis ARZIMANOGLOU, Vincent DES PORTES DE LA FOSSE, Marianne TILL, Damien SANLAVILLE, Gaetan LESCA
17:30 - 17:45 #27720 - SS004 Identification de variations non-codantes du gène NIPBL responsables du syndrome de Cornelia de Lange.
SS004 Identification de variations non-codantes du gène NIPBL responsables du syndrome de Cornelia de Lange.

Le syndrome de Cornelia de Lange (CdLS) associe retard de développement et/ou déficience intellectuelle, retard de croissance, microcéphalie, troubles alimentaires, anomalies des membres et dysmorphie. Cinq gènes principaux sont impliqués, codant pour des protéines du complexe cohésine. Le gène majeur est NIPBL, responsable de 70% des diagnostics et dont les variations pathogènes entrainent une perte de fonction. La stratégie d’exploration des patients avec suspicion de CdLS se fait classiquement par analyse d’un panel de 22 gènes, 40% des cas restant sans diagnostic moléculaire après analyse. Nous avons évalué l'hypothèse de variations non-codantes non détectées par les stratégies de routine chez ces patients non résolus.

Nous avons procédé en 2 étapes : (1) réannotation des variations non codantes de NIPBL capturées en panel chez 99 patients non résolus. Suite à l’identification d’une mutation du 5’UTR, nous avons mis au point une analyse fonctionnelle. (2) Sélection de 5 patients CdLS pour séquençage de génome en trio selon les critères suivants : (i) CdLS classique après évaluation clinique, (ii) séquençage négatif du panel à partir d'ADN sanguin ou salivaire, (iii) ADN disponible des 2 parents sains et (iv) ARN extrait du sang chez le cas index pour analyse transcriptomique par RNA-Seq le cas échéant.

Par réannotation des données de panels, nous avons identifié chez un garçon avec un CdLS classique une variation (NM_133433.3:c.-457_-456delinsAT) de novo dans le 5’UTR de NIPBL, prédite pour créer un cadre de lecture en amont du cadre naturel (uORF). Nous avons mis en place un test rapporteur dans lequel le 5'UTR de NIPBL, WT ou muté, est cloné en amont de la séquence codante de la GFP. Après transfection de cellules HEK293, la condition mutée était associée à une baisse d’expression de 80% de la GFP par western blot (WB) sans modification des quantités d’ARNm (RT-ddPCR). Nous avons confirmé sur une lignée lymphoblastoïde du patient la baisse de NIPBL de 50% par rapport à 4 contrôles par WB, sans modification des niveaux d’ARNm. Cette mutation pourrait donc entrainer une répression de la traduction de NIPBL, menant à une perte de fonction.

L’analyse des 5 génomes nous a permis d’identifier chez 3 patients une variation pathogène de novo, dans la séquence codante de gènes absents du panel : POU3F3, SPEN et TAF1. Chez les 2 patients restants, nous avons identifié chez chacun une variation de novo intronique profonde distincte dans NIPBL, prédite pour créer respectivement un site donneur et accepteur d’épissage. La RT-PCR et l’analyse par RNASeq ont confirmé l’utilisation de ces néo-sites, entrainant respectivement l’inclusion d’un néo-exon dans l’intron 8 et 32 de NIPBL et un décalage du cadre de lecture avec codon stop prématuré.

Ainsi, nous identifions une cause non-codante chez 6 patients avec CdLS qui étaient non résolus. L’accès à des tests fonctionnels simples et à des analyses de transcrits a permis de confirmer l’impact de ces variations.


Juliette COURSIMAULT (ROUEN), Kévin CASSINARI, Alice GOLDENBERG, Pascale SAUGIER-VEBER, Francois LECOQUIERRE, Gabriella VERA, Nathalie DROUOT, Anne-Claire RICHARD, Marion ROLAIN, Myriam VEZAIN, Céline DERAMBURE, Olivier QUENEZ, Sophie COUTANT, Jamal GHOUMID, Mélanie RAMA, Thomas SMOL, Marine LEGENDRE, Patricia FERGELOT, Didier LACOMBE, Anais PHILIPPE, Laëtitia LAMBERT, Elise SCHAEFER, Elise BRISCHOUX-BOUCHER, Lionel VAN MALDERGEM, Myriam BRONNER, Jean-François DELEUZE, Robert OLASO, Anne BOLAND, Anne ROVELET-LECRUX, Magalie LECOURTOIS, Gael NICOLAS
17:45 - 18:00 #28634 - SS005 Faisabilité et efficience du séquençage de génome en trio en 1ère intention pour le diagnostic étiologique des déficiences intellectuelles : l’étude DEFIDIAG.
SS005 Faisabilité et efficience du séquençage de génome en trio en 1ère intention pour le diagnostic étiologique des déficiences intellectuelles : l’étude DEFIDIAG.

Introduction

La Déficience Intellectuelle (DI) atteint 1 à 3% de la population générale. L’identification d’un diagnostic causal est un véritable défi compte-tenu de son extrême hétérogénéité génétique, alors qu’il s’avère la 1ère étape pour adapter au mieux la prise en charge et prodiguer un conseil génétique approprié. De nombreuses études ont montré l’apport du séquençage de l’exome (ES) en 1ère ligne. L'utilisation de séquençage du génome (GS) en 1ère intention devrait atteindre un rendement diagnostique plus élevé compte tenu de sa couverture plus large et plus homogène que l’ES et de sa capacité à identifier des variations de structures ou des événements pathologiques intergéniques ou introniques profonds. Le coût décroissant du séquençage, les progrès rapides de la bioinformatique, et l’intérêt de disposer, en une seule analyse moléculaire, de l’ensemble des données utiles à des réanalyses ultérieures, ont incité le Plan France Médecine Génomique 2025 à déployer le projet pilote DEFIDIAG dans l’objectif d’évaluer l'efficacité du GS en 1ère ligne pour identifier le diagnostic moléculaire chez les patients avec une DI sans étiologie évidente.

 

Méthode : Cette étude diagnostique prospective multicentrique (14 centres d’inclusion) vise à comparer le pourcentage de diagnostic causal identifié par l'analyse du GS en trio par rapport à celui obtenu avec la stratégie française de référence (FRAXA, ACPA et panel DI44). Les deux stratégies sont appliquées en insu, en parallèle, dans la même population de 1275 cas index de DI sans diagnostic évident (dont 50% venant pour une 1ère investigation). L’étude a également pour objectif d’identifier la stratégie la plus adaptée selon la présentation clinique des patients et d’évaluer l’impact du GS sur l’errance diagnostique des familles, la modification de leur prise en charge et de son coût, et d’en identifier les avantages/ difficultés pour les patients et leur famille. Les patients seront suivis 12 mois après le rendu des résultats afin de collecter les données nécessaires (approches mixtes qualitatives et quantitatives).

 

Résultats préliminaires : Nous présenterons l’avancement des différents volets de l’étude et les caractéristiques des patients inclus depuis mars 2020. A ce jour, 1095/1275 patients ont été inclus (47% en 1ère ligne et 32% avec une DI sévère à profonde). Les résultats ont été validés en RCP pour 272 patients (25%). Une variation de classe 4 ou 5 a été retrouvée pour 39% (40/103) des patients en 1ère ligne et pour 46% des patients en impasse diagnostique (77/169). Chez les patients avec une DI sévère à profonde, un diagnostic a été identifié pour  23% des patients en 1ère ligne et pour 45% des patients en impasse diagnostique (43/95).

 

Conclusion

Cette étude permettra d’identifier les difficultés soulevées par la mise en place du GS pour les professionnels, les patients et leur famille, permettant ainsi d’ouvrir des pistes d’action pour optimiser l’utilisation du GS en routine.


Christine BINQUET, Marion BOUCTOT, Marie-Laure ASENSIO, Simon ALBAN, Christelle DELMAS, Anne BOLAND, Anne-Sophie BRIFFAUT, Francis GUILLEMIN, Valerie SEROR, Yannick DUFFOURD, Catherine LEJEUNE, Sylvie ODENT, Laurence FAIVRE, Delphine HERON, Damien SANLAVILLE, Stanislas LYONNET, Patrick NITSCHKE, Jean-François DELEUZE, Hélène ESPEROU, Bénédicte GERARD, Thierry FREBOURG, Hélène DOLLFUS (Strasbourg), Defidiag GROUPE DES INVESTIGATEURS PFMG 2025
18:00 - 18:15 #28016 - SS006 Dysfonction du système ubiquitine-protéasome dans les pathologies neurodéveloppementales.
SS006 Dysfonction du système ubiquitine-protéasome dans les pathologies neurodéveloppementales.

Contexte : Le système Ubiquitine-Protéasome (UPS) est chez les Eucaryotes un élément majeur de la dégradation intracellulaire, et par là même de la protéostasie. Un nombre croissant des 1200 gènes qui constituent l’UPS est associé à des troubles du neurodéveloppement (TND), au point d’en représenter environ 10 à 15% des causes. Notre équipe a contribué à l’identification d’un certain nombre de ces TND liées à des gènes de l’UPS (UPS-TND) comme PSMD12, PSCM3, PSMC5, ou BAP1. Notre objectif est de mieux comprendre les UPS-TND en identifiant les mécanismes physiopathologiques à l’origine des troubles neurodéveloppementaux chez les patients.

Méthode : En collaboration avec des généticiens cliniciens en France et à l’étranger, nous recrutons des patients avec des variants UPS et collectons des échantillons biologiques à partir desquels nous amplifions les lymphocytes T. Dans ce modèle cellulaire, nous évaluons l’impact de chaque variant sur la protéostasie et le statut inflammatoire par une analyse systématique de la fonction protéasomale, du profil d’ubiquitination et de l’expression de gènes de l’immunité innée. Nous étudions également l’impact sur la régulation des protéines partenaires spécifiques pour chaque gène d’intérêt. Pour certains variants, nous avons lancé la production des modèles neuronaux dérivés d’iPSC dont nous allons analyser les caractéristiques morphologiques et multiomiques.

Résultats : A ce jour, nous avons collecté les prélèvements de 30 patients et apparentés dont les variations touchent aussi bien des gènes codant des sous-unités du protéasome (PSMB5, PSMC1, PSMC3, PSMC5, PSMD11, PSMD12), des ubiquitine-ligases (CUL2, CUL3, CUL4B) et des déubiquitinases (USP7, USP8, BAP1), couvrant ainsi les trois types d’acteurs majeurs de la voie UPS. Les explorations fonctionnelles encore préliminaires que nous avons réalisées ont révélé des mécanismes communs aux UPS-TND : diminution de l’activité enzymatique du protéasome et accumulation de protéines polyubiquitinylées, dysimmunité avec une réponse Interféron de type 1 anormalement élevée, dérégulations épigénétiques en Chip-Seq, montrant des gènes sur-/sous-régulés intéressants des acteurs majeurs connus en déficience intellectuelle.

Discussion : Les données préliminaires indiquent des chevauchements des mécanismes pathogéniques des différentes UPS-TND testées. Nous souhaitons étendre nos investigations à un maximum de pathologies de ce système afin de croiser les données et d’identifier des points moléculaires clés se retrouvant dans la physiopathologie des UPS-TND, tout en développant notre réseau de collaboration. En identifiant ces marqueurs de pathologie, en déterminant précisément les cellules et tissus impactés et en établissant des corrélations génotype-phénotype, nous visons à identifier des leviers permettant une action thérapeutique dans un futur proche.


Wallid DEB (Nantes), Virginie VIGNARD, Thomas BESNARD, Benjamin COGNE, Silvestre CUINAT, Laëtitia FLORENCEAU, Alice MOLLE, Janelle E. STANTON, Sandra MERCIER, Mathilde NIZON, Marie VINCENT, Bertrand ISIDOR, Elke KRÜGER, Richard REDON, Andreas M. GRABRUCKER, Jérémie POSCHMANN, Frédéric LAUMONNIER, Frédéric EBSTEIN, Sébastien KÜRY, Stéphane BÉZIEAU
Salle 1

Mardi 01 février

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B16
16:45 - 18:15

SESSIONS SIMULTANEES 02
Maladies osseuses et dentaires

Modérateurs : Genevieve BAUJAT (Praticien Hospitalier) (PARIS), Massimiliano ROSSI (Praticien hospitalier) (LYON)
16:45 - 17:00 #27963 - SS007 Caractérisation de l’impact d’un défaut de synthèse des glycosaminoglycanes sur l’ossification enchondrale d’un modèle murin invalidé pour le gène Slc10a7.
SS007 Caractérisation de l’impact d’un défaut de synthèse des glycosaminoglycanes sur l’ossification enchondrale d’un modèle murin invalidé pour le gène Slc10a7.

Les chondrodysplasies associées à des luxations multiples (CLM) forment un groupe de maladies rares principalement caractérisés par un retard de croissance pré- et post-natal sévère, des luxations des grosses articulations, une scoliose et une avance de maturation du carpe. À ce jour, plusieurs formes ont été décrites et la plupart ont été associés à des mutations dans des gènes codant pour des protéines impliquées dans la synthèse des protéoglycanes (PGs).

Les PGs sont des macromolécules composées d'une chaine protéique et d'une ou plusieurs chaînes latérales de glycosaminoglycanes (GAG), constituées de disaccharides sulfatés formant les héparanes sulfates (HS), les chondroïtines sulfates (CS) et les dermatanes sulfates (DS). Les PGs sont fortement exprimés dans la matrice extracellulaire (MEC) des chondrocytes et jouent un rôle important dans la maturation des chondrocytes et le développement du squelette en agissant sur la  diffusion des facteurs de croissance et en assurant des propriétés mécaniques adéquates aux tissus cartilagineux. L'implication du défaut de biosynthèse des PGs dans la physiopathologie des CLM n'est pas encore bien comprise et un certain nombre de patients reste sans base moléculaire identifiée.

Nous avons récemment  identifié des variants homozygotes « perte de fonction » dans le gène SLC10A7 chez des patients CLM et démontré que SLC10A7, transporteur avec une spécificité de substrat inconnu, joue un rôle dans l'homéostasie calcique du Golgi affectant la synthèse des PGs.

Pour étudier le rôle de SLC10A7, nous avons généré un modèle murin invalidé pour le gène Slc10a7 (Slc10a7-/-), qui mime parfaitement le phénotype humain CLM.

Pour mieux caractériser les conséquences spécifiques de l'altération de la synthèse des PGs sur l'ossification endochondrale, nous avons étudié le cartilage du modèle murin Slc10a7-/- à différents temps du développement.

Nous avons montré une altération de la maturation des chondrocytes avec une augmentation de l'apoptose des chondrocytes hypertrophiques dans les plaques de croissance des souris Slc10a7-/-. En isolant les chondrocytes de souris Slc10a7-/-, nous avons identifié un déficit en HS et CS et un défaut de minéralisation de la MEC. L’analyse de l'expression de marqueurs spécifiques pour la différenciation des chondrocytes suggère également une avance de différenciation des chondrocytes chez les souris Slc10a7-/- comparativement aux contrôles. Enfin, nous avons identifié une altération de l’activation de la voie de signalisation FGF dans les chondrocytes Slc10a7-/-. Nos résultats démontrent un rôle de Slc10a7 dans la différentiation des chondrocytes via son implication dans la synthèse de PGs.


Alessandra GUASTO (Paris), Céline HUBER, Valérie CORMIER-DAIRE, Johanne DUBAIL
17:00 - 17:15 #28547 - SS008 Correction ex-vivo du gène COL7A1 par CRISPR/Cas9 et recombinaison homologue pour le traitement des épidermolyses bulleuses dystrophiques récessives.
SS008 Correction ex-vivo du gène COL7A1 par CRISPR/Cas9 et recombinaison homologue pour le traitement des épidermolyses bulleuses dystrophiques récessives.

Les épidermolyses bulleuses dystrophiques (EBD) représentent un groupe de maladies génétiques cutanées rares et sévères, transmises de façon récessive (EBDR) ou dominante (EBDD), responsables de décollements bulleux de la peau et des muqueuses. Les EBDs sont dues à un grand nombre de mutations du gène COL7A1 codant le collagène VII, le composant principal des fibres d’ancrage. Les formes récessives sont parmi les génodermatoses les plus graves de l’enfant et de l’adulte et il n’existe actuellement pas de traitement satisfaisant.

L’objectif de notre travail était de corriger de façon efficace au moyen de CRISPR/Cas9 et recombinaison homologue (RH), une mutation nulle (c.6508C > T ; p.Gln2170*) située dans l’exon 80 du gène COL7A1 dans les kératinocytes et fibroblastes primaires d’un patient EBDR homozygote pour cette mutation.

Nous avons tout d’abord conçu trois ARN guides (ARNg) ciblant la mutation ou les séquences adjacentes. Les ARNg chimiquement modifiés ont été apportés par nucléofection avec la nucléase Cas9 haute-fidélité sous forme de complexe ribonucléoprotéique (RNP). Parmi les ARNg testés, un ARNg intronique a montré une faible toxicité et jusqu'à 73 % d'activité de clivage dans les kératinocytes et les fibroblastes primaires EBDR. Nous avons également évalué leur activité hors cible (off-targets) dans ces cellules et n'avons pas observé d'activité de clivage non spécifique sur les sites prédits in-silico.

Puis nous avons traité les kératinocytes et fibroblastes primaires EBDR avec ce RNP intronique en présence de la matrice d’échange apportée sous forme d’oligonucleotide simple brin (ssODN). Nous avons obtenu jusqu' à 56 % de correction génétique et de restauration de l’expression du collagène 7 (C7) dans les kératinocytes et fibroblastes EBDR après nucléofection, évaluées par les techniques de séquençage Sanger, Droplet PCR allèle spécifique, Western Blot et immunofluorescence.

Enfin, nous avons étudié la fonctionnalité du collagène VII produit par les kératinocytes et fibroblastes primaires EBDR génétiquement corrigées dans un modèle ex-vivo de xénogreffe de peau reconstruite transplantée sur des souris immunodéficientes. Nous avons pu démontrer par immuno-histofluorescence et microscopie électronique respectivement, la réexpression de collagène VII le long de la jonction dermo-épidermique des peaux reconstruites greffées et la présence des fibres d’ancrage cinq et dix semaines après la greffe.

Notre étude a permis de montrer la faisabilité et l'efficacité de l'édition génique par le système CRISPR/Cas9 et RH, applicable à toutes les mutations de l’exon 80 du gène COL7A1 dans les kératinocytes et les fibroblastes primaires des patients EBDR. La grande efficacité de correction génique (56%) des cellules primaires et l’absence d’activité hors cible détectable permettent d’envisager le développement de modèles de peau équivalente génétiquement corrigée pour une application clinique ex-vivo. 


Araksya IZMIRYAN (Paris), Camille BERTHAULT, Olivier GOUIN, Mei CHEN, David WOODLEY, Sonia GAUCHER, Alain HOVNANIAN
17:15 - 17:30 #27875 - SS009 Syndrome d'Ehlers-Danlos parodontal (anciennement de type VIII) : description phénotypique de 13 nouveaux cas et focus sur l'atteinte vasculaire.
SS009 Syndrome d'Ehlers-Danlos parodontal (anciennement de type VIII) : description phénotypique de 13 nouveaux cas et focus sur l'atteinte vasculaire.

Le syndrome d'Ehlers-Danlos parodontal (SEDp) est une maladie rare causée par des variations pathogènes autosomiques dominantes dans les gènes C1R et C1S, qui codent pour les sous-unités C1R et C1S du premier composant de la voie classique du complément. Il se caractérise principalement par une parodontopathie sévère d’apparition très précoce (dès l’enfance) avec perte prématurée des dents, une hyperpigmentation prétibiale et une fragilité cutanée avec cicatrisation anormale. De rares complications artérielles ont été rapportées, mais l'insuffisance veineuse est très rarement décrite. Nous rapportons ici treize nouveaux patients porteurs de variants pathogènes hétérozygotes de novo (4/12) ou hérités (9/12) dans C1R et C1S, afin de caractériser leur phénotype clinique, en mettant l'accent sur les anomalies vasculaires observées. Tous présentaient des signes cliniques typiques du SEDp, notamment une parodontopathie sévère et précoce avec perte complète des dents chez quatre patients avant l'âge de 35 ans. Les patients partageaient certains traits du visage communs, qui comprenaient un visage allongé avec un menton proéminent, une racine du nez étroite, une implantation haute des cheveux, des plis nasogéniens marqués et une lèvre supérieure fine. Ces particularités morphologiques devenaient plus évidentes avec l'avancée en âge. Trois patients et plusieurs membres de leurs familles présentaient également une insuffisance veineuse étendue compliquée d’ulcères de jambe variqueux chroniques ne guérissant pas malgré des tentatives de greffe cutanée. Une patiente a présenté un anévrisme intracrânien avec des complications vasculaires chez trois de ses apparentés, incluant un anévrisme aortique thoracique et abdominal avec dissection et une rupture d'anévrisme intracrânien. Ce travail souligne l'importance d'un diagnostic précoce du SEDp pour débuter très tôt des soins et un suivi dentaires appropriés et préciser le conseil génétique. Il confirme également que des complications vasculaires sont possibles, y compris sévères, bien qu'elles ne soient pas fréquentes, ce qui nous amène à proposer de réaliser une première évaluation vasculaire complète chez ces patients dès la confirmation du diagnostic moléculaire. Des séries de cas plus importantes sont cependant nécessaires pour préciser la fréquence de ces complications vasculaires et améliorer notre compréhension du lien entre l'activation de la voie du complément et les altérations du tissu conjonctif observées chez ces patients.


Salima EL CHEHADEH (Strasbourg), Anne LEGRAND, Corinne STOETZEL, Véronique GEOFFROY, Jean MULLER, Clarisse BILLON, Salma ADHAM, Xavier JEUNEMAITRE, Roland JAUSSAUD, Elise SCHAEFER, Karelle BÉNISTAN, Sébastien GAERTNER, Agnès BLOCH-ZUPAN, Marie-Cécile MANIÈRE, Catherine PETIT, Anne-Claire BURSZTEJN, Laurence BAL, Anthony REYRE, Tiffany BUSA, Hélène DOLLFUS, Dan LISPKER
17:30 - 17:45 #27888 - SS010 Corrélation génotype-phénotype et efficacité des bisphosphonates dans les ostéogénèses imparfaites non liées à des mutations dans le collagène de type 1 : une étude rétrospective.
SS010 Corrélation génotype-phénotype et efficacité des bisphosphonates dans les ostéogénèses imparfaites non liées à des mutations dans le collagène de type 1 : une étude rétrospective.

L'Ostéogenèse Imparfaite (OI) est un groupe hétérogène de maladies caractérisé par une fragilité osseuse à l’origine de fractures pour des traumatismes mineurs. Les mutations des gènes COL1A1 et COL1A2 représentent environ 85 à 90% des cas d’OI. Plus récemment, de nouvelles formes d’OI ont été mises en évidence avec actuellement plus d’une quinzaine de gènes décrits. La prise en charge actuelle de l'OI est essentiellement fonctionnelle. Sur le plan médicamenteux, les bisphosphonates sont largement utilisés. Leur efficacité est bien établie pour l’augmentation de la DMO mais sa traduction clinique sur la réduction du nombre de fractures reste débattue.
 
Nous rapportons les caractéristiques cliniques de 40 patients ayant une OI non liée à des mutations de COL1 dans l’objectif de mettre en évidence des corrélations entre le génotype et le phénotype. Nous avons également évalué chez ces patients l'effet du traitement par bisphosphonates sur la DMO, le taux annuel de fractures, et la taille afin d’évaluer l’efficacité de ce traitement.
 
Nous décrivons deux nouveaux phénotypes. D’une part, les patients porteurs de mutation CRTAP présentent  une incurvation fémorale et un fémur court dès la période anténatale ( < 3e p). D’autre part, les patients ayant une mutation SERPINF1 sont atteints d’une forme progressivement sévère et déformante de la pathologie évoluant vers une perte de la marche.
 
Concernant le traitement par bisphosphonates, tous les patients ont montré une augmentation significative de la DMO sous traitement. Cette augmentation est dépendante de la dose reçue. Parallèlement, le taux de fracture est diminué au cours du traitement. Notre étude montre également que plus le traitement est instauré à un âge précoce plus la réduction des fractures est importante.


Maelle Charpie CHARPIE (Paris), Perrine BRUNELLE, Geneviève BAUJAT, Caroline MICHOT, Julien VAN GILS, Bruno LEHEUP, Elise SCHAEFER, Zagorka PEJIN, Graziella PINTO, Sophie MONNOT, Valérie CORMIER-DAIRE
17:45 - 18:00 #28427 - SS011 Rôle crucial du domaine TB5 de la Fibrilline-1 dans l’ossification endochondrale.
SS011 Rôle crucial du domaine TB5 de la Fibrilline-1 dans l’ossification endochondrale.

La dysplasie géléophysique est une maladie génétique rare avec une atteinte multi-systémique touchant, entre autres, le squelette avec un retard statural, la peau avec un épaississement cutané, et cardiopulmonaire qui conditionne l’espérance de vie des patients. L’un des gènes impliqués est le gène FBN1 donnant la forme autosomique dominante de la pathologie. Nous avons mis en évidence que toutes les mutations sont localisées dans le domaine TB5 (TGFβ binding protein-like domain 5) de la protéine Fibrilline-1. Le domaine TB5 semble donc jouer un rôle critique dans l’ossification endochondrale que nous avons essayé d’ élucider par la génération d’un modèle murin Fbn1TB5+/-.

Ce nouveau modèle murin ne présente pas d’atteintes aortiques comme observées chez les modèles murins Fbn1 mimant le syndrome de Marfan, mais présente cependant une augmentation de quantité de collagène dans la peau des souris homozygotes (Fbn1TB5-/-).

Nous avons démontré que les souris hétérozygotes (Fbn1TB5+/-) et Fbn1TB5-/- présentent un retard statural et une diminution de la taille des os longs. La mutation ponctuelle de Fbn1 impacte la formation de la plaque de croissance avec une réduction significative de la zone hypertrophique et conduit à une différenciation anormale des chondrocytes et une surface chondrocytaire plus petite. Utilisant des cultures primaires de chondrocytes murins, les fibres de Fbn1 présentent un aspect plus épais associé à une densité du réseau microfibrillaire moins dense. Par contre, la voie de signalisation de TGFβ n’est pas impactée, ce qui montre que la voie de signalisation ne semble pas être un pivot central dans cette pathologie. 

En conclusion, ce nouveau modèle murin mime un phénotype semblable à la dysplasie géléophysique. Nos résultats suggèrent que les mécanismes physiopathologiques impliquent une dérégulation de la déposition des microfibrilles de FBN1 probablement dû à un défaut d’interaction entre le domaine TB5 et les sulfates d’héparanes. Une déposition microfibrillaire dans la plaque de croissance semble donc indispensable pour la croissance des os longs.


Zakaria MOUGIN (Paris), Laure DELHON, Jérémie JONQUET, Angélique BIBIMBOU, Johanne DUBAIL, Cynthia BOU-CHAAYA, Nicolas GOUDIN, Wilfried LE GOFF, Catherine BOILEAU, Valérie CORMIER-DAIRE, Carine LE GOFF
18:00 - 18:15 #28148 - SS012 Les cellules souches de la pulpe dentaire, un modèle prometteur pour l’étude des maladies d’empreinte.
SS012 Les cellules souches de la pulpe dentaire, un modèle prometteur pour l’étude des maladies d’empreinte.

L'empreinte parentale est un processus épigénétique conduisant à l'expression monoallélique de certains gènes en fonction de leur origine parentale. Les maladies de l'empreinte (ID) sont des maladies rares ayant principalement des retentissements sur la croissance et le métabolisme de la naissance à l’âge adulte. Les syndromes de Silver-Russell et Beckwith-Wiedemann (SRS et BWS) sont principalement dus à des défauts de méthylation survenant dans les centres d’empreinte (ICR) présents dans la région 11p15.5 entraînant une expression biallélique ou une perte d’expression des gènes soumis à empreinte de cette région. Étant donné que les gènes soumis à empreinte sont exprimés de manière différentielle dans les tissus (mosaïcisme) et faiblement exprimés dans les leucocytes ou les fibroblastes, nous manquons de modèle pertinent pour étudier la physiopathologie des ID. Les cellules souches mésenchymateuses telles que celles de la pulpe dentaire (DPSC) pourraient être un modèle alternatif intéressant car elles sont multipotentes et peuvent être différenciées in vitro en différentes lignées cellulaires d'intérêt.

Nous souhaitons caractériser les profils de méthylation et d'expression génique des régions soumises à empreinte dans les DPSC et au cours de leur différenciation ostéogénique, afin d'évaluer la validité de ce modèle cellulaire dans l'étude des ID.

Nous avons collecté les DPSC chez cinq témoins et quatre patients (trois SRS et un BWS). L'analyse de la méthylation des ICR en 11p15 a révélé un profil normal chez les témoins et altéré chez les patients comme celui identifié dans leurs leucocytes. En outre, six autres loci impliqués dans les ID ont été analysés et ont montré une méthylation normale attendue. Ces résultats étaient stables lorsque les DPSC étaient cultivées dans un milieu de différenciation ostéogénique. Nous confirmons l'expression monoallélique de H19 (un gène soumis à empreinte de la région 11p15) chez les témoins et son expression biallélique chez un patient.

Grâce à cette analyse approfondie de la méthylation des ICR, nous montrons l’intérêt majeur des DPSC dans la modélisation des ID puisque les régions soumises à empreinte sont préservées en culture et lors de la différenciation ostéogénique. Ce modèle ouvre un nouveau champ de recherche: la génération d’autres types cellulaires par différenciation des DPSCs qui permettront la réalisation de tests fonctionnels et thérapeutiques in vitro dans les lignées cellulaires générées.


Eloïse GIABICANI, Aurélie PHAM, Céline SELENOU (Paris), Marie-Laure SOBRIER, Anne POLIARD, Catherine CHAUSSAIN, Irène NETCHINE
Salle 2

Mardi 01 février

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C16
16:45 - 18:15

SESSIONS SIMULTANEES 03
Bioinformatique, nouvelles approches technologiques

Modérateurs : Jean MULLER (MCU-PH) (Strasbourg), Marie DE TAYRAC (MCU-PH) (Rennes)
16:45 - 17:00 #28005 - SS013 Explorer les données de séquençage de génome short read : le défi des STR impliqués en pathologie humaine.
SS013 Explorer les données de séquençage de génome short read : le défi des STR impliqués en pathologie humaine.

Les short tandem repeats (STR) sont des séquences composées d’unités de 1 à 9 paires de bases répétées en tandem. Des variations de longueur de certains STR sont associées à plus de 50 maladies génétiques. Lorsque le nombre de répétitions excède une valeur seuil donnée, variable selon le locus, la maladie peut se déclarer.

Il est compliqué de mettre en évidence avec précision les variations de longueur des STR à partir de données de séquençage de génomes short read (srGS). Ceci résulte notamment de la difficulté de séquençage de ces régions répétées et du problème d’alignement multiple des séquences. Ces dernières années, plusieurs outils ont été développés par la communauté pour détecter les STR à partir de données de séquençage short read.

L’objectif de notre étude était d’identifier les meilleurs outils et de les tester sur notre cohorte dans le but d’établir de nouveaux diagnostics et de déterminer les paramètres qui font varier la précision des outils.

Nous avons testé les 11 principaux outils de la littérature de détection de STR à partir de données de srGS. Nous avons évalué la facilité d’installation et d’utilisation, la maintenance, le délai d’exécution et les résultats sur 8 contrôles positifs. Nous avons conservé 4 outils, testés sur 23 locus impliqués en pathologie humaine sur notre cohorte de 323 génomes de sujets atteints de troubles du neurodéveloppement. Pour mettre en évidence un nombre de répétitions anormal chez les patients, nous avons identifié les cas avec des valeurs extrêmes (ou outliers) : un nombre de répétitions à un locus donné 1) supérieur à la normale (en zone grise ou en zone pathologique), 2) supérieur au 99e percentile ou 3) supérieur à 4 écarts types au-dessus de la moyenne (Z-score > 4). Les variations candidates, retenues sur la base d’une concordance génotype-phénotype ou lorsque le nombre de répétitions était supérieur au seuil pathologique, ont été vérifiées par des techniques de référence. Nous avons également étudié l’impact de plusieurs paramètres sur les résultats, tels que la longueur de l’expansion, la profondeur de couverture et la longueur des reads.

L’analyse des 323 génomes a mené à l’identification de 299 outliers, dont 25 candidats, parmi lesquels 1 STR pathologique a été confirmé. L’outil avec les meilleurs résultats sur l’ensemble des critères était ExpansionHunter. Les 4 outils testés sous-estimaient largement le nombre de répétitions de grande taille, ce qui souligne l’intérêt de l’identification des valeurs extrêmes plutôt que des valeurs supérieures au seuil pathologique. Plus la profondeur de couverture était élevée, plus les résultats étaient précis, avec une stabilisation des résultats à environ 15X. La précision des résultats était plus importante lorsque la longueur des reads était supérieure à la longueur de la répétition.

Notre étude montre l’efficacité d’une stratégie de détection des expansions de STR impliqués en pathologie humaine, pour améliorer le rendement diagnostique du srGS.


Anne-Sophie DENOMMÉ-PICHON (Dijon), Gaëtan LESCA, Marie-Claire MALINGE, Bénédicte GÉRARD, Philippe LATOUR, Bernard ARAL, Christel DEPIENNE, Marine BERGOT, Antonio VITOBELLO, Laurence FAIVRE, Christel THAUVIN-ROBINET, Yannis DUFFOURD
17:00 - 17:15 #28639 - SS014 Analyse des données de séquençage haut débit générées par la capture de conformation de chromosomes à l’échelle pangénomique (Hi-C) dans le cadre du diagnostic des maladies rares du développement.
SS014 Analyse des données de séquençage haut débit générées par la capture de conformation de chromosomes à l’échelle pangénomique (Hi-C) dans le cadre du diagnostic des maladies rares du développement.

Les variations structurales du génome sont capables de perturber l'organisation 3D de la chromatine et plus particulièrement les domaines d'association topologique (TAD), centres d'interactions chromatiniennes modulant l'expression des gènes. Un nombre croissant d'études identifient des mécanismes de réorganisation des TADs à l'origine de pathologies humaines. Au sein du laboratoire GAD, nous avons identifié une cohorte de patients présentant des remaniements susceptibles de restructurer les TADs et qui nécessitent d’analyser l’agencement spatial de la chromatine. La capture de conformation de chromosomes à haut débit (Hi-C) permet d'investiguer le paysage chromatinien en visualisant les contacts ADN-ADN à l'échelle pangénomique.

Le protocole de Hi-C ainsi que le processus bioinformatique d’analyse des données de séquençage sont en cours de développement au laboratoire. Des données de Hi-C ont été produites à partir d’une lignée de fibroblastes contrôle et d’une lignée dérivée d’un patient présentant un chromothripsis. Pour cette dernière lignée utilisée comme contrôle positif, nous avons déjà à disposition des données de séquençage de génome en « short read » (Illumina NovaSeq6000), long reads (PacBio Sequel) et des données issues de l'expérience de Hi-C. En recoupant ces informations, nous pourrons valider le protocole et la pertinence des données produites. Le processus d'analyse des données de séquençage requiert de nombreuses étapes pour extraire les informations biologiques à commencer par le pré-traitement des lectures brutes qui génère une liste d'interactions valides jusqu'à la recherche de celles significatives et d'intérêt. Puisque de nombreux outils sont disponibles, nous avons sélectionné un panel de logiciels à tester dont juicer, HiCExplorer, fanc, HOMER, et HiC-Pro, en se basant, d’une part sur la possibilité de les installer sur le serveur de calcul et d’autre part, sur la production des informations dont nous avons besoin en résultats. Les objectifs sont de valider la qualité des librairies produites grâce aux différentes métriques évaluant la complexité de la librairie et de procéder à l’annotation des matrices de contact. Les résultats des différents outils seront confrontés pour sélectionner les méthodes de normalisation, de visualisation ou encore de comparaison des cartes Hi-C obtenues à partir de données contrôles ou de patients.

Le pipeline mis en place, la technique de Hi-C sera appliquée au reste de la cohorte pour aider à la caractérisation des points de cassure et pour fournir des preuves quant aux interactions régulatrices absentes et/ou aberrantes impliquées dans le mécanisme étiologique. A terme, l’analyse des données de Hi-C est destinée à faire partie d’un projet plus vaste d’intégration de données multi-omiques pour caractériser et interpréter les variations de signification inconnue et contribuer à l’effort de lutte contre l’impasse diagnostique dans le cadre des anomalies de développement.


Aymeric MASSON, Marine BERGOT (Dijon), Laurence FAIVRE, Christel THAUVIN-ROBINET, Antonio VITOBELLO, Yannis DUFFOURD
17:15 - 17:30 #27934 - SS015 Genome Alert! : une methode automatisé et libre pour la réinterprétation des variations génomiques et la réévaluation des associations génotypes-phénotypes en routine clinique.
SS015 Genome Alert! : une methode automatisé et libre pour la réinterprétation des variations génomiques et la réévaluation des associations génotypes-phénotypes en routine clinique.

Introduction: La mise en place de plans nationaux de séquençage a entraîné une augmentation sans précédent de la quantité de variations à interpréter en maladies mendéliennes. L'interprétation rétrospective de ces données séquencées à la lumière des nouvelles connaissances de la littérature est un des principaux challenges en génétique médicale. Cette réinterprétation est actuellement manuelle, le manque de ressources humaines ainsi que l’absence de méthodes standardisées rendent difficile son application en routine diagnostique.

 

Méthodes: Genome Alert! est une méthode open-source qui détecte automatiquement les changements de classifications de variants ayant un potentiel impact clinique entre deux versions de ClinVar. En analysant chaque soumission de toutes les versions disponibles de ClinVar, cette méthode assigne des critères de validité d’associations génotypes-phénotypes. Genome Alert! a été évalué sur une cohorte multicentrique rétrospective de 29 mois portant sur 5 959 individus consécutifs analysés par séquençage de panel ou exome.

 

Résultats: Entre juillet 2017 et décembre 2019, l'analyse rétrospective des soumissions ClinVar a révélé une médiane mensuelle de 1 247 changements de classification ayant un potentiel impact clinique et 23 nouvelles associations génotypes-phénotypes. Le réinterprétation de 4 929 séquençage panel a mis en évidence 45 changements, dont 89 % des classifications ont été validées par des experts, et a conduit à quatre diagnostics supplémentaires. Le catalogue d'associations génotypes-phénotypes de Genome Alert! a présenté 75 associations de haute confiance non disponibles dans la liste morbide OMIM, dont 20 % sont devenues morbides OMIM 8 mois plus tard. 356 séquençage d'exome négatif ont été réanalysés sur ces 75 gènes. Cette approche restreinte a conduit à un nouveau diagnostic.


Conclusion: Genome Alert! (https://genomealert.univ-grenoble-alpes.fr/) permet la réinterprétation systématique et reproductible des données de séquençage acquises dans une routine clinique avec un impact limité sur les ressources humaines. Un préprint est disponible sur medRxiv (https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2021.07.13.21260422v1).


Kevin YAUY (Grenoble), François LECOQUIERRE, Stéphanie BAERT-DESURMONT, Detlef TROST, Aicha BOUGHALEM, Armelle LUSCAN, Jean-Marc COSTA, Vanna GEROMEL, Laure RAYMOND, Pascale RICHARD, Sophie COUTANT, Mélanie BROUTIN, Raphael LANOS, Quentin FORT, Stenzel CACKOWSKI, Quentin TESTARD, Abdoullaye DIALLO, Nicolas SOIRAT, Jean-Marc HOLDER, Nicolas DUFORET, Anne-Laure BOUGE, Sacha BEAUMEUNIER, Denis BERTRAND, Jerome AUDOUX, David GENEVIEVE, Laurent MESNARD, Gael NICOLAS, Julien THEVENON, Nicolas PHILIPPE
17:30 - 17:45 #28550 - SS016 Caractérisation moléculaire de remaniements de structure du génome dans des pathologies constitutionnelles : comparaison entre la cartographie optique du génome et le séquençage génome entier à lectures courtes.
SS016 Caractérisation moléculaire de remaniements de structure du génome dans des pathologies constitutionnelles : comparaison entre la cartographie optique du génome et le séquençage génome entier à lectures courtes.

La caractérisation de remaniements de structures apparemment équilibrés revêt un intérêt certain pour les corrélations génotype-phénotype. La technique de référence pour leur détection reste aujourd’hui le caryotype standard mais qui présente une résolution bien trop faible (7-10Mb) ne permettant pas ce type de corrélation. Le séquençage génome entier à lectures courtes (srWGS) est de plus en plus utilisé en pratique clinique pour détecter les variations de séquence nucléotidiques mais il a également fait ses preuves dans la caractérisation de remaniements équilibrés (1). Or, des publications récentes montrent les limites du srWGS avec ~10% d’échecs d’identification de SVs connus (1,2). Nous avons récemment montré que la cartographie optique du génome (OGM) est très performante dans la détection d’anomalies chromosomiques de divers types (3). La présente étude vise à comparer les capacités de détection et de caractérisation de variations de structure entre l’OGM et le srWGS.

Nous avons réalisé ces deux analyses à partir d’échantillons de 15 patients, adressés pour troubles du développement/déficience intellectuelle, et chez qui une anomalie chromosomique avait été identifiée par caryotype. Le srWGS a été réalisé en paired-end selon un protocole Illumina. Les outils Breakdancer v 1.4.5 et Svagga ont été utilisés pour l’analyse bioinformatique des variations de structure. L’OGM a été réalisée selon le protocole Bionano en utilisant un instrument Saphyr et les logiciels Bionano Solve et Access.

Parmi les 15 patients étudiés, dix avaient des translocations réciproques simples, un avait une inversion, un autre une insertion et trois patients portaient des réarrangements complexes. L’OGM a permis de détecter et caractériser les remaniements dans 13 cas sur 15 contre 10 cas sur 15 pour le srWGS. La résolution était quant à elle de l’ordre de la paire de base pour le srWGS contre 4 Kb en moyenne pour l’OGM, mais les points de cassure étaient concordants entre les deux techniques. Pour les trois cas caractérisés uniquement par OGM, les points de cassure interrompaient des gènes expliquant le phénotype des patients.

Au total, notre étude suggère que l’OGM permet un diagnostic moléculaire dans plus de cas que le srWGS. La résolution est néanmoins moindre comparée à celle du WGS mais elle ne change pas le diagnostic moléculaire et la corrélation génotype-phénotype. Avec la diminution du coût de l’OGM, cette technique pourrait être utilisée en complément du srWGS dans les pathologies du développement afin de permettre une analyse la plus complète possible du génome.


Yosra LAJMI BAHLOUL, Tuomo MANTERE, Faten HSOUMI, Kornelia NEVELING, Céline PEBREL-RICHARD, Flavie DIGUET, Pierre-Antoine ROLLAT-FARNIER, Alexander HOISCHEN, Caroline SCHLUTH-BOLARD, Laïla EL KHATTABI (PARIS)
17:45 - 18:00 #28409 - SS017 L’enrichissement contrôlé informatiquement par échantillonnage adaptatif : une (r)évolution qui ouvre le séquençage en lecture longue par nanopore à la routine clinique.
SS017 L’enrichissement contrôlé informatiquement par échantillonnage adaptatif : une (r)évolution qui ouvre le séquençage en lecture longue par nanopore à la routine clinique.

Le séquençage par nanopores (Oxford Nanopore Technologies) présente un potentiel certain en diagnostic. Cette technologie s’appuie sur les variations séquence-dépendantes d’un courant électrique produites par le passage d’une molécule d’ADN à travers un pore protéique pour en déterminer sa séquence. Elle a pour atouts la simplicité et rapidité de la préparation des échantillons, la détection des bases modifiées, notamment les cytosines méthylées, et surtout la longueur des lectures générées plusieurs dizaines à centaines de milliers de bases  permettant une détection fiable des variants de structure et la détermination de la phase des variants. Son utilisation en clinique est cependant limitée par la faible quantité de donnée produite par réaction comparée aux tailles des régions étudiées en génétique humaine, nécessitant de multiplier les réactions—et donc les coûts et la quantité de matériel nécessaire—pour atteindre des profondeurs de lecture suffisantes. L’enrichissement contrôlé informatiquement par échantillonnage adaptatif permet de s’affranchir de cette limite. Dans ce mode de séquençage novateur, des régions cibles sont spécifiées par leurs coordonnées génomiques sur un génome de référence et, durant la réaction, la séquence de chaque brin d’ADN analysé est déterminée en temps réel. Si celle-ci s’aligne sur les régions cibles, le brin est entièrement séquencé ; dans le cas contraire, il est éjecté du pore par inversion de la polarité de la membrane. Les données produites sont donc enrichies en séquence issues des régions d’intérêt sans préparation spécifique des librairies de type capture ou amplification. Cette méthode permet d’atteindre, en 48h à partir de deux microgrammes d’ADN et une unique cellule de séquençage, des profondeurs de 20X sur une sélection de 570 gènes d’intérêt en oncologie et tout en produisant un profil pangénomique de méthylation et de variations du nombre de copies. La longueur des lectures obtenues, avec une médiane entre 10 et 30kb, permet la détermination à la base près de variants de structure complexes dans des régions difficilement accessibles avec les méthodes en lectures courtes. La flexibilité dans la détermination des régions cibles permet d’adapter celles-ci à chaque cas, d’un panel de gènes jusqu’au chromosome entier dans l’étude d’évènements de grande taille. Dans cette étude pilote, le séquençage par nanopores couplé à l’échantillonnage adaptatif a permis d’identifier les points de cassure à la base près pour tous les cas testés d’une série de quinze tumeurs rhabdoïdes avec perte partielle ou totale du gène SMARCB1. Il a également révélé un réarrangement complexe d’ATRXsur un neuroblastome initialement vu comme simple délétion en NGS classique. Cette méthode d’enrichissement modulable à l’infini permet la détection des variants de structures par séquençage lectures longues en routine clinique, et pourrait compléter les techniques de NGS dans des indications qui doivent être définies.


Abderaouf HAMZA (Paris), Christine BOURNEIX, Elodie GIRARD, Victor RENAULT, Eric PASMANT, Nicolas SERVANT, Olivier DELATTRE, Julien MASLIAH-PLANCHON
18:00 - 18:15 #28572 - SS018 Recommandations pour l'interprétation de variants générés par le séquençage à haut débit : vers une homogénéité d'interprétation.
SS018 Recommandations pour l'interprétation de variants générés par le séquençage à haut débit : vers une homogénéité d'interprétation.

L’arrivée du séquençage à haut débit à visée diagnostique dans les laboratoires de génétique a augmenté drastiquement le nombre de variants génétiques identifiés par chaque analyse. L’interprétation de la signification clinique de ces variants est devenue un véritable défi pour les laboratoires, surtout pour les variants non décrits précédemment ou pour les variants dans des gènes dont les laboratoires n’avaient pas encore d’expertise spécifique. Afin de limiter la variabilité inter- et intra-laboratoire dans l’interprétation des variants en génétique moléculaire et d’aboutir à un consensus national, les recommandations nationales françaises ont été émises par le Groupe de Travail du Réseau NGS-Diag en 2018, en collaboration avec l’ANPGM, l’ACLF, l’AchroPuce et le GGC, ainsi que plusieurs Filières des Maladies Rares. Ces recommandations, basées en partie sur les recommandations ACMG-AMP, ont été adoptées par la grande majorité des laboratoires diagnostiques en France. Depuis la diffusion de ce document, un certain nombre de mises à jours et de précisions ont été publiés par les groupes de travail sur l’interprétation des variants au sein de ClinGen ainsi que par les groupes internationaux d’experts dans différents domaines de la génétique médicale, nécessitant une nouvelle mise à jour des recommandations françaises initiales.

Pour rechercher les récentes mises à jour des recommandations pour l’interprétation des variants issus des tests par séquençage à haut débit, un travail bibliographique extensif a été effectué. Les données de PubMed, ainsi que tous les documents disponibles sur le site de ClinGen ont été étudiés. Au total, dix publications décrivant des recommandations spécifiques à un gène ou un groupe de pathologies ont été identifiées (MYH7, Rasopathies, PAH, Surdités, CDH1, PTEN, MEN1, RUNX1, GAA, TP53). De plus, six nouvelles recommandations et précisions pour les arguments des critères ACMG-AMP ont été étudiées (PVS1, PS2/PM6, PS3/BS3, PM3, PP5/BP6 ou BA1). Tous les 28 arguments des recommandations ACMG-AMP ont été analysés. Les mises à jour ou des précisions ont été proposées pour 11 arguments suivants : PVS1, PS4, PM2/BS1/BA1, PM3, PS2/PM6, PP1, PP5, BP6. Les modifications proposées ont été ensuite discutées et travaillées au sein du groupe NGS-Diag permettant d’élaborer un document avec des modifications importantes par rapport à la première version des Recommandations. Ce nouveau document a été validé par les réseaux NGS-Diag et ANPGM avant d’être publiée et diffusée aux laboratoires de diagnostic génétique en France en mars 2021 (https://anpgm.fr/media/documents/BP-NGSDiag_001_Interpretation_Variants_v2.pdf). Ce travail facilitera l’homogénéisation de l’interprétation de variants de séquence générés par les analyses de séquençage à haut débit et aidera à diminuer l’errance diagnostique pour les patients atteints des maladies rares.


Svetlana GOROKHOVA (MARSEILLE), Cécile ACQUAVIVA-BOURDAIN, Stéphanie BAERT-DESURMONT, Sandrine CAPUTO, Nicolas CHATRON, Florence COULET, Martine DOCO-FENZY, Boris KEREN, Cédric LE MARECHAL, Jean MULLER, Gael NICOLAS, Vincent PROCACCIO, Pascale RICHARD, Pauline ROMANET, Cécile ROUZIER, Sarah SNANOUDJ, Pascale SAUGIER-VEBER, Martin KRAHN
Salle 3

Mardi 01 février

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D16
16:45 - 18:15

SESSIONS SIMULTANEES 04
Diagnostic prénatal, diagnostic pré-implantatoire, dépistage prénatal non invasif

Modérateurs : Erika LAUNAY (TOULOUSE), Julie STEFFANN (Praticien Hospitalier) (PARIS)
16:45 - 17:00 #28759 - SS019 Diagnostic prénatal non invasif des maladies monogéniques par dosage relatif d'haplotype.
SS019 Diagnostic prénatal non invasif des maladies monogéniques par dosage relatif d'haplotype.

Contexte. Pour diminuer les risques de perte fœtale liés au prélèvement invasif mis en œuvre lors du diagnostic prénatal des maladies génétiques, des méthodes non invasives de diagnostic prénatal ont été développées, basées sur l’étude de l’ADN fœtal circulant (cffDNA) dans le sang maternel. Le diagnostic prénatal non invasif pour les maladies monogéniques (DPNIgene) a été largement adopté par les patientes. Cependant, ses applications sont limitées à l'exclusion des variants pathogènes paternels ou de novo, l’étude de la transmission des variants maternels restant très complexe du fait de la présence prépondérante de l’ADN maternel environnant.

Objectif. Développer une méthode non invasive de diagnostic prénatal des maladies monogéniques, applicable quel que soit le mode de transmission ou la nature de l’anomalie génétique.

Méthode. Plus de 100 familles à risque de transmettre la mucoviscidose (transmission récessive, gène CFTR), la neurofibromatose de type 1 (transmission dominante, gène NF1), la myopathie de Duchenne (transmission récessive liée à l’X, gène DMD) ou l’hémophilie (transmission récessive liée à l’X, gènes F8 ou F9) ont été incluses dans l’étude DANNI, en parallèle de leur parcours de soin classique de diagnostic prénatal. Plusieurs échantillons ont été recueillis pour chaque famille : l’ADN nucléaire des parents, l’ADN nucléaire d’un cas index (si disponible), l’ADN plasmatique maternel et l’ADN nucléaire du fœtus (obtenu par prélèvement invasif). Ces échantillons ont été séquencés par NGS après enrichissement par capture ciblée des séquences codantes des gènes d’intérêts et de SNP situés à +/- 2Mb. Notre approche méthodologique se déroule en plusieurs étape, permettant 1/ de reconstruire les haplotypes parentaux afin d’identifier le.s haplotype.s à risque, lié.s à la pathologie ; 2/ de déterminer précisément la fraction d’ADN fœtal dans le plasma maternel ; 3/ de détecter qualitativement l’allèle paternel transmis au fœtus ; 4/ de détecter quantitativement l’allèle maternel transmis au fœtus par dosage relatif d’haplotype (RHDO); 5/ de déduire le génotype fœtal, en tenant compte des scores qualité visant à déterminer la fiabilité des résultats obtenus.

Résultats. 78 grossesses issues de 67 familles ont été testées. Le terme de grossesse au moment du prélèvement de plasma maternel variait de 7,6 à 31 SA. La fraction fœtale dans l’ADN plasmatique variait entre 3,1% et 19.7%. Les haplotypes parentaux ont pu être reconstitués dans 100% des cas à partir de la comparaison avec l’ADN d’un cas index ou de l’ADN du fœtus. L’étude de la transmission des haplotypes parentaux a permis d’obtenir un résultat conclusif et concordant avec le statut fœtal attendu dans 62/67 (93 %) des cas de DPNI, non conclusif dans 5/67 (7%) des cas et conclusif discordant dans 0/67 (0%) des cas.

Conclusion. Cette étude montre la faisabilité du dépistage prénatal non invasif des maladies monogéniques.


Mathilde PACAULT, Camille VEREBI, Magali CHAMPION, Lucie ORHANT, Alexandre PERRIER, Claude FEREC, Thierry BIENVENU, Romain DAVEAU, Juliette NECTOUX (paris)
17:00 - 17:15 #28315 - SS020 L’examen foetopathologique a-t-il un intérêt après séquençage d’exome en prénatal ?
SS020 L’examen foetopathologique a-t-il un intérêt après séquençage d’exome en prénatal ?

L’évaluation du pronostic des anomalies détectées en cours de grossesse est  souvent un défi pour les équipes de CPDPN. Il se base sur le type, la sévérité, le nombre de malformations et sur d’éventuelles hypothèses de diagnostic syndromique. Un diagnostic génétique peut aider à déterminer le pronostic et orienter les décisions relatives à la grossesse. Après une ACPA recherchant un déséquilibre génomique, un séquençage d’exome  (SE) est de plus en plus souvent discuté au sein des CPDPN, en particulier lorsque les couples sont confrontés à une incertitude diagnostique et pronostique pour décider de poursuivre ou non la grossesse. 

Notre expérience de SE prénatal sur signe d’appel échographique depuis 20 mois inclut 45 patientes. Un diagnostic moléculaire  a été réalisé dans 15 cas (33%) avec poursuite de la grossesse dans 7 cas (gènes DCC, DYNC2H1, OFD1, SLC26A3, COL1A1, ODAD4), montrant que le SE prénatal s’intègre également dans une politique nataliste en éclairant sur les modalités de prise en charge du nouveau-né. Sur les 8 interruptions médicales de grossesses (IMG), la décision résultait  du SE dans 6 cas.  Parmi les sans diagnostic, 22 grossesses ont été poursuivies et 2 diagnostics ont été guidés par l’examen clinique post-natal et relecture ciblée du SE (GPC3) ou par une autre technique (Silver-Russel); 5 IMG ont été réalisées sur la base de l’imagerie. En cas d’IMG, un examen fœtopathologique (EFP) est systématiquement proposé. Dans la mesure où les analyses génétiques sont conduites en amont de l’IMG, l’examen fœtopathologique  est-il encore indiqué ?

 

Parmi les 13 cas d’IMG, 9 fœtus ont bénéficié d’un EFP. Parmi les cas avec diagnostic, l’EFP a toujours conforté le diagnostic moléculaire, en particulier grâce à l’examen morphologique de la face (KMT2D, FLT4,  SOX9, PUF60, SLC25A24) et a rectifié le cadre nosologique une fois (immobilisme – TTN).   Trois couples n’ont pas souhaité l’EFP après le diagnostic et il persiste une description incomplète (ACC isolée, CDH2), ou au moins un signe non rapporté dans le syndrome retenu  (hydramnios, SKI ; HCN, CREBBP). Pour le cas sans diagnostic et sans EFP, les anomalies  cérébrales n‘ont pu être précisées  et la poursuite des explorations par séquençage de génome PFMG n’a donc pu être réalisée.

 

L’interprétation de certaines variations reste plus difficile en prénatal en raison du phénotype fœtal souvent partiel et de la méconnaissance de certains signes prénataux pour beaucoup de syndromes. Notre expérience  avec un délai de réponse d’un mois montre un taux de diagnostic supérieur à 30% apportant une aide à la décision pour les couples.  L’EFP est d’autant plus important que le phénotype est incomplet ou atypique, mais le reste pour améliorer la description des signes prénataux de syndromes rares.  En l’absence de diagnostic, il représente toujours une étape cruciale pour un phénotypage complet et précis permettant des hypothèses diagnostiques et la poursuite des explorations génétiques.


Roxana BORGHESE (paris), Nathalie ROUX, Giulia PETRILLI, Joana BENGOA, Alissandre LECORDIER, Romain NICOLLE, Amale ACHAIAA, Sophie CHUON, Zaina AIT ARKOUB, Giulia BARCIA, Sophie RONDEAU, Juliette NECTOUX, Clémence MOLAC, Sarah GROTTO, Vassilis TSATSARIS, Emmanuelle PANNIER, Yves VILLE, Emmanuel SPAGGIARI, Valérie MALAN, Marie-Paule BEAUJARD, Aurélie COUSSEMENT, Geneviève BAUJAT, Caroline MICHOT, Valerie CORMIER-DAIRE, Bettina BESSIERES, Laurence LOEUILLET, Julie STEFFANN, Jeanne AMIEL, Tania ATTIE-BITACH
17:15 - 17:30 #28760 - SS021 Quelle est la valeur de la détection d’anomalies chromosomiques autres que les trisomies communes par analyse de l’ADN libre circulant dans le sang maternel ?
SS021 Quelle est la valeur de la détection d’anomalies chromosomiques autres que les trisomies communes par analyse de l’ADN libre circulant dans le sang maternel ?

Le dépistage prénatal non invasif (DPNI) de la trisomie 21 par analyse de l’ADN libre circulant (ADNlc T21) fait aujourd’hui partie intégrante du paysage du dépistage prénatal en France. Dans les grossesses singletons, il est indiqué en 2ème ligne, sauf cas particuliers, devant un risque calculé par les marqueurs sériques maternels supérieur ou égal à 1/1000. Au moins 90% des tests ADNlc T21 réalisés aujourd’hui en France sont basés sur une analyse pangénomique ce qui permet, sous réserve d’une analyse bioinformatique appropriée, de détecter d’autres déséquilibres chromosomiques que les trisomies communes (21, 18 et 13). Or, peu d’études ont évalué ses performances dans ces anomalies en pratique clinique et aucune ne l’a fait à partir du test NIPT VeriSeq v2 utilisé dans plus de 90% des cas en France.

L’objectif principal de cette étude est d’estimer la valeur prédictive positive (VPP) du test ADNlc utilisant la technique NIPT VeriSeq, pour les trisomies rares et les anomalies segmentaires dans les grossesses singletons à risque élevé à modéré. L’objectif secondaire est d’évaluer l’incidence de ces anomalies. Nous avons donc mené une étude rétrospective multicentrique basée sur l’analyse des résultats DPNI de trois centres académiques, la plateforme DPNI de l’APHP à Cochin, la plateforme du CHU de Rennes et celle du CHU de Rouen. Seules les grossesses singletons ont été incluses et seules les trisomies rares, dont le rendu est recommandé par l’association des cytogénéticiens de la langue française (ACLF), ainsi que les anomalies segmentaires de plus de 7 Mb ont été évaluées.

Depuis Mars 2021, date de mise en place dans nos centres de la 2ème version de NIPT VeriSeq permettant la détection d’autres anomalies que les trisomies communes, nous avons détecté 69 anomalies chromosomiques parmi les 5081 DPNI réalisés chez des singletons, dont 21 trisomies rares de la liste de l’ACLF, 37 anomalies segmentaires et 11 situations d’anomalies multiples. Parmi les 69 anomalies détectées, 22 ont été signalées dans le compte-rendu et 13 d’entre elles ont été rendues en échec. La collecte des issues de grossesse est toujours en cours mais d’après nos résultats préliminaires la VPP pour les trisomies rares est inférieure à 10% et celle pour les anomalies segmentaires est d’environ 25%.

Le rendu d’une anomalie chromosomique autre que les trisomies communes détectée au décours d’un dépistage par ADNlc T21 est loin d’être trivial encore aujourd’hui en partie en raison de l’absence de données précises sur la VPP dans notre population. Notre étude sera donc d’une grande utilité pour une information la plus complète possible aux patientes et aux cliniciens.


Camille VEREBI, Erika LAUNAY, Céline DUPONT, Jonathan ROSENBLATT, Morgane VALENTIN, Lionel CARBILLON, Pierre François CECCALDI CARP, Jean Louis BENIFLA, Geneviève QUENUM, Jean-Marie JOUANNIC, Audrey ROSEFORT, Marc DOMMERGUES, Aurélie COUSSEMENT, Vassilis TSATSARIS, Olivier PICONE, Marie-Paule BEAUJARD, Yves VILLE, Aline RECEVEUR, Alexandre VIVANTI, Hanane BOUCHGHOUL, Yosra LAJMI BAHLOUL, Mathilde BARROIS, Jocelyn BRAYET, Pascal CHAMBON, Laïla EL KHATTABI (PARIS)
17:30 - 17:45 #28531 - SS022 Détermination prénatale non invasive du génotype fœtal chez des femmes enceintes présentant un diabète monogénique MODY-GCK : étude de faisabilité chez 24 patientes.
SS022 Détermination prénatale non invasive du génotype fœtal chez des femmes enceintes présentant un diabète monogénique MODY-GCK : étude de faisabilité chez 24 patientes.

Contexte. Le diabète MODY-GCK est la conséquence de variants hétérozygotes perte de fonction du gène de la glucokinase (GCK) se traduisant par une diminution de la sécrétion d’insuline. L’hyperglycémie (HG) associée au MODY-GCK étant modérée et stable au cours de la vie, aucun traitement antidiabétique n’est nécessaire en dehors de la grossesse. La particularité du MODY-GCK est que le traitement de l’HG maternelle au cours de la grossesse dépend du génotype GCK du fœtus. Si le fœtus a hérité du variant GCK maternel, sa croissance est normale car le niveau de glycémie auquel son insulinosécrétion est déclenchée est le même que celui de sa mère, le traitement de l’HG maternelle est donc inutile. En revanche, si le fœtus n’a pas hérité du variant GCK maternel, l’insulinosécrétion est augmentée en réponse à l’HG maternelle, ce qui accélère la croissance fœtale et augmente de 50% le risque de macrosomie. A ce jour, le dépistage prénatal non invasif du diabète MODY-GCK n’est pas disponible et la décision de traiter ou pas l’HG maternelle est difficile.

Objectif. Développer une méthode de détermination non-invasive du génotype GCK fœtal basé sur l’analyse de l’ADN fœtal libre circulant.

Méthodes. Etude ancillaire d’un PHRC national sur le diabète MODY-GCK ayant permis de collecter l’ADN plasmatique maternel et les ADN nucléaires des parents et de l’enfant à la naissance. Approche méthodologique basée sur l’analyse des données de séquençage à haut débit d’un panel « in house » de gènes incluant les régions codantes de GCK et des SNP situés à ± 2 Mb du locus d’intérêt, ayant permis (i) la reconstruction des haplotypes parentaux afin d’identifier l’haplotype maternel à risque et (ii) la détermination de l’haplotype maternel transmis au fœtus par dosage relatif d’haplotypes (RHDO) dans le plasma maternel.

Résultats. 24 femmes porteuses de variants distincts de GCK ont été analysées. L’ADN plasmatique a été extrait à 16 SA [12-25]. La fraction fœtale de l’ADN plasmatique a été estimée à partir de l’analyse des allèles paternels plasmatiques et variait entre 4,5% et 19.4%. Le nombre de SNPs informatifs au locus GCK pour la détermination des haplotypes maternels était de 404 [95-715]. Les résultats préliminaires de 12 cas pour lesquels l’ADN nucléaire d’un cas index était disponible montrent que notre approche a été conclusive dans 91.7% (11/12) des cas. Le test a prédit 3 fœtus porteurs de l’haplotype maternel à risque parmi les 11 cas conclusifs. La comparaison de ces résultats avec le génotype de l’enfant à la naissance montre un taux de concordance de 100%.

Conclusion. Cette étude montre la faisabilité du dépistage prénatal non invasif du diabète MODY-GCK. Le bénéfice majeur attendu de la détermination prénatale du génotype fœtal GCK sera d’adapter la prise en charge thérapeutique de la grossesse en connaissance du génotype fœtal et d’éviter ainsi à 50% des femmes avec un diabète MODY-GCK un traitement par insuline non justifié.


Juliette NECTOUX, Camille VEREBI (Paris), Romain DAVEAU, Amélie LAUNOIS, Lucie ORHANT, Gwendoline LEROY, Magali CHAMPION, Delphine BOUVET, Cécile SAINT-MARTIN, Cécile CIANGURA, Christine BELLANNÉ-CHANTELOT
17:45 - 18:00 #27909 - SS023 Etude de faisabilité du Diagnostic Préimplantatoire pour maladies monogéniques par séquençage haut débit.
SS023 Etude de faisabilité du Diagnostic Préimplantatoire pour maladies monogéniques par séquençage haut débit.

En France, le Diagnostic Préimplantatoire (DPI) pour maladies monogéniques repose actuellement sur la technique de PCR multiplex. L’analyse familiale de marqueurs microsatellites, et éventuellement de la mutation, permettent l’haplotypage et le diagnostic sur les embryons lors du DPI. Une mise au point couple-spécifique est souvent nécessaire et pose parfois des difficultés (manque d’informativité des marqueurs de la région, double-indications, mutations de novo …). Afin de répondre au plus grand nombre de demandes de DPI pour une indication donnée, nous proposons une approche par séquençage haut-débit (NGS) ciblé pour le DPI de certaines maladies monogéniques, basée sur l’analyse de Single Nucleotide Polymorphism (SNP, analyse indirecte) et des exons codants de certains gènes (analyse directe).

Cette approche nécessite :

- une quantité d’ADN importante, obtenue après amplification de tout le génome (MDA) rendue possible par la biopsie embryonnaire au stade blastocyste pour récolter des échantillons pluricellulaires (trophectoderme), afin de réduire le risque d’Allele DropOut (ADO) ;

- des outils bioinformatiques permettant une analyse ciblée sur le gène d’intérêt dans le cadre d’un panel multi-gènes puisque la loi française restreint l’analyse sur les embryons à la région concernée par la demande de DPI.

Nous avons développé un panel ciblé de 38 régions incluant des centaines de SNP par région et les exons codant de 24 gènes soit environ 16000 cibles. Le séquençage est réalisé sur la plateforme NextSeq550 (Illumina) et l’analyse est limitée à la région d’intérêt grâce au développement d’une application spécifique au DPI au sein du pipeline bioinformatique STARK.

Une vingtaine de familles pour lesquelles un DPI a déjà eu lieu à Strasbourg a été sélectionnée pour la validation de la technique. La première étape consiste en l’analyse de trios (le couple et un apparenté avec mutation) afin de vérifier la détection des mutations le cas échéant et d’évaluer le niveau d’informativité des SNP situés dans la région d’intérêt. Une partie de l’haplotypage peut ainsi être faite en amont de l’étude sur les embryons. La deuxième étape consiste en la réanalyse d’embryons issus de DPI pour ces couples (une cinquantaine d’embryons non transférables ou d’échantillons ayant subi une amplification génome entier dans le cadre de la tentative de DPI) et permettra de vérifier la concordance des diagnostics obtenus par PCR multiplex et par NGS.

A l’heure actuelle, la concordance du statut de 7 embryons issus de DPI pour 4 familles avec des indications variées (autosomique dominante, récessive ou liée à l’X) a été validée et l’analyse des autres échantillons est en cours.

Si ces résultats sont confirmés, cette nouvelle approche devrait permettre de simplifier la validation technique et de réduire le délai avant tentative pour des couples difficiles à prendre en charge avec la technique traditionnelle.


Emmanuelle KIEFFER, Nadia BIHEMI, Sarah DONAT, Julien TARABEUX, Samuel NICAISE, Nicolas BECKER, Catherine CELEBI, Jean MULLER, Antony LE BECHEC, Céline MOUTOU (STRASBOURG)
18:00 - 18:15 #27848 - SS024 Projet pilote national ANDDI-PRENATOME d’exome en diagnostic prénatal : taux diagnostique de 43% en première intention dans un délai médian de 28 jours.
SS024 Projet pilote national ANDDI-PRENATOME d’exome en diagnostic prénatal : taux diagnostique de 43% en première intention dans un délai médian de 28 jours.

Introduction: Le diagnostic prénatal (DPN) de maladies génétiques à expression échographique est un véritable défi médical puisque la découverte d’anomalies échographiques anténatales est fréquente (5 à 10% des grossesses). Actuellement, en France, le DPN repose sur des examens d’imagerie ou des investigations infectieuses, métaboliques, immunologiques et génétiques (caryotype, ACPA et séquençage éventuel de gènes ciblés lorsqu'ils sont disponibles dans un délai compatible avec la grossesse). Le caryotype identifie une anomalie chromosomique causale chez environ 20 à 30% des fœtus avec anomalie du développement (AD) avec une augmentation de 3 à 6.5% par ACPA. Malgré le développement du séquençage haut débit d’exome (ES) et de génome (GS), peu de pays se sont actuellement lancés dans l’ES/GS en DPN, à cause des contraintes de délai court de rendu de résultats et de la difficulté d’interprétation des données génomiques en présence de données cliniques parcellaires, parfois réduites aux données d’imagerie anténatale.

Nous présentons les résultats préliminaires du projet pilote ANDDI-PRENATOME dédié à l’étude de la faisabilité d’une analyse d’ES en DPN chez des fœtus avec anomalies échographiques.

Méthodes: Lors du diagnostic échographique (10-34SA) de 2 anomalies majeures, ou 1 anomalie majeure et 1 anomalie mineure, ou 1 anomalie (majeure ou mineure) avec forte suspicion de cause génétique, un ES en trio est réalisé en urgence sur liquide amniotique, en parallèle ou après ACPA. Le délai de rendu était fixé à un maximum de 42 jours. Seules les variations classe 5, 4 et 3+ en lien avec le phénotype échographique sont rendues au clinicien.

Résultats: En 2 années, 100 grossesses (15 centres) sont inclues. L’ES est réalisé en 1ère intention chez 75/100 et après ACPA normale chez 25/100. Entre la réception de l’échantillon fœtal par notre laboratoire et la date de compte-rendu au clinicien, le délai médian est de 28 jours. Le taux diagnostique de l’ES est de 43% (33/77) en 1ère intention et de 22% (4/18) après ACPA. En 1ère intention, l’ES identifie systématiquement les 6 CNV trouvés par l’ACPA. Au final, un diagnostic causal est identifié chez 39 fœtus (39 SNV et 6 CNV), de même que 5 variations 3+. 23/45 variations de classes 4 et 5 sont survenues de novo. 17/90 grossesses étant interrompues avant le rendu des résultats. Un pronostic vital et/ou neurodéveloppemental défavorable est identifié dans 51% des grossesses avec résultat positif.

Conclusion: L’ES en DPN est réalisable avec des délais de rendus raisonnables et un intérêt certain pour la prise en charge de la grossesse. Dans les AD, le taux diagnostique apparait semblable à celui de la période postnatale. La majorité de causes sporadiques rend indispensable l’analyse en trio. Son application à plus grande échelle avec notamment une étude de son impact sur l’organisation du système de soins et le parcours de soins doit par ailleurs être menée avant d’envisager son implémentation en routine.


Frédéric TRAN MAU-THEM (DIJON), Anne-Sophie DENOMMÉ-PICHON, Hana SAFRAOU, Ange-Line BRUEL, Antonio VITOBELLO, Sophie NAMBOT, Julian DELANNE, Aurore GARDE, Caroline RACINE, Victor COUTURIER, Valentin BOURGEOIS, Arthur SORLIN, Sebastien MOUTTON, Chloé QUELIN, Marie LEGENDRE, Cindy COLSON, Anne-Claire BREHIN, Alban ZIEGLER, Audrey PUTOUX, Alinoe LAVILLAUREIX, Anne-Marie GUERROT, Jeanne AMIEL, Caroline ROORYCK-THAMBO, Carine ABEL, Patricia BLANCHET, Magali GORCE, Godelieve MOREL, Alice GOLDENBERG, Nicolas GRUCHY, Melanie FRADIN, Agnes GUICHET, Odile BOUTE, Elise SCHAEFER, Gabriella VERA, Catherine VINCENT-DELORME, Rodolphe DARD, Christine FRANCANNET, Estelle COLIN, Marie VINCENT, Bertrand ISIDOR, Sylvie ODENT, Emilie TISSERAND, Philippine GARRET, Yannis DUFFOURD, Christophe PHILIPPE, Laurence FAIVRE, Christel THAUVIN
Salle 4

Mardi 01 février

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F16
16:45 - 18:15

WORKSHOP GENETIQUE et CANCER

Modérateurs : Marie Dominique GALIBERT (RENNES), Etienne ROULEAU (Praticien Spécialiste) (VILLEJUIF)
Salle 5
18:15

Mardi 01 février

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A17
18:15 - 20:30

COCKTAIL D'OUVERTURE

Salle 1
Mercredi 02 février
08:30

Mercredi 02 février

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A21
08:30 - 10:30

CONFERENCE PLENIERE 2
Nouveaux mécanismes génétiques

Modérateurs : Houda HAMDI-ROZÉ (Praticien Hospitalier) (Rennes), Stanislas LYONNET (PARIS)
08:30 - 10:30 Expansion de nucléotides: vieux mécanismes qu’on redécouvre autrement. Christel DEPIENNE (Professeur) (Essen (Allemagne), Allemagne)
08:30 - 10:30 Micros ARN, signatures génétiques. David GILOT (Maitre de Conférences) (Rennes)
08:30 - 10:30 Mécanismes de compensation génétique. Didier STAINIER (Directeur) (Bad Nauheim, Allemagne)
08:30 - 10:30 Variants synonymes. Artem KIM (Doctorant) (Rennes)
Salle 1
10:30 PAUSE - VISITE DES STANDS ET EPOSTERS Salle 1
11:30

Mercredi 02 février

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A23
11:30 - 13:00

COMMUNICATIONS ORALES SÉLECTIONNÉES 01

Modérateurs : Wilfrid CARRE (Ingénieur) (Rennes), Laurence OLIVIER-FAIVRE (PUPH) (DIJON)
11:30 - 11:45 #28563 - CS01 Mouse models of neurodevelopmental disorders.
CS01 Mouse models of neurodevelopmental disorders.

Neurodevelopmental disorders are extremely genetically heterogeneous developmental disorders of the brain. Although next-generation sequencing has revolutionized our ability to identify genes, as many as 50% of patients still wait years for a genetic diagnosis, by our lack of knowledge of function for most genes in the genome. Neurodevelopmental disorders are frequently associated with developmental structural abnormalities of the brain such as microcephaly, macrocephaly, hypoplasia of the hippocampus, thin cortex, atrophy of the cerebellum, or agenesis of the corpus callosum. These neuroanatomical phenotypes can thus be used as reliable and easily measurable endophenotypes of neurodevelopmental disorders, which in turn can be evaluated in animal models. Recently, my group identified 164 genes newly involved in mammalian brain morphology using a highly robust approach for the assessment of 161 neuroanatomical parameters in 1,566 lines of mutant mice through a collaboration with the International Mouse Phenotyping Consortium. By sharing these 164 genes on the GeneMatcher platform (https://genematcher.org/) and in collaboration with several French and International teams, we identified a similarity of brain phenotypes between the two species for 16 of these genes, most of the time involving few patients. The identification of additional patients with similar manifestations would make it possible to conclude with certainty on the involvement of these 16 genes of interest in neurodevelopmental disorders. These preliminary results demonstrate the value of high-throughput neuroanatomical studies and the relevance of the mouse model to provide a solution to the problem of diagnostic odyssey, in particular in complex and ultra-rare cases, by combining high-throughput identification of genes and pathophysiological mechanisms.


Binnaz YALCIN (Dijon)
11:45 - 12:00 #28479 - CS02 Mode de transmission oligogénique dans les Anomalies de Fermeture du Tube Neural: implication majeure des gènes du cil primaire, de la Polarité Planaire Cellulaire et de la matrice extracellulaire.
CS02 Mode de transmission oligogénique dans les Anomalies de Fermeture du Tube Neural: implication majeure des gènes du cil primaire, de la Polarité Planaire Cellulaire et de la matrice extracellulaire.

Les anomalies de fermeture du tube neural (AFTN) sont des malformations congénitales sévères à l’origine d’une fermeture incomplète du tube neural qui concernent environ 5 naissances sur 10 000. Des études récentes chez le modèle murin et chez l’Homme suggèrent une origine multifactorielle impliquant des facteurs environnementaux (déficit en acide folique, toxiques, diabète gestationnel) et des facteurs génétiques (gènes de la Polarité Planaire Cellulaire (PCP), gènes du métabolisme des folates). Une transmission oligogénique, c’est-à-dire l’effet cumulatif de plusieurs variants rares dans les gènes associés à la maladie, est une hypothèse évoquée chez l’Homme et démontré chez la souris dans les gènes de la voie PCP. Nos objectifs sont de mieux caractériser les gènes et/ou les voies de signalisations impliqués dans la survenue de cette pathologie et de préciser le mode de transmission complexe.

Cette étude multicentrique se base sur le séquençage de l’exome de 28 familles (exomes trio, quatuor, quintuor) et de 74 patients (exomes solo) atteint d’AFTN. L’analyse a porté sur un panel in-silico de gènes candidats primaires (impliqués dans les AFTN chez l’homme et/ou le modèle murin) et secondaires (gènes impliqués dans les mêmes voies de signalisations que les gènes primaires). L’étude des familles a permis de sélectionner des variants rares (fréquence < 1% dans gnomAD) et délétères (score CADD > 20) pour former des combinaisons oligogéniques présentant une ségrégation familiale concordante. Une seconde analyse d’enrichissement de combinaisons oligogénique dans la cohorte de patients (exomes solo) par rapport à une cohorte contrôle d’individu sain (cohorte GoNL) a été effectué sur les gènes issus de l’étude des familles.

88 gènes candidats sont impliqués dans des combinaisons oligogéniques chez 54% des familles. Les voies de signalisations les plus représentées sont la voie du cil primaire (17% des gènes), des gènes de la voie PCP (12%) mais sont aussi impliqués des gènes de la matrice extracellulaire (12%), des gènes de la voie Wnt/Notch/SHH (9%), des gènes de l’apoptose (9%) et des gènes du métabolisme des folates (6%). Dans un second temps, au sein de notre cohorte de cas solo, un enrichissement de combinaisons oligogéniques a été mis en évidence (58% de combinaisons chez les cas contre 22% dans la cohorte de contrôle) avec une p-value très significative de 1,66E-08.

Les AFTN sont des pathologies présentant une très forte hétérogénéité génétique et un mode de transmission complexe avec l’implication de plusieurs variants au sein d’un même individu dans notre cohorte. Les principales voies de signalisations impliquées ont un impact important sur la migration cellulaire et l’apoptose, mécanismes majeurs de la fermeture du tube neural. Afin de confirmer les résultats d’enrichissement de combinaisons oligogèniques, une étude réplicative sera effectuée sur une deuxième cohorte indépendante (511 cas).

 


Marie FAOUCHER (Rennes), Artem KIM, Wilfrid CARRÉ, Marie BEAUMONT, Florence DEMURGER, Linda AKLOUL, Laurent PASQUIER, Mélanie FRADIN, Chloé QUÉLIN, Houda HAMDI ROZE, Erwan WATRIN, Sylvie ODENT, Marie DE TAYRAC, Christèle DUBOURG, Valérie DUPÉ
12:00 - 12:15 #28006 - CS03 LBMMS SeqOIA : leçons des 2 premières années.
CS03 LBMMS SeqOIA : leçons des 2 premières années.

La production massive d’examens diagnostiques tels que génomes, exomes ou transcriptomes constitue un défi sans précédent à l’échelle du pays.

Au terme d’un peu plus de deux années de fonctionnement, le laboratoire SeqOIA présente les principes fondateurs de son organisation interne, dresse le bilan opérationnel de ce modèle d’exploitation et en extrait les principaux enseignements.

En cumul depuis 2019, les volumes de prescriptions en zone nord et sud, sont sensiblement identiques qu’il s’agisse des champs maladies rares, cancers ou oncogénétique. Contrairement aux prévisions initiales, les prescriptions des maladies rares excèdent nettement celles des cancers (80% versus 20%).

Les problématiques pré-analytiques incluant la e-prescription dans le contexte des RCP et la logistique sont un facteur très sensible dans la fluidité du processus de réalisation des examens. La gestion des non-conformités pré-analytiques (action requise sur les échantillons ou la prescription) constitue un poste très chronophage, source de ralentissement.

L’écoulement du flux analytique SeqOIA est très robuste : le nombre de dossiers complets en attente de séquençage est faible et stable. Le temps analytique est de l’ordre de 1 mois.

L’organisation du secteur post-analytique (validation biologique des résultats) est un troisième secteur stratégique. Si le flux d’examens entrants sont comparables dans les deux LBM-FMG, le flux sortant de comptes rendus diffère actuellement sensiblement. En septembre 2021, SeqOIA a généré 73% des comptes rendus maladies rares et 61% des comptes rendus cancers (en dépit d’un démarrage d’activité différé). Le modèle post-analytique de SeqOIA lui est propre. Il est fondé sur les piliers suivants :

1.       L’expertise des biologistes : mettre les meilleures compétences en face des questions posées par un examen

2.       La mobilisation de l’ensemble des biologistes de la zone nord : 185 biologistes habilités à la validation des examens

3.       Le développement bioinformatique au plus près des besoins: 2 groupes Bioinfo SeqOIA pour la génétique constitutionnelle et la génétique somatique

4.       Une interface d’interprétation (GLeaves) ouverte et flexible : les biologistes sont libres d’accéder à l’intégralité des données, d’y exercer leur expertise et de répondre sur mesure à la ou aux questions posées par le prescripteur

5.       L’animation collective des biologistes via la mise en place de 13 RICB pour les maladies rares et de RCP d’aval pour les tumeurs solides et l’oncohématologie

6.       La diffusion des connaissances via des webinaires et la montée en compétence des biologistes.

Cette organisation permet à SeqOIA d’anticiper la montée en charge des examens, de répondre aux défis en matière d’amélioration des rendements diagnostiques et de permettre à l’ensemble des biologistes, sur la zone géographique qui lui est dévolue, de s’intégrer dans la médecine génomique.