Le diagnostic préimplantatoire a été autorisé par la loi de Bioéthique de 1994. Le centre de DPI de Strasbourg fait partie des cinq centres français autorisés et a débuté son activité dès 1999. Accrédité pour le DPI par PCR et par FISH depuis 2018, il est le seul à prendre en charge les couples en cas de risque viral, hépatites et HIV, et réalise la plupart des DPI pour mutation de novo. Notre expertise permet de prendre en charge la quasi-totalité des pathologies retenues par le centre pluridisciplinaire de diagnostic prénatal local.

Nous présentons ici un bilan de vingt ans d’expérience.

Jusqu’en octobre 2019, 2160 dossiers ont été ouverts à Strasbourg : 1471 pour pathologies monogéniques et 689 pour anomalies du caryotype. 15% des dossiers ont été refusés surtout pour des difficultés de mise en œuvre de la FIV, 18% des couples ont abandonné leur demande. Nous avons développé des tests par PCR pour plus de 120 pathologies monogéniques et mis au point des diagnostics par FISH pour près de 450 couples. Nous recensons 2274 tentatives pour 984 couples, avec une activité annuelle croissante jusqu’en 2016, puis stabilisée autour de 200-230 cycles. Plus de 500 enfants sont nés grâce à notre activité.

Le DPI a bénéficié des évolutions techniques de l’assistance médicale à la procréation. Depuis 2006 la politique de transfert électif d’embryons a permis de limiter le risque de grossesse multiple. Depuis 2012, la vitrification embryonnaire facilite l’organisation du laboratoire et augmente les chances globales de succès puisque le taux moyen de grossesse clinique par transfert est de 31% que les embryons soient frais ou vitrifiés. Le taux de grossesse par transfert reste fortement corrélé à l’âge de la femme au moment de la tentative : 32% avant 38 ans,  25% entre 38 et 40 ans et 10% après 40 ans. La culture embryonnaire prolongée et la biopsie au stade blastocyste permettent désormais de disposer de plus de matériel génétique et de limiter les risques d’erreur de diagnostic.

Les techniques d’analyse à haut débit ont amélioré le diagnostic génétique, ce qui conduit inévitablement à demander un DPI pour certains couples jusqu’alors en errance de diagnostic. Il en résulte une augmentation de demandes pour des pathologies confidentielles nécessitant des mises au point spécifiques et entrainant un allongement des délais de prise en charge. L’amplification préalable du génome entier à partir de plusieurs cellules embryonnaires est alors utile pour simplifier le développement ou pour des DPI complexes.

La communauté internationale migre progressivement vers les techniques d’analyse à haut débit (CGHarray, karyomapping, NGS), difficiles à mettre en œuvre en France du fait du cadre légal, mais qui seraient pourtant incontournables pour assurer une égalité d’accessibilité au DPI dans des délais acceptables, quelle que soit l’indication. Cela nécessiterait au préalable une adaptation de ces techniques ou une modification de la loi, actuellement en cours de révision.

L’accès aux données génétiques fœtales via le plasma maternel permet d’envisager une approche non invasive notamment dans les cas où le risque d’atteinte fœtale est faible. Dans 70 % des cas de déficience intellectuelle, les mutations identifiées sont de novo. Le risque de récurrence est donc faible pour les nouvelles grossesses mais très fréquemment les couples demandent un diagnostic prénatal invasif devant le risque de mosaïque parentale. Pour ces familles, nous avons développé une approche universelle permettant la recherche de la mutation familiale identifiée directement sur le plasma de la mère, en réalisant une approche par capture de notre panel des 500 gènes de déficience intellectuelle suivie de séquençage haut débit. La méthode de capture a été adaptée aux faibles quantités d’ADN plasmatique pour obtenir une profondeur moyenne de 500 X et le pipeline bioinformatique a été adapté à la détection de variation en mosaïque faible, la variation recherchée représentant environ 5 % des reads.

Nous avons réalisé une validation de méthode par l’analyse de 18 trios (mère, fœtus, plasma maternel). Les variations, sans lien avec la DI mais spécifiques du fœtus et non présentes chez sa mère, ont été extraites bioinformatiquement ; ces positions ont ensuite été étudiées en terme de profondeur et de nombre reads mutés. Les analyses ont montré que, suite aux adaptations techniques réalisées, la profondeur moyenne obtenue à partir de notre capture de 500 gènes est de 649X. Nous avons également analysé la sensibilité analytique à partir d’un set de 6089 variations fœtales d’origine paternelle, et donc que l’on devait retrouver à faible fraction allélique dans le plasma maternel. La détection a été considérée comme positive à partir d’un read porteur de la variation attendue. Cette sensibilité de détection est de 98,54%. La spécificité analytique a été approchée en tenant compte du bruit de fond de la méthode et est estimée à 99,75 % dans le système analytique utilisé (Nextseq550 et capture Roche).

L’utilisation d’une approche non invasive par capture et analyse en séquençage haut débit est donc tout à fait envisageable dans le cadre de la déficience intellectuelle, pour les familles où une mutation de novo est identifiée. Cette approche permettra de rendre un diagnostic négatif avec une bonne valeur prédictive négative (98,55%), même si celle-ci restera inférieure à un diagnostic prénatal invasif qui permet un diagnostic de certitude. Cette validation de méthode a permis de définir les modalités d’analyse à envisager en routine (vérification préalable de la bonne couverture de la variation sur le cas index avec la capture, analyse en trio père, mère et plasma maternel au moment du prénatal) les contrôles internes à valider pour un rendu diagnostic (quantité d’ADN plasmatique initiale > 15 ng pour éviter l’allèle drop out, fraction fœtale observée > 5 % au moment de l’analyse et couverture observée à la position  de la variation pathogène > 300 X).

Introduction : Les anomalies structurelles fœtales concernent 2 à 3% des grossesses et sont associées à une forte mortalité et morbidité périnatale. Leurs étiologies génétiques constituent un enjeu diagnostique tant pour la connaissance du pronostic fœtal que pour le conseil génétique parental. Après exclusion des anomalies cytogénétiques fœtales, l’utilisation du séquençage haut débit d’exome dans le cadre du diagnostic prénatal (DPN) apporte un service médical rendu significatif. Le rendement diagnostic variable des études publiées (6-80%) reflète cependant le manque de consensus sur son usage. Nous évaluons l’efficacité du séquençage d’exome fœtal intégré au DPN de routine et discutons les enjeux diagnostiques et éthiques associés.

Méthode : Les couples ont été recrutés de façon prospective entre novembre 2018 et octobre 2019 (11 mois). Les critères d’inclusion étaient la survenue d’une anomalie fœtale (élévation de la clarté nucale isolée ou associée à d’autres anomalies, existence d’une ou plusieurs malformations) et l’absence de diagnostic cytogénétique (caryotype conventionnel et APCA). Une consultation de génétique pré-test et post-test de rendu de résultat étaient proposées aux couples. L’analyse en trio de l’exome fœtal était conduite de façon indépendante par deux spécialistes en génétique médicale et le résultat était discuté en réunion clinico-biologique avant validation. L’analyse des données secondaires actionnable (liste « ACMG ») et portages hétérozygotes sain (liste « Kingsmore ») était proposée aux couples.

Résultat : L’analyse d’exome fœtal a été proposée dans 95 cas et a été conduite chez 20 « trio », parmi lesquelles 17 ont accepté la consultation prétest. Les analyses étaient conduites entre 15 et 24 SA. La médiane du délai de rendu du résultat (hors données secondaires) était de 16,9 jours [7 – 33] après la consultation pré-test. 4 couples ont accepté la consultation post-test. 11 variants ont été identifiés dans autant de trio (55%), parmi lesquels 6 dans les gènes POMT1, RAPSN, KRAS, ACTG2, COL2A1, COL1A1 et CPLANE1 ont été considérés pathogènes (classe ACMG 4 ou 5) et 4 ont été classé variants de signification indéterminée bien que possiblement pathogènes (FAT4, PRRX1, PHF8, MMP13). 10 couples (50%) ont souhaité l’analyse des données secondaires.

Discussion : Le séquençage d’exome fœtal apporte une aide majeure au DPN de routine lorsqu’il est encadré au sein d’une équipe de génétique médicale. Il contribue via le partage des données secondaires au service médicale globale rendu aux patients. Les principales difficultés d’interprétation étaient liées aux phénotypes fœtaux non spécifiques où l’utilisation des critères de classification de l’ACMG doit être adaptée, ainsi qu’au manque de connaissances sur les phénotypes anténataux précoces des pathologies dont le phénotype post natal est bien décrit. Nous proposons un algorithme décisionnel intégrant le séquençage d’exome en DPN de routine permettant de minimiser ces écueils.

Introduction : L'insuffisance ovarienne primitive (IOP) affecte ~1% des femmes avant 40 ans et conduit le plus souvent à une infertilité définitive. La plupart des causes sont inconnues mais des causes génétiques croissantes ont été identifiées grâce au séquençage nouvelle génération (NGS).

Patients et méthodes : 200 patientes avec IOP à caryotype 46, XX sans prémutation de FMR1 ont été étudiées dont 145 formes sporadiques et 55 familiales. Nous avons développé un panel NGS ciblé comprenant 70 gènes impliqués dans les IOP. 30 patientes ont eu un séquençage d’exome (WES).

Résultats et discussion: Le panel NGS a retrouvé des variants pathogènes ou probablement pathogènes chez 30% des patientes. Dans 1/3 des cas, il s’agit de gènes de méiose ou de réparation de l’ADN. Le WES a permis de décrire pour la première fois le rôle de deux gènes impliqués dans la réparation d’ADN et l’anémie de Fanconi dans deux formes familiales et consanguines d’IOP isolée sans aucun antécédent de cancer. Nous avons retrouvé une mutation tronquante de MCM8, gène impliqué dans la recombinaison homologue, dans une forme syndromique d’IOP avec tumeurs cutanées bénignes et instabilité chromosomique. Nous avons aussi répliqué l’implication d’autres gènes de cette famille décrits dans un seul ou de rares cas comme SPIDR, PSMC3IP, POF1B, MCM9, ….

Devant des formes d’IOP apparemment isolées, nous avons identifié des mutations de gènes d’IOP syndromiques comme PMM2 et GALT, impliqués dans des maladies métaboliques à révélation néonatale sévère, ou encore FOXL2, responsable du syndrome BPES, sans aucune anomalie ophtalmique.

Un bilan complet avec recherche de comorbidités associées a permis un conseil génétique et thérapeutique adaptés dans la famille.

L’étude génétique a pu également donner des informations sur la persistance d’une réserve ovarienne lorsqu’un défaut moléculaire d’un gène impliqué dans la croissance folliculaire a été identifié (FSHR, BMP15, GDF9, AMH, ESR2, NOBOX, GJA4…).

Une préservation de la fertilité chez la patiente et les porteuses asymptomatiques de la famille est alors nécessaire pour éviter l’atrésie folliculaire rapide au vu des technologies innovantes de maturation folliculaires in vitro en développement.

Conclusion : Notre stratégie NGS optimise le criblage moléculaire de l’IOP avec un rendement de 30% et confirme la grande hétérogénéité génétique de ce syndrome.  L’étude génétique est essentielle pour 1) identifier la cause de l’IOP 2) permettre une prise en charge personnalisée et un conseil génétique adapté 3) détecter et traiter les comorbidités associées ou préserver la fertilité résiduelle en fonction du défaut génétique observé.

 Le nouveau lien existant entre gènes responsables d’IOP et gènes des tumeurs/cancers rend indispensable le diagnostic génétique de toute IOP sans cause connue et modifie profondément la prise en charge de ces patientes et de leur famille. Un suivi à long terme au sein d’une équipe multidisciplinaire est nécessaire.

Le cil mobile respiratoire et le flagelle du spermatozoïde partagent une structure axonémale conservée au cours de l’évolution. Des défauts dans leur structure et/ou leur fonction sont associés à la dyskinésie ciliaire primitive (DCP), une maladie génétique caractérisée par des infections chroniques du tractus respiratoire, pour laquelle la plupart des hommes sont infertiles en raison d’une asthénozoospermie.

Parmi les complexes protéiques axonémaux bien décrits, les bras de dynéines externes (BDE), via l’activité ATPasique de leurs chaines lourdes, jouent un rôle majeur dans le battement ciliaire et flagellaire. Cependant, la contribution des différentes chaînes lourdes (type gamma : DNAH5 et DNAH8, et type beta : DNAH9, DNAH11 et DNAH17) est inconnue dans la composition des BDE issus de ces deux organelles.

L’analyse de cinq hommes avec une infertilité isolé, et présentant une perte des BDE dans le flagelle de leurs spermatozoïdes mais pas dans leurs cils respiratoires, nous a permis d’identifier des mutations bi-alléliques pathogènes de DNAH17.

Le phénotype d’infertilité isolé, sans atteinte respiratoire, nous a amené à comparer la composition protéique des BDE dans les axonèmes de cils et de flagelles issus d’individus contrôles. Nous avons montré que DNAH17 et DNAH8, mais pas DNAH5, DNAH9 ou DNAH11, colocalisent avec l’alpha-tubuline le long de l’axonème des spermatozoïdes, tandis que l’image opposée est observée dans les cils respiratoires, expliquant ainsi le phénotype restreint aux spermatozoïdes. Nous avons aussi démontré la perte de fonction associée aux mutations de DNAH17 chez deux sujets sans lien de parenté, par des études d’immunomarquage sur spermatozoïdes (western blot et immunofluorescence). Ces analyses ont montré l’absence de DNAH17 et DNAH8 dans le flagelle des spermatozoides, contrairement à DNAH2 et DNALI1, deux composants des bras internes de dynéines, qui se sont révélés présents.

Pour conclure, cette étude démontre que les mutations de DNAH17 sont responsables d’infertilité masculine isolée, et précise la composition des BDE dans le spermatozoïde humain et le cil respiratoire.

L’analyse du caryotype fœtal est recommandée par amniocentèse en cas de double échec du dépistage de la trisomie 21 basé sur l’ADN foetal dans le sang maternel (ADNlc)(1). Avec la technique VeriSeq d’Illumina, une des causes d’échec est nommée « Data Outside of Expected Range »(DO). Elle correspond à un échec de l’analyse de données dû à une représentation anormale d’une partie du génome sur des chromosomes autres que 21, 18 et 13(2). Le logiciel VeriSeq ne précise pas quelle région chromosomique est concernée. Peu d'anomalies sont mises en évidence par le caryotype foetal et l'issue de la grossesse est le plus souvent normale mais l'identification des anomalies chromosomiques pourrait être utile au suivi obstétrical. Nous avons donc développé un logiciel spécifique à partir de plusieurs publications (3,4) pour préciser, a posteriori, qu’elles étaient les régions chromosomiques concernées. Ce logiciel recherche un déséquilibre du nombre de lectures alignées sur une fenêtre glissante de 50kb par rapport à un jeu de données de référence. Nous présentons 4 cas d’échec DO accompagnés d’anomalies fœtales ou de complications obstétricales pour lesquels des déséquilibres ont été ainsi identifiés. Dans deux cas avec RCIU et prématurité, une trisomie 16 confinée au placenta a été trouvée (5,6). Dans les deux autres cas il existait un syndrome malformatif : une anomalie compatible avec une tétrasomie 9p fœtale correspondant au syndrome polymalformatif constaté (7) et une double trisomie pour les chromosomes 3 et 7 ont été mises en évidence. Si la trisomie 3 est une anomalie rare (8), la trisomie 7 est plus fréquemment découverte en cours de grossesse et parfois associée à une autre trisomie (9). Les deux trisomies peuvent expliquer le signe majeur qui était une microcéphalie. 1. JORF n°0294 du 20 décembre 2018 2.Guide du logiciel VeriSeq NIPT Solution – Illumina. https://support.illumina.com  3. C. Zhao et al., « Detection of Fetal Subchromosomal Abnormalities by Sequencing Circulating Cell-Free DNA from Maternal Plasma », Clin. Chem., vol. 61, n^o 4, p. 608‑616, avr. 2015.  4. R. Straver, et al, « WISECONDOR: detection of fetal aberrations from shallow sequencing maternal plasma based on a within-sample comparison scheme », Nucleic Acids Res., vol. 42, n^o 5, p. e31‑e31, mars 2014.  5. Toutain Jet al  (2018) Confined placental mosaicism revisited: Impact on pregnancy characteristics and outcome. PLoS One. 2018; 13(4): e0195905.  6. Grati FR et al. Outcomes in pregnancies with a confined placental mosaicism and implications for prenatal screening using cell-free DNA. Genetics in Medicine (2019) ) 7. S Dhandha,et al. Three Cases of Tetrasomy 9p American Journal of Medical Genetics 2002 113(4):375-80 8. H. Kapaya , et al.  Trisomy 3 confined placental mosaicism: A management dilemma. Journal of Obstetrics and Gynaecology  2012 – 32( 7 ):696-98 9. Y Qi ,et al.The significance of trisomy 7 mosaicism in non invasive prenatal screening. Hum Genemics 201913(1):18

Les études d’association pangénomique ont identifié 250 loci indépendants associés au risque de diabète de type 2 (DT2) qui touche 4 millions de personnes en France. Malgré ce succès, la translation de ces découvertes vers des avancées en médecine de précision a été modeste. A contrario, l’investigation génétique des formes monogéniques de diabète a révélé plusieurs régulateurs clefs de la sécrétion d’insuline, conduisant à des cas d’école en médecine génomique de précision. En effet, les patients diabétiques avec une mutation pathogène dans HNF1A sont traités de manière optimale avec des sulfamides hypoglycémiants oraux et les patients porteurs de mutation pathogène dans GCK ne requièrent aucun traitement médicamenteux malgré leur hyperglycémie chronique. La place de ces formes de diabète monogénique dans le DT2 commun est inconnue. Nous avons mesuré la prévalence de mutations pathogènes parmi 33 gènes impliqués dans le diabète monogénique chez des patients avec une forme commune de DT2, comparée à une population contrôle normogycémique. Via un séquençage de nouvelle génération (NGS), les gènes ont été séquencés dans une étude cas-témoins incluant 6 348 individus. Comme le séquençage NGS ciblé de l’ADN ne conduit pas à une couverture parfaite de tous les gènes, nous avons appliqué des contrôles qualité stricts avant les analyses. La pathogénicité des variants a été mesurée via les critères ACMG. Parmi les 6 348 individus, nous avons identifiés 168 mutations pathogènes ou probablement pathogènes, incluant 35% de mutations tronquantes. En utilisant la méthode MiST ajustée à l’âge, au sexe, à l’indice de masse corporelle et à l’ethnie, nous avons identifié une association significative entre les variants pathogènes ou probablement pathogènes et une augmentation du risque de DT2 (p<0.001; avec 5.6% porteurs parmi les cas vs 2.7% porteurs parmi les contrôles). Nous avons trouvé que cette association significative est surtout expliquée par les mutations identifiées dans GCK (p<0.001) et HNF1A (p<0.001) ; c’est-à-dire les gènes les plus fréquemment mutés dans le diabète monogénique. Parmi les patients avec un DT2, nous avons trouvé que les porteurs de mutation pathogène étaient légèrement plus minces avec un diabète diagnostiqué un peu plus précocement, mais les médications anti-diabètiques et l’histoire familiale n’étaient pas différentes entre les porteurs et les non-porteurs. En conclusion, nous avons trouvé une prévalence élevée de mutations pathogènes parmi les gènes du diabète monogénique chez les patients avec un DT2 commun, qui pourtant ne présentaient pas les caractéristiques cliniques d’un diabète monogénique (comme le MODY) et donc qui ne pouvaient pas être identifiés cliniquement avant le criblage génique. Ces résultats ouvrent des perspectives nouvelles vers une médecine personnalisée du diabète commun, plus économe en coûts de santé grâce au criblage génétique peu onéreux (50€) des patients diabétiques nouvellement diagnostiqués.     

Le but de la médecine de précision est l’identification dans le génome tumoral de potentielles cibles de traitement. Au cours de cette analyse, des variants pathogènes dans des gènes connus pour leur implication dans des prédispositions au cancer (VP) peuvent être identifiés. Certains de ces VP sont présents constitutionnellement. Dans les 4 dernières années, des VP de gènes de prédisposition ont été identifiés dans les tumeurs de 19 pts inclus dans des programmes de médecine de précision de notre institution (MOSCATO, MATCHR) (âge médian 52ans [21-72ans] ; 5 cancers pulmonaires, 3 cancers de la prostate, 4 cancers du sein, un cancer de la vessie, un cancer du côlon, un corticosurrénalome, un cancer ORL, un cancer de l’ovaire, un phéochromocytome, une double localisation pancréas/poumon). Les VP concernaient BRCA2 (n=10), BRCA1 (n=5), PALB2 (n=1), MSH2 (n=1), TP53 (n=1), VHL (n=1). Suite à la réunion pluridisciplinaire (RCP) moléculaire, ces pts ont été invités à consulter en oncogénétique, malgré l’absence d’histoire familiale évocatrice de prédisposition pour 17 pts d’entre eux. Douze pts ont été reçus en consultation et ont réalisé un test ciblé. Huit n’ont jamais donné suite, bien que 3 d’entre eux aient été adressés vers un centre d’oncogénétique plus proche de leur lieu de résidence. Parmi les 12 pts testés, 9 étaient porteurs constitutionnels du VP, 3 étaient non porteurs (VHL, BRCA1, BRCA2). Des tests ciblés chez des apparentés ont été réalisés secondairement dans 4 familles et la prise en charge usuelle a été appliquée pour les porteurs.

Ces résultats montrent que l’acceptation d’un test constitutionnel après analyse tumorale est grande, la non-réalisation de la consultation de génétique dans notre série étant souvent en lien avec une altération de l’état général. Les VP tumoraux sont le plus fréquemment constitutionnels (9/12), même si le cancer ne fait pas partie du spectre habituel de la prédisposition. La prise en charge des apparentés porteurs est par ailleurs questionnable. Elle est peut-être excessive dans la mesure où les risques réels sont mal connus et possiblement plus faibles qu’en situation évocatrice de prédisposition.

Cette expérience révèle l’importance d’anticiper l’identification de ces VP lors des analyses tumorales. Dans nos protocoles de recherche en médecine personnalisée, tous les pts consentent initialement à une éventuelle exploration constitutionnelle. Dans tous les autres contextes, il est nécessaire d’avoir des dispositifs d’oncogénétique garantissant un minimum d’information préalable et une prise en charge organisée en aval du test tumoral, intégrant une RCP moléculaire et une consultation de génétique. Il est également indispensable d’améliorer l’évaluation des risques de cancer dans ces situations d’histoire familiale peu évocatrice. La multiplication des portraits moléculaires tumoraux sans cet accompagnement soulèverait une question éthique et de responsabilité vis-à-vis des patients et de leur famille.

Les épimutations représentent un mécanisme alternatif aux mutations génétiques dans l’étiologie de certaines maladies génétiques. C’est le cas dans le syndrome de Lynch, syndrome de prédisposition héréditaire au cancer (principalement du côlon et de l’endomètre) lié à une altération génétique constitutionnelle d’un des gènes codant les protéines impliquées dans la réparation des mésappariements de l’ADN (système MisMatch Repair). Pour quelques patients, l’altération constitutionnelle responsable de la prédisposition aux cancers est épigénétique et correspond à une hyperméthylation du promoteur des gènes MLH1 ou MSH2.

De manière générale, les épimutations, rares et de description plus récente que les altérations génétiques, restent mal connues et mal caractérisées d’un point de vue fonctionnel. Les épimutations peuvent être primaires, correspondant à des événements épigénétiques purs labiles dans les lignées germinales, ou secondaires, associées à une altération génétique en cis transmise à la descendance sur un mode Mendélien. Les épimutations du gène MSH2 sont secondaires. Le mécanisme moléculaire responsable de l’hyperméthylation du promoteur a été bien caractérisé et correspond à une délétion de taille variable de la région 3’ du gène EPCAM, situé en amont du gène MSH2. Les épimutations du gène MLH1 peuvent être primaires ou secondaires. Bien qu’identifiées dès 2002, ces épimutations restent mal caractérisées et semblent beaucoup plus complexes, notamment en raison de la diversité des mécanismes moléculaires impliqués. Seule une soixantaine de patients porteurs d’une épimutation de MLH1 a priori primaire et quelques rares familles avec épimutation secondaire ont été décrits dans la littérature à ce jour.

La recherche d’hyperméthylation constitutionnelle du promoteur du gène MLH1 est réalisée dans notre laboratoire dans le cadre du diagnostic de syndrome de Lynch depuis 2009. L’implication des généticiens, moléculaires et cliniciens, du Groupe Génétique et Cancer (GGC) a permis un recrutement national de patients. Plus d’une trentaine de cas index porteurs d’une épimutation constitutionnelle ont ainsi pu être identifiés à ce jour. Un diagnostic présymptomatique a pu être proposé aux apparentés, et une transmission de l’épimutation sur au moins 2 générations a été mise en évidence dans quelques familles. Les explorations complémentaires, constitutionnelles et tumorales, réalisées chez ces patients permettent d’éclaircir les mécanismes moléculaires conduisant à l’inactivation du gène MLH1. De nouveaux variants génétiques, ségrégeant avec l’hyperméthylation dans les familles, ont notamment pu être identifiés, montrant la grande diversité des variants génétiques responsables d’épimutations secondaires. La première description de l’insertion d’une séquence Alu dans la séquence codante du gène MLH1 a ainsi été faite.

Une revue de la littérature, ainsi que les différents travaux du laboratoire concernant les épimutations du gène MLH1, seront présentés.

Les variations non-sens ainsi que celles localisées au niveau des sites canoniques d’épissage (IVS±1,2) sont généralement considérées, sans ambiguïté, comme des variations perte de fonction et, en conséquence, sont classées pathogènes. Toutefois, certaines d’entre elles sont susceptibles d’induire le saut en phase d’un exon non-essentiel, conduisant potentiellement au moins en partie à une protéine fonctionnelle. Afin de tester cette hypothèse dans le contexte d’un gène de prédisposition au cancer, nous avons utilisé comme modèle d'étude l’exon 12 de BRCA2. En effet, il a été précédemment montré que le saut en phase de cet exon n’entraine pas la perte complète de fonction de la protéine. Dans un premier temps, nous avons sélectionné à partir des bases de données mutationnelles toutes les variations supposées pathogènes localisées dans ou autour l’exon 12 (e.g. variations non-sens, frameshift ou IVS±1/2). L’impact sur l’épissage des 15 variations ainsi sélectionnées a ensuite été évalué dans un test basé sur l’utilisation de minigènes et à partir de lignées lymphoblastoïdes de patients, lorsque ce matériel était disponible. De plus, certaines de ces variations ont fait l’objet d’une analyse dans un essai fonctionnel basé sur l’utilisation de cellules souches embryonnaires de souris. Ces différentes approches complémentaires ont permis de montrer qu’une fraction importante de ces variations, y compris des variations non-sens, (i) induisent un saut en phase de l’exon 12 du fait de la modification des sites d’épissage ou d’éléments de régulation, et, en conséquence, (ii) sont responsables de la production d’une protéine avec une délétion interne mais fonctionnelle, au moins en partie. L’ensemble de ces données montre, pour la première fois dans un gène de prédisposition au cancer, que certaines variations non-sens présumées nulles contournent la perte totale de fonction du fait de leur impact sur l’épissage. Des analyses complémentaires des données cliniques et familiales des patients seront nécessaires afin d’estimer le risque de développer un cancer associé à ce type de variations hypomorphes. Ces travaux soulignent l’importance d’être prudent dans l’interprétation des variations supposées nulles localisées dans des exons en phase ne codant pour aucun domaine fonctionnel essentiel.

Friedreich’s ataxia (FRDA) is a frequent autosomal recessive disease caused by a GAA repeat expansion in the FXN gene encoding frataxin, a mitochondrial protein involved in iron-sulfur clusters (ISC) biogenesis. Frataxin deficiency affects ISC containing proteins, namely respiratory chain complexes I-III as well as aconitases, and causes an iron overload in brain and heart of patients. In these tissues mitochondrial iron-loading results in a progressive ataxia and hypertrophic cardiomyopathy. However, the mechanism of iron accumulation due to frataxin deficiency remains unclear. In this way, we studied the regulation of iron homeostasis in primary fibroblasts from FRDA patients.

We report an abnormal cellular iron homeostasis in FRDA fibroblasts, inducing a massive iron accumulation in the cytosol and to a lesser extent in mitochondria where it’s associated with oxidative stress. The cellular iron uptake involves the internalization of transferrin receptor 1 (TfR1) by receptor-mediating endocytosis, which is dependent to palmitoylation statue of TfR1. Despite a normal post-transcriptional regulation of TfR1, we found that FRDA fibroblasts failed to limit iron uptake by accumulating TfR1 at plasma membrane. We were able to demonstrate that this abnormal iron uptake results in an impaired Coenzyme A pool available causing a severe defect of TfR1 palmitoylation. Finally, we showed that artesunate, an anti-malaria drug, limits iron overload by restoring TfR1 palmitoylation, which controls the iron uptake. These data highlight the critical role of frataxin in iron overload and suggest that artesunate could be a potential candidate molecule for therapeutic trials of Friedreich ataxia.

Les calcifications cérébrales primaires (CCP) sont une entité rare d’expression neuropsychiatrique diverse définie par la présence de calcifications microvasculaires cérébrales. Quatre gènes sont associés à des formes autosomiques dominantes (CCP-AD) : SLC20A2 et XPR1 codent pour des transporteurs de phosphate, PDGFB code pour un facteur de croissance exprimé au niveau de l’unité neurovasculaire et PDGFRB, pour son récepteur principal. Nous avons précédemment montré que les signes cliniques principaux de CCP-AD sont des mouvements anormaux, des troubles cognitifs, et des signes psychiatriques, avec une moindre proportion d’autres anomalies motrices (cérébelleuses, pyramidales). Récemment, des variants du gène MYORG, qui code pour une glycosidase d’expression astrocytaire, ont été rapportés comme causant une forme autosomique récessive de CCP.

Nous avons criblé MYORG par séquençage d’exome chez 29 cas index non apparentés ne présentant pas de variant pathogène de CCP-AD. Nous avons étudié les caractéristiques cliniques et radiologiques des porteurs de variations bi-alléliques pathogènes de MYORG après étude de ségrégation et les avons comparées à celles de 102 patients CCP-AD.

Seize patients de 11 familles présentaient une variation bi-allélique rare ou nouvelle, non synonyme, perte de fonction ou prédite délétère. La pénétrance clinique était élevée (15/16 symptomatiques, âge de la seule porteuse asymptomatique : 28 ans, âge médian de début : 52 ans, intervalle : 21-62 ans) avec une atteinte motrice au premier plan. La dysarthrie était le signe initial chez 11/16 patients. Contrastant avec les patients CCP-AD, 80% des symptomatiques présentaient au moins 4 des 5 symptômes suivants au cours de l’évolution, qui étaient tous significativement enrichis chez les patients MYORG (p < 0.002 chacun) : dysarthrie, syndrome cérébelleux, troubles de l’équilibre, signes pyramidaux, et syndrome akinéto-rigide. Après cotation de chaque scanner par une échelle visuelle validée, le score total de calcifications était le plus élevé chez les patients MYORG (p < 10^-3 contre chaque gène sauf XPR1, p=0.089, modèle de régression binomiale prenant en compte l’âge au scanner). Fait frappant, 13/16 présentaient des calcifications du tronc cérébral en plus de calcifications étendues d'autres régions (noyaux gris centraux, cervelet ± cortex). Parmi eux, 9 présentaient des calcifications pontines, qui n'ont jamais été observées dans les CCP-AD. De plus, tous les patients MYORG présentaient une atrophie cérébelleuse après analyse visuelle, confirmée en IRM par morphométrie voxel-à-voxel en comparaison avec un groupe CCP-AD. Dans 3 familles, le père était porteur de petites calcifications pallido-dentelées, suggérant une expression phénotypique marginale chez certains porteurs hétérozygotes.

Nous confirmons que MYORG est un nouveau gène causal de CCP et identifions un phénotype clinico-radiologique reconnaissable à l'interface entre les CCP et les ataxies spinocérébelleuses.

Un déficit primaire de la chaîne respiratoire mitochondriale est difficile à diagnostiquer chez le fœtus. Certains signes non spécifiques sont rapportés en prénatal comme le retard de croissance intra-utérin (22,6% Von Kleist-Retzow et al, 2003) ou une cardiomyopathie (Von Kleist-Retzow et al, 2003, Schiff et al 2011), mais les anomalies cérébrales et particulièrement les anomalies du corps calleux sont plus rarement décrites. 

Nous rapportons ici 4 familles ayant subi une ou plusieurs interruptions médicales de grossesse devant une anomalie du corps calleux associée ou pas à d’autres anomalies cérébrales ou extra -cérébrales.  Dans 2 familles, l’analyse par séquençage haut débit d’un panel de gènes impliqués dans les anomalies du corps calleux (Callosome) a permis l’identification de nouvelles mutations dans 2 gènes récessifs de maladies mitochondriales précédemment associées à des anomalies du corps calleux (MRPS22 et EARS2). MRPS22code une petite sous unité du ribosome mitochondrial et ses mutations sont responsables d’un déficit multiple de la chaîne respiratoire (COXPD5).  EARS2 code l’ARNt-glutamyl synthétase mitochondriale (mtGluR), et ses mutations sont associées à une leucoencéphalopathie et un déficit combiné de phosphorylation oxydative (COXPD12). Ces cas permettent de décrire pour la première fois le phénotype prénatal associé aux mutations de ces gènes. L’analyse par exome de 2 autres familles avec récidive d’agénésie du corps calleux a permis l’identification de la même mutation à l’état homozygote du gène TIMMDC1. Ces 2 familles étant d’origine portugaise ceci évoque un effet fondateur. Le gène TIMMDC1 code une protéine impliquée dans l’assemblage du complexe I de la chaîne respiratoire. Une seule mutation intronique profonde de ce gène a été rapportée chez plusieurs patients atteints de syndrome de Leigh (Kremer et al., 2017) mais jamais associé à des anomalies calleuses. Les analyses fonctionnelles ont montré un déficit isolé du complexe I de la chaine respiratoire sur tissu musculaire comparé aux contrôles d’âge apparié.

Au total, nous rapportons 9 cas fœtaux de mutations des gènes MRPSS22, EARS2 ou TIMMDC1 permettant de décrire le phénotype anténatal des cytopathies mitochondriales, et d’améliorer le diagnostic et le conseil génétique des anomalies du corps calleux.

Les mutations dans les gènes codant pour les composants de la machinerie de réplication de l'ADN mitochondrial (ADNmt) provoquent des syndromes de déplétion de l'ADNmt (MDS), qui associent des atteintes oculaires à des syndromes neurologiques graves. Nous avons identifié des mutations faux-sens hétérozygotes dans le gène SSBP1, dans cinq familles non apparentées. Elles conduisent aux modifications des acides aminés R38Q et R107Q dans la protéine de liaison à l'ADN simple brin, protéine majeure de la réplication de l'ADNmt. Tous les individus atteints présentent une atrophie optique, associée à une fovéopathie dans la moitié des cas. Pour identifier les caractéristiques structurelles sous-jacentes aux mutations SSBP1, nous avons déterminé une nouvelle structure cristalline révisée de SSBP1. L'analyse structurelle suggère que les deux mutations affectent les interactions des dimères et faussent vraisemblablement la région de liaison à l'ADNmt. En utilisant des fibroblastes de patients, nous avons validé que le variant R38Q déstabilise la formation de dimères / tétramères SSBP1, affecte la réplication de l’ADNmt et induit une déplétion de ce génome. Notre étude montre que les mutations de SSBP1 sont à l’origine d’une nouvelle forme d’atrophie optique dominante fréquemment accompagnée de fovéopathie et apporte de nouvelles informations sur les anomalies du maintien de l’ADNmt.

Le syndrome POIKTMP [MIM 615704] est une entité rare, décrite en 2013 par notre équipe, liée à des variants dans le gène FAM111B (NM_198947.3) de fonction jusqu’alors inconnue. Elle est caractérisée principalement par (i) une atteinte dermatologique : poïkilodermie précoce, hypotrichose et hypohidrose, (ii) une myopathie rétractile, (iii) une atteinte pulmonaire : syndrome restrictif, fibrose pulmonaire, (iv) une atteinte pancréatique : insuffisance exocrine, prédisposition à l’adénocarcinome. L’examen histologique montre une atrophie musculaire avec infiltration graisseuse, sans plage de nécrose et un aspect sclérodermiforme de la peau. A ce jour, les 7 variants faux-sens pathogènes identifiés dans 14 familles (30 cas rapportés dont 10 cas sporadiques) sont localisés dans le domaine trypsine-like cystéine/serine peptidase de la protéine. Un mécanisme de gain de fonction ou de variation dominante négative induisant un changement de l’activité catalytique de FAM111B a été proposé.

Pour explorer l’impact fonctionnel des variants décrits, une analyse transcriptomique par RNA-seq a été réalisée à partir de fibroblastes de deux patients. Du fait d’un chevauchement phénotypique entre le syndrome de Rothmund Thompson (causé par des variations dans le gène RECQL4) et le syndrome POIKTMP, notre attention s’est d’abord portée sur les partenaires protéiques significativement sur- ou sous-régulés (p-value ajustée < 0.05) de FAM111B et RECQL4. Parmi ces partenaires, nous avons identifié un réseau moléculaire de 61 protéines toutes sur-régulées et impliquées dans les voies métaboliques de prolifération cellulaire ou de contrôle du cycle cellulaire, ce qui est concordant avec  (i) la forte expression de FAM111B en phase S du cycle cellulaire, et (ii) le caractère oncogène potentiel de FAM111B, cible directe de P53, qui ont été récemment décrits. Ces voies sont en cours d’étude sur cellules souches de patients de type iPSC (induced Pluripotent Stem Cells) permettant le monitorage in vitro de leur comportement. D’autre part, des analyses protéomiques haut débit sont en cours afin de confirmer les résultats obtenus par l’analyse RNA-seq et déterminer si un marqueur diagnostic de la maladie peut être identifié. En parallèle, des études sur modèle animal ont été menées en injectant le transcrit humain muté de FAM111B dans des embryons de poisson-zèbre et chez des souris Rag2-/- Il2rb-/-. Malgré l’absence d’orthologue dans ces deux espèces, nous avons observé une réduction du calibre de la fibre musculaire chez le poisson-zèbre et des signes majeurs de régénération musculaire à 1 mois et 3 mois post-injection dans le tibial antérieur chez la souris.

Finalement, ces données nous confortent vers un rôle essentiel de FAM111B au cours du cycle cellulaire et d’un gain de fonction dans le syndrome POIKTMP. Des pistes thérapeutiques sont envisagées notamment l’association aspirine-metformine qui pourrait réduire l’expression de FAM111B et améliorer le phénotype des patients.

Joint contractures are recurrent and sometimes prominent features in neuromuscular disorder, most notably in extracellular matrix (ECM)-related myopathies, such as COL6-related muscle disorders. Here, we report a patient with an atypical clinical presentation of congenital arthrogryposis, associated with distal hyperlaxity, proximal muscle deficit, lack of facial expression, dysphonia, dysphagia, oculo-motor anomalies, dorsal kyphosis, lordosis and preserved respiratory function. Immunostaining of skin-derived fibroblasts demonstrated a subtle impairment of COLVI secretion, with no mutation in the COL6A1-3 genes identified. Accordingly, whole body MRI was performed at 15, 21 and 24 years of age and remained quite normal without any COL6-RD-compatible pattern. Using whole-exome sequencing analysis, we ruled out the implication of any known myopathy-associated gene. Interestingly, we identified compound heterozygous missense variants (c.1747 C > T; p.Arg583Cys and c.1789 C > T; p.Arg597Cys) in the LOXL4 gene encoding lysyl oxidase-like 4.

LOXL4 is a member of the LOX protein family, which are secreted copper-dependent amine oxidases that catalyse collagen and elastin cross-linking. Together with collagens, LOXs proteins participate in ECM synthesis and maintenance in a tissue-specific manner. Both rare variants identified alter residues of the highly conserved LOX catalytic domain and are predicted as deleterious. Additionally, transient expression of each variant in cell lines and human primary fibroblasts, impeded LOXL4 secretion into the medium. Furthermore, our data suggest that variant-derived protein accumulation in the cytoplasm could trigger the unfolded protein response, likely through IRE1/PERK pathways. Taken together, our results provide reasonable evidence toward the pathogenicity of these variants as a direct cause of genetic connective tissue disorder.

Glycogen synthesis and breakdown are regulated by a subset of enzymes, and impaired enzymatic reactions in the cytosol or in the lysosomes result in severe disorders referred to as glycogen storage diseases (GSD). All previously described human GSDs segregate as recessive or X-linked traits. Here we describe a GSD family with thirteen affected members and a dominant disease transmission over four generations. The affected individuals presented with adult-onset proximal muscle weakness, and the biopsies showed fiber size variability, vacuoles, and especially glycogen accumulations. Exome sequencing uncovered the heterozygous c.1915G > C (p.Asp639His) mutation in PYGM, encoding myophosphorylase. Recessive PYGM mutations leading to myophosphorylase deficiency cause McArdle disease, the most common GSD. However, western blot revealed comparable myophosphorylase levels in muscles from our patients and from control, demonstrating that the p.Asp639His mutation does not interfere with mRNA or protein stability and consequently involves a different pathomechanism than McArdle disease. Myophosphorylase immunolocalization on muscle sections from our patients uncovered aggregations of myophosphorylase and sequestration of desmin within the myofibers. To investigate the functional impact of the p.Asp639His mutation, we produced recombinant WT and mutant myophosphorylase. Sedimentation velocity experiments demonstrated an increased propensity of mutant myophosphorylase to form higher-order polymers, highlighted a disparity in the tetrameric forms of WT and mutant myophosphorylase, and enzymatic tests revealed an impaired activity of the p.Asp639His myophosphorylase. Overall, the dominant PYGM mutation involves a different pathomechanism than McArdle disease and defines a novel class of GSDs.

Le déficit en transporteur du glucose GLUT1 (GLUT1-DS) est responsable d’une carence énergétique cérébrale due à une altération du transport du glucose dans le cerveau. GLUT1-DS se manifeste par un large spectre de symptômes neurologiques dont une déficience intellectuelle, une épilepsie et des troubles moteurs permanents et/ou paroxystiques. Le diagnostic repose sur une ponction lombaire (hypoglycorrachie) et la présence d’un variant (souvent faux-sens de novo) du gène SLC2A1. Le diagnostic est d’autant important que GLUT1-DS est traitable. Classiquement, le régime cétogène permet un bon contrôle des crises d’épilepsie et dans une moindre mesure des mouvements anormaux.

Du fait de nombreuses formes atypiques de la maladie (épilepsie ou déficience ou mouvement anormal isolé), du caractère invasif de la ponction lombaire, et de l’interprétation parfois difficile des variants SLC2A1, nous avons développé un test sanguin (MetaGlut) non invasif, simple et rapide, permettant de détecter la quantité de protéine Glut1 à la surface des érythrocytes. Dans une première étude chez 30 patients GLUT1-DS, nous avons montré que 23 patients (78%) étaient détectés par le test MetaGlut (Gras et al, Ann Neurol 2017). Nous présentons ici les résultats de la performance du test MetaGlut dans une nouvelle cohorte de 48 patients GLUT1-DS : 42 patients (87,5%) sont détectés, dont 4 patients avec une analyse génétique non contributive.

Compte tenu des difficultés d’observance du régime cétogène au long cours, en particulier chez les adolescents et les adultes, nous avons testé l’efficacité d’une intervention thérapeutique par la triheptanoïne. Il s’agit d’un triglycéride à chaine moyenne mais nombre impair de carbones, apportant à la fois de l’acetyl-CoA mais également du propionyl-CoA au cycle de Krebs. Dans une première étude chez des patients GLUT1-DS présentant des mouvements anormaux paroxystiques après échec ou refus du régime cétogène, nous avons observé une diminution de 90% des épisodes paroxystiques après 2 mois de traitement par triheptanoïne (Mochel et al, J Neurol Neurosurg Psychiatry 2016). Nous présentons ici l’évolution à long terme de ces patients traités depuis plus de trois ans par triheptanoïne avec une réponse thérapeutique de 97% sur les épisodes paroxystiques. Nous présentons également une série de 4 patients GLUT1-DS, traités par régime cétogène mais présentant des manifestations paroxystiques résiduelles, chez qui le régime cétogène a été progressivement arrêté et remplacé par le triheptanoïne. Chez 3 patients, la transition a été possible et a permis un meilleur contrôle des mouvements anormaux paroxystiques. 

En conclusion, nous proposons de réaliser un test MetaGlut chez tout patient présentant une déficience intellectuelle, une épilepsie, un syndrome cérébelleux, une dystonie et/ou des mouvements anormaux paroxystiques. La triheptanoïne est par ailleurs une alternative thérapeutique au régime cétogène chez les patients GLUT1-DS.

Le diagnostic de la déficience intellectuelle (DI) reposait jusqu’à récemment sur l’expertise clinique, l’analyse chromosomique sur puce à ADN (ACPA), la recherche du syndrome X-fragile (FRAXA) et l’étude de gènes ciblés. Si l’expertise clinique ne permet pas de cibler l’étude de gènes en particulier, ces différents outils aboutissent à un diagnostic chez seulement 20% des patients sans diagnostic clinique, au prix parfois de nombreux examens biologiques coûteux. La génétique médicale connaît actuellement un véritable bouleversement technologique par le développement du séquençage haut débit (SHD), permettant l’analyse de panels de gènes ciblés et d’exome (ES).

Le PRME DISSEQ a pour objectif d’évaluer l’efficience de différentes stratégies de SHD dans le diagnostic des patients atteints de DI à partir d’une cohorte de 330 patients (205 hommes/127 femmes) et sans investigation génétique antérieure. Trois stratégies sont été réalisées en parallèle à l’aveugle: stratégie classique (ACPA+FRAXA+séquençage de gènes ciblés), stratégie 1 (ACPA+FRAXA+panel DI459 solo) et stratégie 2 (FRAXA+ES solo).

A ce jour, environ un tiers de la cohorte a été analysée. Parmi les 39 résultats positifs (15 CNV, 25 SNV, 1 FRAXA dont 3 double hits), 16 ont été diagnostiqués par la stratégie classique (41%), 34 par la stratégie 1 (87%) et 35 par la stratégie 2 (90%) ; 35 présentaient une variation sporadique, 3 une variation héritée d’un parent, 3 des variations bialléliques et 1 un FRAXA. Seuls 30/41 variations causales (73%) ont été identifiés par la stratégie 1 (FRAXA+ACPA+panel DI459) et la stratégie 2 (FRAXA+ES), soit un taux de discordance de 27% : 5/11 retenus uniquement par la stratégie 2 car le gène causal est absent du panel, et 6/11 retenus uniquement par la stratégie 1 par discordance d’interprétation. Ces discordances étaient principalement liées à une présentation clinique atypique. Par ailleurs, la stratégie 2 a permis d’identifier des variations dans de nouveaux gènes candidats chez 3 patients.

Ces premiers résultats (ensemble des résultats disponible en fin d’année 2019) montrent que les discordances entre le panel et l’ES sont dues à l’absence des gènes causaux dans le panel et à une discordance d’interprétation dans des phénotypes atypiques pour l’ES, mais non par défaut de couverture de l’ES. Ceci conforte l’importance d’une double interprétation. Le panel ne permet pas d’identifier les variations des gènes récemment associés à la DI et montre également des limites pour identifier les CNVs, devant ainsi être couplé à l’ACPA. A l’inverse, l’ES semble efficace pour identifier SNVs et CNVs y compris dans les gènes récemment associés à la DI et dans des nouveaux gènes candidats. Cependant, le grand nombre de données disponibles pour l’ES peut conduire à un défaut d’interprétation des variations. L’approche de séquençage en trio pourrait limiter la non considération de certaines variations dans des gènes connus, non retenues du fait de phénotypes atypiques.

Les variants de gènes responsables de régulation transcriptionnelle sont des contributeurs majeurs aux pathologies neurodéveloppementales. Le complexe Sin3 assure un rôle central dans la désacétylation des histones et la répression transcriptionnelle, par modulation de l’activité de l’HDAC 1/2. Parmi les deux paralogues vertébrés du complexe Sin3, SIN3A et SIN3B, le gène SIN3A est connu pour être responsable de déficience intellectuelle syndromique. Les conséquences cliniques de l’haploinsuffisance de SIN3B n’ont pas été caractérisées à ce jour. Nous décrivons une nouvelle entité associant une déficience intellectuelle, des anomalies morphologiques, ainsi que de façon variable des troubles du spectre autistique, malformations congénitales, et anomalies du corps calleux. Un des patients est également atteint d’autisme isolé. En utilisant les techniques d’analyse chromosomique par puce à ADN ou de séquençage d’exome, et à travers la mise en commun de données lors de collaborations internationales, nous avons identifié chez neuf patients des délétions ou variants nucléotidiques hétérozygotes de SIN3B. Cinq patients sont porteurs de délétions hétérozygotes incluant SIN3B, ayant permis de définir une région minimale d’intérêt de 230 kb en 19p13.11, deux individus ont une substitution non synonyme rare et deux individus une délétion d’un nucléotide à l’origine d’un décalage du cadre de lecture et d’un codon stop. Afin de caractériser in vivo les conséquences de l’ablation de SIN3B et confirmer la pathogénicité des variants non synonymes, nous avons inactivé l’orthologue du gène chez le poisson zèbre par édition génomique et suppression transitoire. Nous montrons chez les larves, après inactivation, une perturbation de l’architecture cranio‑faciale et des anomalies des axones commissuraux, soutenant l’hypothèse d’un rôle essentiel de SIN3B dans la croissance et la formation des structures antérieures. L’absence de restauration du phénotype associé à l’inactivation transitoire lors de l’injection d’ARNm variant nous permet de classer les deux variants non synonymes identifiés comme perte de fonction. Enfin, afin de préciser les conséquences moléculaires des variants de SIN3B, nous avons quantifié les activités des éléments cis‑régulateurs par Chip‑seq. Les profils d’acétylation obtenus sont similaires à ceux mis en évidence en cas d’haploinsuffisance de SIN3A : l’inactivation de SIN3B est associée à l’hyperacétylation d’une fraction de régions régulatrices dans les cellules mononuclées sanguines. En conclusion, nos résultats confirment le rôle crucial du complexe Sin3 dans le développement du système nerveux central et définissent le paysage épigénétique associé à la perturbation de son fonctionnement. Nous démontrons ainsi que l’haploinsuffisance de SIN3B est responsable chez l’Homme de déficience intellectuelle syndromique et/ou d’autisme.

Contexte : La dégradation des protéines par le protéasome est essentielle à la protéostase des cellules eucaryotes. La rareté des variants pathogènes présents dans la cinquantaine de gènes directement impliqués dans la fonction protéasomale suggère qu’ils exercent une pression de sélection négative en compromettant la viabilité cellulaire. Par contraste avec les maladies auto-inflammatoires récessives induites par des altérations de la particule catalytique 20S du protéasome 26S, nous avons récemment décrit une pathologie neurodéveloppementale, le syndrome Stankiewicz-Isidor (MIM : 617516), causée par des variants de novo de PSMD12, gène de la sous-unité Rpn5 de la particule régulatrice 19S.

Méthodes : Grâce à une collaboration internationale nous avons recruté 21 individus atteints d’un retard du développement et porteurs de 19 variants probablement pathogènes dans deux autres gènes de la particule régulatrice 19S, PSMC3 et PSMC5. Ces derniers codent pour des ATPases impliquées dans le dépliage et la translocation du substrat à dégrader vers le cœur protéolytique de la particule 20S. A partir de lymphocytes T d’individus atteints, nous avons évalué l'effet fonctionnel des variants sur l'activité du protéasome 26S et examiné leur impact possible sur les principales voies du neurodéveloppement. Nous avons enfin eu recours à des modèles in vivo murins et de drosophiles pour étudier leurs conséquences sur la fonction neuronale et le comportement.

Résultats : Les 19 variants candidats identifiés chez 21 individus non apparentés se distribuent en : 5 variants de novo dans PSMC3 chez 6 individus et 14 variants (13 de novo, un homozygote) dans PSMC5 chez 15 individus. La majorité des variants est localisée dans le domaine ATPase des deux sous-unités. Les individus porteurs d’un variant dans PSMC3 présentent un retard de développement et des anomalies fréquentes à l'IRM cérébrale ?, ainsi que des anomalies cardiaques et/ou squelettiques, alors que les individus porteurs d’un variant dans PSMC5 présentent majoritairement une déficience intellectuelle et des troubles du comportement. Nous avons observé une altération de la fonction du protéasome caractérisée par une diminution significative de son activité de type chymotrypsine, ainsi que par une accumulation de conjugués d'ubiquitine, une activation de la réponse réponse UPR (unfolded protein response) et une altération de l'activité mTOR.

Conclusion : Ces résultats nous permettent d’élargir la liste des gènes codant pour des sous-unités de la particule protéasomique 19S responsables de troubles du neurodéveloppement. Les altérations des gènes PSMC3 et PSMC5 perturbent les systèmes de dégradation des protéines ainsi que la voie mTOR. Des analyses protéomiques et l’examen de modèle animaux sont en cours et devraient nous permettre d'approfondir nos connaissances sur cette catégorie, de description très récente et en plein évolution, de protéasomopathies neurodéveloppementales.

Le syndrome MEHMO (acronyme pour Mental deficiency with epileptic seizures, hypogonadism and hypogenitalism, microcephaly and obesity) est une forme rare de déficience intellectuelle syndromique liée au chromosome X, causée par des mutations hémizygotes dans le gène EIF2S3. Ce gène code pour la sous-unité γ du complexe trimérique eIF2 qui joue un rôle primordial dans l’initiation de la synthèse protéique. Une mutation récurrente dans le gène EIF2S3 (p.Ile465Serfs*4) entrainant un décalage du cadre de lecture a été identifiée chez des patients sévèrement atteints tandis que les quelques mutations faux-sens rapportées sont plutôt responsables d’un phénotype incomplet de déficience intellectuelle, microcéphalie, retard de croissance et épilepsie. Nous avons identifié une nouvelle mutation faux sens (c.433A > G, p.Met145Val) à l’état hémizygote chez un sujet masculin présentant une déficience intellectuelle légère, microcéphalie et cryptorchidie. Nous avons choisi le poisson-zèbre comme modèle in vivo vertébré pour confirmer la pathogénicité de cette mutation ainsi que de trois autres mutations faux sens décrites dans la littérature. En effet, l’inactivation transitoire du gène eif2s3 orthologue du poisson-zèbre par injection d’oligonucléotides (morpholinos) entrainait un phénotype de microcéphalie partiellement compensé par la co-injection d’ARN humain EIF2S3 sauvage, et non par celle d’ARN muté. La réalisation de différentes lignées mutantes stables par la technique de CRISPR/Cas9 a  complété ces premières expériences et a permis la reproduction de la microcéphalie chez le poisson-zèbre. Des études d’immunofluorescence et d’apoptose au départ de ces différentes lignées ont montré que ce déficit était dû, en partie du moins, à une augmentation de la mort de cellules neuronales à un stade précoce du développement. Au niveau pancréatique, des études d’immunofluorescence et d’hybridation in situ ont révélé une diminution du nombre tant des celles beta sécrétrices d’insuline que des progéniteurs pancréatiques, non liée à de l’apoptose. Enfin, des études complémentaires au départ de cultures fibroblastiques de patients avec mutation faux sens ont montré la présence de la proteine  eIF2γ mais aucune apoptose n’a été mise en évidence, ni en condition de base, ni après utilisation d’inducteurs d’apoptose. En conclusion, nous confirmons l’élargissement du spectre phénotypique chez les patients avec mutation faux sens dans le gène EIF2S3 et nous suggérons que le syndrome MEHMO soit spécifiquement lié à une mutation récurrente (p.Ile465Serfs*4) dans ce gène. Nous décrivons un modèle poisson-zèbre robuste qui récapitule le phénotype humain observé. Outre l’apoptose retrouvée de façon inconstante dans nos expériences, nos études fonctionnelles sur poisson zèbre et sur cultures fibroblastiques amènent de nouvelles perspectives physiopathologiques et suggèrent des défauts précoces de différenciation cellulaire.

Introduction: We analyzed the largest group to date of individuals from France with neurodevelopmental disorders (NDD) coming from four hospitals of AP-HP, France (Robert Debré, Trousseau, La Pitié Salpétrière, Jean Verdier). The data from 8,300 patients, 2,000 relatives and 2,955 controls were collected from two Illumina SNP array platforms over 5 years (2013-2017). Patients were grouped according to the biomedicine agency categories: syndromic intellectual disability (S-ID; N=3047), multiple congenital anomalies (N=1025), isolated ID (N=1058), autism (N= 1864) and other (N=1742). The CNVs were called using QuantiSNP and PennCNV and then compared to CNV partition, the algorithm used for diagnosis. Genotyping data were also used to estimate the ancestry and to compute the inbreeding coefficient as well as the polygenic score for different traits such as autism and intelligence.

Results: The analysis of this large sample of patients with NDD revealed several important results: First, QuantiSNP and PennCNV outperform CNV partition for the detection of CNVs. The new algorithms could increase the yield of genetic diagnosis (e.g. three patients with SHANK3 deletions were identified). Second, patients with S-ID, ID or autism had a higher burden of CNV affecting genes associated with NDD/autism or expressed in the brain or intolerant for deleterious mutation (pLI > 0.9) compared to controls. Interestingly patients with autism had also higher polygenic scores for autism compared to controls (p < 10^-22) or other diagnostic categories (p < 10^-3), confirming the strong polygenic contribution to autism. Third, we could find that a high level of inbreeding was a risk for S-ID and ID, but not for autism. Finally, the role of several genes will be discussed such as TRPM1, SHANK3, PTGER3, OTUD7A, MTMR10, PTGER3, SDHA, PIGW, HNF1B, GGNBP2, CCDC127, ACACA, KLF13, VPS37D, SPNS1, RIMBP3, BAZ1B and ATXN2L. These genes might be important to understand the shared and specific mechanisms leading to different clinical trajectories.

Conclusion: Our large-scale French study of NDD, combining new genetic approaches, provides a better yield of genetic diagnostic for NDD. It results from the collaboration between clinicians and quantitative geneticists through data sharing, standardization and multi-level analyses. In order to go further, more data such as whole genome sequencing and standardized clinical data from deep phenotyping will be necessary to provide better diagnostic and prognostic insight. We also observed a very high degree of heterogeneity in the ancestry of the population, which will require match ancestry controls in order to provide diagnostic to all individuals attending to the hospital in France, not only those from European descents for which we have control data.

Le TSA (Trouble du Spectre de l’Autisme) est caractérisé par l’apparition précoce de difficultés persistantes dans les interactions sociales associées à un caractère restreint des activités. Le déterminisme génétique du TSA est complexe, incluant de nombreux facteurs génétiques. Ces dernières années, un très important effort de recherche a permis l’identification de plusieurs centaines de facteurs de risque génétique dans le TSA, répartis en 3 grandes catégories : (1) gènes responsables de troubles neurodéveloppementaux monogéniques dont l’autisme est l’une des manifestations possibles, (2) CNVs récurrents associés à l’autisme dans des études cas/témoins et (3) gènes présentant un excès de mutations tronquantes de novo dans les études de trios. Il importe maintenant de retranscrire ces avancées sur le rôle des variants rares de fort impact en des termes directement utilisables par les cliniciens à l’issue de la consultation de génétique recommandée par la HAS pour tout patient avec TSA.  Pour cela, nous avons établi des critères stricts pour la classification des gènes à risque ainsi que pour l’interprétation des variants et conduit une étude pilote sur 253 patients adressés à notre consultation suite à un diagnostic établi par notre centre de ressources autisme.

Nous avons séquencé l’exome de ces patients, dont 68 présentaient une déficience intellectuelle comorbide et 90 avaient reçu un diagnostic de syndrome d’Asperger. Notre pipeline bio-informatique a permis la détection des variants nucléotidiques et des variations du nombre de copies (copy-number variation, CNV). Nous avons utilisé des critères stringents pour la conception d’une liste de 217 gènes associés au TSA de façon certaine ou probable et classé ces gènes dans l’une au moins des trois catégories précédemment décrites. Pour les variants retenus, la transmission a été obtenue par séquençage Sanger des parents.

Nous avons détecté un variant génétique conférant un risque de TSA chez 19,7% des patients (IC95% : [15%-25,2%]), dont 18 sont des CNVs (7,1% [4,3%-11%]) et 32 des variants nucléotidiques (12,6% [8,8%-17,4%]). Lorsque l’échantillon a été séparé en sous-groupes cliniques, les patients avec déficience intellectuelle présentaient le taux de détection de variants pathogènes le plus élevé (30,1% [20,2%-43,2%]). Le groupe de gènes présentant un excès de variations de novo tronquantes (n= 81) est le plus fort contributeur de variants à risque chez nos patients. Les récentes grandes études de trio ayant permis leur découverte ont donc un impact majeur pour le diagnostic étiologique du TSA.

Dans la mesure où il n’y a pas actuellement de preuve d’une implication nécessaire et suffisante de ces gènes dans le TSA, nous recommandons d’éviter le terme « gènes/variants causaux de TSA » lors du rendu diagnostique et de préférer le terme « facteur de risque génétique de TSA ». Les implications de ces résultats en terme de conseil génétique seront discutées.

L'essor des analyses pangénomiques a permis de découvrir des réarrangements complexes résultant d'événements catastrophiques appelés chromoanagenesis. Bien que fréquents dans certaines tumeurs, ces remaniements sont encore exceptionnels dans des échantillons constitutionnels. Nous avons regroupé 20 cas de la littérature avec 20 nouveaux cas pour identifier les mécanismes biologiques sous-jacents. Notre analyse confirme le regroupement quasi exclusif des points de cassure sur un seul chromosome dans une majorité de cas. Si nous distinguons 3 types principaux de remaniements proches des définitions existantes de la littérature de chromothripsis, chromoplexie, chromoanasynthesis, ces derniers présentent des caractéristiques encore non décrites. Il existe, par exemple, une forte tendance des gains du nombre de copies apparus à être regroupés et insérés ensemble.

Dans un second temps, nous avons étudié la distribution des 1034 points de cassure de ces 40 remaniements, celle des chromoanagenesis tumoraux (n = 13,310 points de cassure) et celle des remaniements simples (n = 468 points de cassure) et l’avons comparé à une répartition aléatoire (hypothèse nulle). Pour les 3 groupes de points de cassure (chromoanagenesis constitutionnels, tumoraux et remaniements simples), nous observons un enrichissement des points de cassure dans les régions se répliquant tardivement au cours du cycle cellulaire. La distribution des points de cassure des remaniements complexes apparaît proche d’une répartition aléatoire (hypothèse nulle) s’agissant des autres critères analysés (Topologically-Associated Domains (TADs), Lamina-Associated Domains (LADs), éléments répétés, marquage en bandes G, compartiment A/B, distance aux origines de réplication, sites de fragilité chromosomique). En revanche, pour les remaniements simples, il existe une déplétion significative en points de cassure dans les LADs. Ce dernier résultat infirme l’hypothèse d’un continuum entre remaniements simples et complexes.

La probabilité accrue de cassure dans les régions à réplication tardive appuie l’hypothèse d’une condensation prématurée d’un chromosome dans un micronoyau. Cette séquestration explique le regroupement des cassures sur un seul chromosome et est le lieu d’une réplication retardée.  La condensation hâtive entraîne le décrochage des fourches de réplication encore actives dans les régions les plus en retard. Si les fourches raccrochent d’autres fragments d’ADN, le chromosome reconstruit portera des cicatrices de ces mécanismes réplicatifs. Si les fourches se décrochent complètement et font apparaître de véritables cassures double brin, les fragments seront raboutés le mieux possible.

Nos résultats suggèrent une origine commune des remaniements complexes.

Le séquençage de l’exome pour le diagnostic de la déficience intellectuelle (DI) se généralise et le plan « France médecine génomique 2025» promet un accès à court terme au séquençage du génome entier. L’apport du génome reste cependant peu étudié par rapport à l’exome dans cette indication. Dans un cadre de recherche, nous avons obtenu un financement par la Fondation Maladies Rares permettant le séquençage du génome en trio de 20 patients présentant une DI modérée à sévère, souvent syndromique. Ils ont été recrutés après une analyse non concluante par exome trio au sein de l’étude HUGODIMS (recrutement du centre de référence CLAD-Ouest). Les SNVs et INDELs ont été analysés avec GATK, les variants structuraux (SVs) avec MANTA, qui utilise les informations portées par les « split-reads » et « paired-reads » pour la détection de tous les types de SV, et les CNVs avec cn.MOPS (intervalles de 500pb).

L’analyse des variants dans la séquence codante a identifié (1) deux patients avec des variants faux-sens de novo dans le gène H3F3A, un gène en cours de publication, dans un exon non couvert par exome, (2) un variant faux-sens de novo dans le gène TFE3, récemment publié, et (3) un variant stop pathogène dans un gène en cours de publication hérité d’une mère hétérozygote et asymptomatique. L’analyse des SVs par MANTA a montré : (1) une translocation t(1;6)(p21.1;q21) équilibrée de novo avec des points de cassure intergéniques, (2) une inversion de novo de 2,1Mb impliquant le gène FOXP1, (3) une inversion de 65Mb de novo sur le bras long du chromosome 5 avec des points de cassures intergéniques, et (4) une délétion de 1,8kb de novo emportant un exon du gène CXorf56 sur le chromosome X chez une fille. L’analyse complémentaire des CNVs par cn.MOPS a mis en évidence une délétion de 22kb à l’état homozygote dans le gène RSPRY1, qui n’a pas été identifiée par MANTA à cause d’un mauvais alignement au niveau des points de cassures. L’étude des variants dans une hypothèse autosomique récessive a mis en évidence deux variants pathogènes dans le gène HACE1 et trois potentiels nouveaux gènes de DI, dont INTS11 pour lequel une cohorte de patients est en cours de constitution.

Au total, les résultats préliminaires de cette cohorte encore en cours d’analyse montrent qu’un diagnostic probable peut être établi chez 10/20 patients, comprenant 5 SVs dont 2 visibles par une analyse du caryotype. De nouveaux gènes candidats ont pu être identifiés en récessif, un mode de transmission qui est peut-être sous-estimé par les études en trio. A noter que chez un patient sans candidat, un variant pathogène dans NIPBL a été identifié en mosaïque à 11% dans la salive suite à une analyse par panel après réévaluation du phénotype. Bien qu’aucun évènement susceptible d’être pathogène dans les régions non-codantes n’ait été identifié pour le moment, le génome en trio présente un rendement supérieur à l’exome grâce à la détection des SVs et une meilleure couverture des régions codantes.

Les syndromes « dyplasie acromandibulaire » (MAD) connus sont dus principalement à des mutations récessives des gènes LMNA, ZMPSTE24 ou BANF1 et font partie du spectre phénotypique des laminopathie progéroides. Ils sont caractérisés par des anomalies majeures de la morphologie et des fonctions nucléaires.

Nous rapportons l’identification de quatre mutations nulles homozygotes différentes du gène MTX2, codant pour la METAXINE-2, chez six enfants atteint d’une dysplasie acromandibulaire sévère, appelée MADaM syndrome (Mandibuloacral Dysplasia associated to MTX2).

La METAXINE-2 est une protéine ubiquitaire de la membrane mitochondriale externe (MME) impliquée dans l’import de protéines à topologie complexe dans la MME et dans l’induction de l’apoptose en réponse au TNF-alpha. Ces patients, issus de familles consanguines d’origines géographiques différentes, présentent une atteinte clinique homogène et très proche  des laminopathies progéroides comme les MAD ou la Progeria de Hutchinson-Gilford (HGPS), incluant un retard de croissance post-natal, une lipodystrophie, une dysmorphie faciale typique avec micrognathie, des oreilles larges bas implantées, une accumulation de tissu adipeux au niveau des joues, un nez fin et long, des résorptions osseuses distales, des calcifications artérielles, une hypertension extrêmement sévère et une glomérulosclérose.

Les western blots réalisés sur les fibroblastes de deux patients ont montré l’absence totale de la protéine METAXINE-2, accompagnée par l’absence de son partenaire METAXINE-1, également localisé dans la MME.

Les fibroblastes présentaient par ailleurs une fragmentation majeure du réseau mitochondrial, probablement due à une augmentation des processus de fission mitochondriale, une réduction de composants de la chaine respiratoire similaire à celle observée dans le HGPS et une réduction des capacités de phosphorylation oxydative. De plus, les fibroblastes des patients résistaient à l’induction de l’apoptose par le TNF-alpha ou la staurosporine, conduisant, comme probables voies alternatives visant à « neutraliser » les cellules altérées dans l’organisme, à une augmentation de la senescence, de la mitophagie et des temps de dédoublement cellulaire. De façon intéressante, des anomalies morphologiques nucléaires majeures ont été observées à la fois dans les fibroblastes des patients déplétés en METAXINE-2 et chez C. elegans sous-exprimant l’orthologue mtx-2 par siRNA. Nous rapportons donc l’identification du syndrome MADaM, révélant une relation inattendue entre la composition / fonction mitochondriale et la morphologie nucléaire, établissant un lien physiopathologique avec les laminopathies progéroides connues et sous-tendant probablement les caractéristiques cliniques communes observées. Ces travaux sont en cours de peer-review dans Nature Communications.

L’avènement des techniques de séquençage haut débit (SHD) a permis d’augmenter rapidement le rendement diagnostique chez les patients porteurs d’anomalies du développement (AD) avec ou sans déficience intellectuelle (DI), de réduire l’errance diagnostique, d’étendre le phénotype de pathologies déjà connues, de rapporter de nombreux nouveaux gènes responsables d’AD avec ou sans DI associée. Parallèlement, le taux diagnostique de pathologies ultra-rares (prévalence: p < 1/50.000) a lui aussi augmenté. Parmi ces dernières, la proportion de pathologies de description récente avec peu de recul sur l’évolution et avec de petites cohortes descriptives apparaît importante. Méthodes: nous avons repris 334 résultats de SHD d’exome réalisés dans le cadre diagnostique chez des patients porteurs d’AD avec ou sans DI sans orientation clinique précise entre 2017 et 2018 par le laboratoire de génétique moléculaire et de génomique du CHU de Rennes et nous avons recherché les diagnostics qui relevaient des pathologies ultra-rares ainsi que les sources d’information disponibles pour ces patients. Les échantillons d’ADN ont été analysés selon les étapes suivantes: enrichissement par capture de séquence SureSelect XT Focused Exome (Agilent Technologies), séquençage haut débit sur plateforme HiSeq ou NextSeq (Illumina), analyse bio-informatique et interprétation réalisées avec les outils développés au laboratoire, incluant les logiciels BWA MEM pour l’alignement (hg19), GATK et FreeBayes pour le «variant calling», ANNOVAR et ALAMUT (Interactive Biosoftware) pour l’annotation. Résultats: 84,4 % des analyses ont été réalisées en trio. Sur les 334 analyses d’exome, la mise en évidence d’un variant de classe 4 ou 5 selon la classification ACMG dans 66 gènes différents a permis de rendre un diagnostic certain pour 88 cas (26.35%). Les bases moléculaires de 37 de ces 66 pathologies (56%) ont été décrites après 2010 dont 7 après 2015 (10,6%).  Nous avons pu retrouver des données de prévalence disponibles pour 44 de ces diagnostics: 88,6% sont classés comme ultra-rares et pour 36,4% moins de 20 cas sont décrits dans la littérature. Nous avons également recherché l’existence d’informations accessibles aux familles concernant la pathologie (association de patients, ressources web) pour chaque diagnostic. Discussion/ conclusion: L’ensemble de ces données souligne l’importance du taux de pathologies ultra-rares diagnostiquées grâce au SHD dans le domaine des AD et le peu d’informations disponibles pour les patients et leurs familles concernant l’évolution et le parcours de soin. Un accompagnement global et un suivi médical régulier de ces patients apparaît important avec une veille bibliographique et une mise à jour régulière des connaissances afin de limiter la sensation d’isolement ressentie par les familles.

Le syndrome d’Aarskog (SA), aussi appelé dysplasie facio-génitale, est un syndrome lié à l’X, rapporté pour la première fois par Aarskog en 1970. Il est caractérisé par une dysmorphie faciale reconnaissable, une petite taille modérée, des anomalies des extrémités ainsi que des anomalies génitales, notamment du scrotum. Le SA est causé par des mutations du gène FGD1, situé sur en Xq11.21. Ce gène code une protéine échangeuse de guanine (GEF) qui active spécifiquement la Rho-GTPase CDC42. Cette voie intervient notamment dans le développement osseux. Les connaissances du phénotype du SA sont essentiellement basées sur la description de patients dont le diagnostic n’a pas été confirmé par l’analyse du gène FGD1. Ainsi, certains aspects du phénotype sont encore peu connus. En particulier, la description du phénotype neurodéveloppemental est extrêmement hétérogène dans la littérature médicale.

Afin de redéfinir le spectre phénotypique du SA et afin de proposer des critères diagnostiques, nous avons analysé les caractéristiques cliniques d’une grande série de  patients avec une mutation identifiée dans FGD1. Afin de recueillir ces informations, un questionnaire établi à partir des données de la littérature a été envoyé aux cliniciens référents. Des photos et des radiographies osseuses étaient également demandées. Les éléments morphologiques ont été revus par des dysmorphologistes expérimentés et les radiographies osseuses ont été relues par l’équipe du centre de référence français des maladies osseuses constitutionnelles. Nous présentons les résultats de l’analyse clinique, radiologique et moléculaire de 106 patients garçons. Nos résultats apportent des informations sur l’histoire naturelle du SA et sur la prévalence des signes cliniques. Nous apportons également la description de nouveaux signes cliniques et radiologiques associés au SA.

Enfin, au regard des stratégies actuelles de séquençage à haut débit et l’essor du rétro-phénotypage, nous proposons des critères diagnostiques permettant de justifier l’étude moléculaire de FGD1 devant une suspicion clinique et permettant également l’interprétation des variants de FGD1 issus du séquençage haut débit. Nous proposons également des recommandations pour la prise en charge.

Introduction: Les maladies génétiques rares représentent une cause fréquente d'admission aux soins intensifs néonataux (SINN). Établir un diagnostic de maladies rares chez les nouveau-nés peut être difficile en raison de leurs présentations souvent atypiques ou peu spécifiques. Or, des études récentes suggèrent qu’un diagnostic étiologique posé rapidement après l'admission aux SINN affecte significativement la prise en charge. L’objectif de cette étude est d’évaluer l’impact du séquençage entier du génome en mode rapide sur le rendement diagnostique et la prise en charge des enfants admis aux SINN.

Méthodes: Un séquençage du génome entier en trio a été réalisé chez les nouveau-nés admis aux SINN du CHU Sainte-Justine (entre les mois de mars et septembre 2019) en raison d’une suspicion de maladies rares. Les génomes ont été séquencés sur un système NovaSeq (Illumina) et leur analyses bio-informatiques ont été réalisées sur la pipeline Dragen. L’impact du résultat sur la prise en charge de l’enfant a été évalué pour toute la période de l’hospitalisation. 

Résultats: Dix-huit patients ont été inclus dans l’étude, 2 pour une encéphalopathie épileptique, 5 pour une cardiopathie, 10 pour un syndrome poly-malformatif et 1 pour un syndrome de Cushing congénital. Un résultat préliminaire a été rendu en 1 semaine pour tous les cas où des variations pathogéniques ont été identifiées. La durée médiane entre l’inclusion et le rendu du résultat a été de 19 jours (quartile 1 : 16, quartile 3 : 32). Sept diagnostics ont été posés par le séquençage du génome (38,9%). Parmi ceux-ci, 3 diagnostics étaient inattendus et auraient été manqués par une approche de séquençage de panels de gènes parce que le médecin généticien ne les avaient pas initialement évoqués. Une modification de la prise en charge ou du conseil familial suite au rendu du résultat a été rapportée chez 6 enfants incluant une modification du traitement pharmacologique chez 2 enfants, une orientation vers les soins palliatifs chez 2 patients, un arrêt du suivi en génétique pour 1 enfant (chez qui le séquençage du génome était négatif) et un dépistage des apparentés chez 2 patients. 

Conclusion: Le séquençage du génome a permis de poser un diagnostic chez 7/18 patients en moins d’un mois et a impacté leur prise en charge dans le tiers des cas. Le recrutement de patients additionnels est actuellement toujours en cours, avec un objectif de recruter 100 trios. 

Introduction : La sirénomélie est un syndrome malformatif fœtal rare de cause inconnue, caractérisé par la présence d’un membre inférieur unique associé à des malformations viscérales habituellement incompatibles avec une survie ex-utero. Nous avons fait l’hypothèse que, comme dans une fraction importante des maladies du développement, des variations génétiques rares à effet fort pourraient participer au déterminisme de cette maladie, avec en premier lieu un rôle des mutations de novo. Nous présentons la description clinique et les résultats génomiques d'une série internationale de sept cas de sirénomélies sporadiques et de deux cas d'agrégations familiales autosomiques dominantes de sirénomélies et d’autres malformations caudales.

Méthodes : Un séquençage de l’exome en trio a été réalisé dans les sept formes sporadiques, et l’analyse des données a été concentrée sur les mutations de novo. L’analyse dans les deux formes familiales, également basée sur le séquençage de l’exome chez plusieurs individus, a été réalisée en accord avec un modèle autosomique dominant.

Résultats : L’analyse des formes familiales a montré la présence d’un variant non synonyme, absent des bases de données contrôles, du même gène A* dans les deux familles, avec une co-ségrégation du variant avec le phénotype. Ce gène est un acteur majeur du développement embryonnaire du pole caudal, et la délétion hétérozygote de ce gène constitue l’un des modèles murins de sirénomélie. Par ailleurs, une des deux mutations identifiées a été associée récemment à un phénotype proche de malformations du pole caudal chez l’homme. L'analyse des sept cas sporadiques n’a pas permis d’identifier de gènes touchés par des mutations de novo de manière récurrente, mais a mis en évidence plusieurs gènes candidats, incluant le gène B*, régulateur de la voie wnt canonique, drastiquement sensible aux variations mutations perte de fonction,  et cible d’une altération tronquante survenue de novo chez l’un des cas sporadiques.

Conclusion : Nous apportons les premiers résultats en faveur d'une étiologie génétique de la sirénomélie humaine. Nous identifions le gène A comme étant associé à une prédisposition autosomique dominante à diverses malformations caudales, comprenant sirénomélie, agénésies urinaires partielles ou complètes, anomalies ano-rectales et anomalies des organes génitaux. Par ailleurs, nous proposons l'implication du gène B comme gène candidat dans la sirénomélie. Au total, notre étude met en évidence un degré élevé d'hétérogénéité génétique dans la sirénomélie humaine et souligne le rôle de deux voies de signalisation dans le développement de cette maladie rare.

*Le nom des gènes sera donné lors du congrès