"Mercredi 10 janvier"

Le gène EEF1A2 code pour la sous-unité alpha du complexe d'élongation-1 responsable de la liaison enzymatique de l'aminoacyl-ARNt au ribosome lors de la synthèse protéique. Depuis 2012, 21 variants faux-sens pathogènes de EEF1A2 ont été décrits chez 42 individus présentant un phénotype neurodéveloppemental sévère incluant une encéphalopathie épileptique et une déficience intellectuelle modérée à profonde. Une régression neurologique a été rapportée dans près de la moitié des cas.

Après avoir identifié un patient avec un phénotype moins sévère que ce qui était connu, nous avons réalisé un appel à collaboration international, et recueilli 26 patients présentant des variants du gène EEF1A2. Nous avons fait la revue de la littérature et comparé les cohortes afin d’améliorer les connaissances sur ce gène et préciser le pronostic neurodéveloppemental de ces patients. De plus, nous avons réalisé la modélisation protéique des variants.

Les patients de notre cohorte présentent un phénotype neurodéveloppemental significativement moins sévère que les patients de la littérature. En effet, 83% des patients ont acquis une marche autonome  contre seulement 29% dans la littérature. De plus, 84% de nos patients ont des capacités langagières contre seulement 15% dans la littérature. De manière intéressante, trois de nos patients n'ont pas de déficience intellectuelle. L'épilepsie est moins fréquente et rapportée dans 63% des cas (vs 93%). L'examen neurologique retrouve significativement moins d'hypotonie (58% vs 96%), et de signes pyramidaux (24% vs 68%). Dans notre cohorte, le taux de régression cognitive est significativement plus faible car présent dans seulement 4% des cas. Sur le plan moléculaire, nous rapportons 10 nouveaux variants faux-sens de EEF1A2.  La modélisation protéique de l’ensemble des variants connus nous a permis de mettre en évidence des corrélations génotype/phénotype. Ainsi, les variants associés à un phénotype sévère, et la majorité de ceux associés à un phénotype modéré, se regroupent dans la région switch II de la protéine et peuvent donc affecter l'échange de GTP. En revanche, les variants associés à des phénotypes plus légers peuvent avoir un impact sur des fonctions plus secondaires telles que la formation de faisceaux d'actine.

Nous rapportons la plus grande cohorte d'individus présentant des variants EEF1A2, élargissant ainsi le spectre phénotypique de cette pathologie afin d'améliorer le conseil génétique des familles. De plus, nous avons mis en évidence de nouvelles corrélations génotype/phénotype améliorant ainsi la compréhension de la variabilité clinique.

Souvent d’origine génétique, les troubles neurodéveloppementaux (TND) regroupent plusieurs pathologies, comme la déficience intellectuelle, l'autisme et les troubles de l'apprentissage ou du comportement, isolées ou associées à des malformations cérébrales. Les TND découlent d’anomalies survenues pendant le développement embryonnaire. La détermination de la pathogénicité des variations de signification incertaine (VSI) dans de nouveaux gènes candidats ou dans des gènes déjà impliqués en pathologie humaine avec une expression restreinte au système nerveux central représentent un défi majeur. Cette problématique limite la possibilité de poser un diagnostic moléculaire aux patients, alors en impasse diagnostique. Une des stratégies actuellement déployée dans notre équipe est la génération d’organoïdes cérébraux et/ou de neurones à partir de cellules souches pluripotentes induites (iPSCs), obtenues par reprogrammation de cellules des patients (fibroblastes ou sang) ou par modélisation de la mutation par la technologie CRISPR/Cas9 dans des iPSCs contrôles. Les iPSCs sont ensuite différenciées en neurones 2D ou en organoïdes cérébraux 3D, et analysés pour différents critères. Pour les organoïdes, la morphologie et la croissance sont étudiées à différents temps de culture par des coupes/immunomarquages. Entre autres, sont étudiés et comparés à des organoïdes contrôles : la prolifération des progéniteurs (Ki67) et leur axe de division (HTA28, Tpx2), ainsi que la mise en place des différentes structures à identité neuronales spécifiques (PAX6 (progéniteurs), TBR1/TUJ1/SATB2/CTIP2 (neurones), GFAP (astrocytes)… Grâce à la technologie de MicroElectrode Array (MEA), l’activité électrique spontanée et synchronisée peut être mesurée après 3 mois de culture. Des analyses omiques (ex : génomiques, transciptomiques ou épigénomiques) sont aussi conduites à différents temps du développement de l’organoïde ou de la différenciation neuronale 2D pour comprendre l’effet du variant pathogène et les mécanismes physiopathologiques résultant de ces variations génétiques. Plus récemment, des nouvelles technologies à type séquençage d’ARN « single-cell » permettent d’étudier de façon plus fine les effets des variations à l’échelle cellulaire. Ainsi plusieurs projets sont déjà en cours et concernent des variations génétiques dans les gènes codant le facteur d’épissage PTBP1 donnant une déficience intellectuelle variable, le facteur de transcription MEF2C responsable d’encéphalopathie épileptique, le récepteur du glutamate GRIN2A lui aussi responsable d’encéphalopathie épileptique et la protéine associée aux microtubules SOGA1 responsable de lissencéphalie et déficience intellectuelle sévère. Cette approche de culture cellulaire 3D est un complément important dans l’étude des mécanismes cellulaires responsables du TND et peut déboucher sur la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques qui pourront être testées in vitro.

L'hydrocéphalie congénitale (HC) est associée à une morbidité et une mortalité infantile élevées. Son incidence est estimée à une naissance sur 1000. L’HC peut être isolée, non syndromique, ou associée à des malformations extra-cérébrales dans un cadre syndromique. Les études épidémiologiques suggèrent une cause génétique dans 40% des HC. Une centaine de gènes ont été impliqués dans les formes tant syndromiques que non syndromiques d’HC. Cependant, le rendement diagnostique des analyses génétiques dans cette indication est faible soulignant l’importance de poursuivre les efforts d’identification de nouveaux gènes impliqués dans la survenue de ces hydrocéphalies. L1CAM est le premier gène identifié dans les HC, responsable de l’hydrocéphalie liée à l’X ou syndrome de Bickers-Adams, caractérisé par une dilatation triventriculaire, une sténose de l’aqueduc de Sylvius, une hypoplasie ou une agénésie du corps calleux, une hypoplasie ou une agénésie des faisceaux pyramidaux et des pouces adductus chez des fœtus de sexe masculin.

L’identification d’une HC mimant la présentation d’un syndrome de Bickers-Adams chez un fœtus de sexe masculin puis deux fœtus de sexe féminin au sein d’une même fratrie, en l’absence de variant pathogène dans le gène L1CAM, nous a conduit à suspecter une forme d’hydrocéphalie de transmission autosomique récessive. Le séquençage d’exome en trio, cas index et parents, a permis d’identifier une variation homozygote non-sens dans le gène FSD1L. La protéine FSD1L est composée d’un domaine coiled-coil, un domaine Fibronectine de type III et un domaine SPRY et sa fonction est inconnue. Cette variation homozygote a également été retrouvée chez les deux autres fœtus atteints de la famille. L’électroporation in utero d'un plasmide CRISPR-FSD1L-KO/GFP dans les ventricules cérébraux d’embryons de souris confirme le rôle de FSD1L dans l’HC : la dilatation ventriculaire était significativement plus importante dans le groupe électroporé avec le plasmide CRISPR-FSD1L-KO/GFP par rapport au groupe électroporé avec GFP seul ou au groupe contrôle sans électroporation. Par ailleurs, nous avons montré par immunohistochimie que les profils d'expression de FSD1L et de L1CAM au cours du développement du cerveau humain normal étaient identiques, avec notamment une forte expression au niveau des commissures cérébrales. Enfin, un double marquage FSD1L/L1CAM ne montre pas de colocalisation, indiquant que ces deux protéines n’interagissent pas physiquement.

L’expression de FSD1L dans les mêmes structures anatomiques que L1CAM et la similitude des présentations cliniques des fœtus atteints de ce syndrome et du syndrome de Bickers-Adams suggèrent que ces molécules contrôlent la guidance axonale, la fasciculation et la compliance cérébrale. Ainsi, les variations du gène FSD1L constituent une cause d’hydrocéphalie de transmission autosomique récessive et FSD1L représente un nouvel acteur impliqué dans la navigation des neurones commissuraux.

Using mouse genetic studies and systematic assessments of brain neuroanatomical phenotypes, we set out to identify which of the 30 genes causes brain defects at the autism-associated 16p11.2 locus. We show that multiple genes mapping to this region interact to regulate brain anatomy, with female mice exhibiting far fewer brain neuroanatomical phenotypes. In male mice, among the 13 genes associated with neuroanatomical defects, Mvp is the top driver implicated in phenotypes pertaining to brain, cortex, hippocampus, ventricles and corpus callosum sizes. The major vault protein (MVP), the main component of the vault organelle, is a conserved protein found in eukaryotic cells, yet its function is not understood. Here, we find MVP expression highly specific to the limbic system and show that Mvp regulates neuronal morphology, postnatally and specifically in males. We also recapitulate a previously reported genetic interaction and show that Mvp^+/-;Mapk3^+/- mice exhibit behavioral deficits, notably decreased anxiety-like traits detected in the elevated plus maze and open field paradigms. Our study highlights multiple gene drivers in neuroanatomical phenotypes, interacting with each other through complex relationships. It also provides the first evidence for the involvement of the major vault protein in the regulation of brain size and neuroanatomy, specifically in male mice.

Les tubulinopathies définissent un groupe de malformations cérébrales en lien avec des variants pathogènes dans un des gènes codant pour différents isotypes de tubuline. Cliniquement, la plupart des patients présentent un retard global de développement, une déficience intellectuelle modérée à sévère, une épilepsie et des troubles moteurs. L’IRM cérébrale montre classiquement une anomalie de fragmentation des noyaux gris centraux,  associée fréquemment à des anomalies de la giration (polymicrogyrie, lissencéphalie), du corps calleux ou de la fosse postérieure.

La plupart des mutations sont de novo, mais quelques familles ont été décrites dans la littérature, avec une transmission dominante, avec un phénotype décrit parfois moins sévère. Des cas de formes « mild » radiologiques, c’est à dire sans anomalie de giration ont également été décrits chez des fœtus, hérités pour certains de parents pauci ou asymptomatique. L’objectif principal de cette étude est de décrire un nouveau phénotype clinico-radiologique de patients avec une forme « mild » de tubulinopathie.

Nous avons donc inclus, à partir d’un appel à collaboration européen, les adultes ou enfants de plus de 6 ans, porteurs d'un variant pathogène dans TUBA1A, TUBB2B, TUBB3, TUBB ou TUBB2A avec une cognition normale ou une déficience intellectuelle légère (QIT >70). Les données cliniques, neuropsychologiques et d’IRM cérébrales ont été recueillies.

23 patients issus de 15 familles non apparentées ont été inclus. Le gène majoritairement retrouvé est TUBB3 avec 52% de patients porteurs. 6 variants sont de novo et 8 hérités.

78% ont présenté un retard psychomoteur, seulement 16% ont présenté une épilepsie, et 88% présentent des troubles des apprentissages. Aucun des patients ne présentent d’anomalie de giration à l’IRM cérébrale.

La corrélation génotype – phénotype a permis de mettre en évidence deux variants récurrents (TUBB3 p. Pro357Leu et TUBB p.Asn52Ser), à la fois dans notre étude et dans la littérature, chez des patients présentant le même phénotype. Toutefois, pour 4 variants, il existe une variabilité phénotypique intra et inter familiale.

Notre étude confirme l’existence d’un phénotype « mild » de tubulinopathie, avec, pour certains variants, une corrélation génotype phénotype, importante pour l’information pronostique.

TRPM3 est un canal cations localisé à la membrane plasmatique, sensible à la température et aux neurostéroïdes, très exprimé dans le cervelet, et important pour l’homéostasie du calcium. Des variants de novo de TRPM3, dont une mutation majoritaire, ont été identifiés chez des patients avec trouble du neurodéveloppement (retard psychomoteur, hypotonie, épilepsie, déficience intellectuelle, diminution de la sensibilité au chaud et à la douleur). Lors de l’exploration génétique des patients du CRMR atteints d’ataxie congénitale, nous avons identifié 4 nouveaux patients présentant un phénotype cérébelleux associé à un variant de novo de TRPM3. Nous décrivons le phénotype de 10 patients (8 filles, 2 garçons; 21 mois-45 ans) recrutés par une collaboration internationale, porteurs de 7 mutations de TRPM3 distinctes. Ces patients présentent un large éventail de symptômes, en terme de retard moteur, déficience intellectuelle (sévère 4/10, légère 3/10), épilepsie (2/10 et crises fébriles 1/10), anomalies squelettiques (7/10: subluxation de hanche, dislocation rotulienne, maladie de Perthes, brachydactylie, pieds valgus, anomalie des côtes). Deux sur 7 ont un retard statural et 3/10 une microcéphalie postnatale modérée. Le phénotype cérébelleux, ataxie ou hypotonie sévère, nystagmus, atrophie cérébelleuse, est objectivé chez 6/10 patients. Une collaboration avec l’équipe de Joris Vriens à Leuven a permis de confirmer le mécanisme gain de fonction pour tous les variants, caractérisé par une activité basale accrue entraînant une surcharge cellulaire en calcium. La primidone, antiépileptique antagoniste connu du TRPM3, réduit l’activité basale accrue de tous les canaux mutants.

Ce travail confirme l’existence d’un spectre de troubles du neurodéveloppement autosomique dominant avec une composante cérébelleuse fréquente, lié à un gain de fonction de TRPM3, et incite à l’évaluation des antagonistes du TRPM3 comme thérapie potentielle.

Contexte : Le pronostic neurodéveloppemental des anomalies du corps calleux (AnCC), l'une des malformations cérébrales les plus fréquentes, varie considérablement, allant d'un développement normal à une déficience intellectuelle (DI) profonde. De nombreux gènes sont responsables d’AnCC syndromiques avec DI, tandis que les causes génétique d’AnCC sans DI restent peu connues.

Objectif et Méthode : À travers un travail collaboratif, nous décrivons ici ZEB1, gène précédemment impliqué dans une condition ophtalmologique appelée dystrophie cornéenne polymorphe postérieure de type 3 (PPCD3), en tant que nouveau gène dominant de l'AnCC. Nous rapportons les données cliniques et moléculaire d’une série de neuf individus présentant un AnCC (dont trois fœtus interrompus en raison de l'AnCC) chez qui un variant hétérozygote perte de fonction de ZEB1 a été identifié par séquençage d’exome.

Résultats : Chez cinq patients, le variant était hérité d'un parent avec un corps calleux normal, illustrant la pénétrance incomplète de l'AnCC chez les individus avec perte de fonction ZEB1. Tous les patients ont eu une scolarité normale et aucun d'entre eux n'avait de DI. L'évaluation neuropsychologique chez six patients a montré soit un fonctionnement normal soit une cognition hétérogène. Deux patients avaient un utérus bicorne, trois avaient une anomalie cardiovasculaire et quatre avaient une macrocéphalie à la naissance, suggérant un spectre plus large de malformations liées à ZEB1.

Conclusion : Cette étude montre que les variants de perte de fonction de ZEB1 sont responsables d’AnCC dominante sans DI et élargit le phénotype extra-oculaire lié à ce gène.

Des variations pathogènes à l’état hétérozygote de survenue de novo dans le gène EBF3 (Early B-Cell Factor 3, OMIM*607407) ont été identifiées comme cause du syndrome HADD (hypotonia, Ataxia, and delayed development syndrome, OMIM* 617330). Il s’agit d'un trouble neurodéveloppemental rare caractérisé par une déficience intellectuelle, une dysmorphie faciale, une hypotonie et une ataxie. A ce jour, une cinquantaine de patients ont été rapportés dans la littérature. L'IRM cérébrale est rapportée normale chez la plupart des patients, mais certains patients ont été décrits avec une malformation cérébelleuse avec hypoplasie du vermis et une anomalie de foliation décrite comme le « signe du pissenlit ». Nous présentons la caractérisation clinique, radiologique et moléculaire de 8 patients âgés de 26 mois à 16 ans porteurs d’une variation pathogène hétérozygote survenue de novo dans le gène EBF3.  1 patient est porteur d’une délétion chromosomique 10q26 de novo emportant le gène EBF3, 7 patients sont porteur d'une mutation ponctuelle hétérozygote du gène. Les données, obtenues par une analyse rétrospective des dossiers, permettent une description phénotypique fine et l’identification de signes non décrits. Tous les patients ont un trouble du neurodéveloppement : hypotonie, retard global de développement, déficience intellectuelle, ataxie. La sévérité de la déficience intellectuelle est variable. 2 patients présentent une pseudo-hypertrophie musculaire. Les IRM cérébrales, examinées par des neuroradiologues experts, sont anormales chez tous les patients. Sept patients ont été identifiés avec le signe du pissenlit, 1 patient présentait une atrophie cérébelleuse. Nous soulignons la fréquence élevée des malformations cérébelleuses associées aux variations pathogènes du gène EBF3. Le signe du pissenlit est fréquemment retrouvé et reconnaissable. La pseudo-hypertrophie musculaire présente chez deux patients élargit le spectre de cette pathologie récemment décrite.

Introduction : Les gènes MYCN, CCND2 et AKT3 jouent un rôle central dans la régulation cellulaire et la croissance. Les variations nucléotidiques simples (SNV) et les variations du nombre de copies (CNV) dans ces gènes sont associées à des maladies génétiques humaines. Cette revue examine les phénotypes connus et inverses, les mécanismes de gain et perte de fonction et met en lumière les partages internationaux de données qui facilitent la compréhension de ces altérations.

Matériel et méthodes : Une recherche bibliographique approfondie a été effectuée pour recueillir des données sur les altérations génétiques (SNV, CNV) des gènes MYCN, CCND2 et AKT3 et leurs effets sur les phénotypes humains. Des bases de données génétiques internationales, des articles de recherche et des rapports cliniques ont été consultés. L'analyse des mécanismes de gain et perte de fonction a été intégrée à cette revue. De plus, l'apport des partages internationaux de données a été pris en compte pour une vision globale.

Résultats : Les SNV et CNV dans le gène MYCN sont étroitement liés au neuroblastome, un cancer pédiatrique du système nerveux. Les variations induisant un gain de fonction peuvent entraîner une croissance cellulaire incontrôlée, tandis que les pertes de fonction peuvent altérer le développement neuronal normal. Pour CCND2, les SNV conduisant à un gain de fonction sont associées à l'hyperplasie nodulaire focale du foie, alors que les pertes de fonction perturbent le cycle cellulaire. En ce qui concerne AKT3, les altérations activatrices sont corrélées au syndrome de mégencéphalie-cortical dysplasia-polymicrogyrie (MECP), caractérisé par des anomalies cérébrales, tandis que des pertes de fonction peuvent entraver la croissance neuronale normale.

Conclusion : Les gènes MYCN, CCND2 et AKT3 jouent un rôle crucial dans la régulation cellulaire, et leurs altérations (SNV, CNV) sont étroitement associées à diverses maladies génétiques humaines. La compréhension des mécanismes de gain et perte de fonction est essentielle pour cerner l'impact de ces altérations sur les phénotypes humains. L'efficacité des recherches est renforcée par les partages internationaux de données, favorisant une vision globale de ces altérations et ouvrant ainsi la voie à des traitements plus précis et personnalisés. Des efforts continus sont nécessaires pour approfondir notre compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents à ces altérations et pour développer des thérapies plus efficaces dans le contexte des maladies génétiques.

La protéine PTBP1 (Polypyrimidine tract-binding protein 1), appartenant à la famille des ribonucléoprotéines nucléaires hétérogènes (hnRNP), joue un rôle de régulateur dans la biogénèse et la stabilité des ARNs en effectuant la navette entre le noyau et le cytoplasme grâce à des signaux de localisation et d'exportation nucléaires partiellement chevauchants. L’étude clinique réalisée a démontré que des variations hétérozygotes dans PTBP1 sont responsables de formes syndromiques de troubles du développement neurologique et squelettique. En parallèle, par une combinaison d’approche de génétique moléculaire et transcriptomique dans des fibroblastes primaires prélevés sur des individus porteurs de la variation, ainsi que des modèles in vitro et in vivo indépendant, nous avons entre autres mis en évidence une distribution anormale de la protéine entre le noyau et le cytoplasme et des défauts transcriptomiques majeurs.  

Bien que des défauts d'ostéochondrogenèse (84%) soient sur le premier plan, le phénotypage des patients a aussi mis en évidence des troubles neurodéveloppementaux variables (36%) comprenant un retard moteur, une déficience intellectuelle et des troubles du comportement, associés à des défauts neuroanatomiques (hypoplasie du corps calleux, du cervelet et retard de myélinisation). Pour surmonter l’inaccessibilité du tissu cérébral, l’une des stratégies actuellement déployée dans l’équipe GAD est la génération d’organoïdes cérébraux et/ou de neurones à partir d’iPSCs (plateforme MasSC Marseille). En parallèle, un financement du projet européen « Rare Disease Models & Mechanisms Europe (RDMM)-(SolveRD) et la collaboration avec la clinique allemande de la souris (GMC) nous ont permis la création d'un modèle de souris portant la variation la plus fréquente dans notre cohorte (C57BL/6N_2T > C). Ces modèles in vitro et in vivo constituent un outil puissant pour caractériser les défauts biologiques et anatomiques, dès les premiers instants du développement cérébral. Étant donné que PTBP1 est exprimé précocement lors du développement embryonnaire, ses défauts d'activité pourraient entraîner des effets moléculaires (dérégulation transcriptionnelle et génique) et cellulaires (prolifération, migration et différentiation neuronale).

Grâce au financement MultiOmixCAre (Programme prioritaire de recherche Maladies rares – Inserm), le développement du cerveau est alors étudié à l'aide de deux approches principales, déployées sur des embryons de souris PTBP1^KI/+ à différents stades de développement (E7.5 à E18.5) et sur les organoïdes cérébraux des patients: (i) le "single cell-RNA-seq", pour investiguer les défauts transcriptomiques propres à chaque type cellulaire et (ii) la transcriptomique spatiale par la méthode Merscope (Vizgen), qui permet de marquer de manière précise et spécifique des ARNs, sur des coupes d'embryon et de cerveau. Nous espérons ainsi mettre en évidence les événements moléculaires responsables de ces anomalies neurodéveloppementales.

L’identification des variations du nombre de copies (CNV) est essentielle pour l’interprétation complète des données de séquençage. Cependant leur détection reste un challenge pour les pipelines bioinformatiques. Les variations de structure (SV) peuvent être extrêmement variées, pouvant aller de 50 paires de bases à plusieurs mégabases. Leur détection est un enjeu majeur de la cytogénétique actuelle, permettant une amélioration du taux diagnostique, et donc du circuit de prise en charge des patients. La stratégie diagnostique actuelle priorise les analyses de cytogénétiques classiques et moléculaires ciblées, avant l’accès au génome. De multiples stratégies ont émergé pour améliorer la détection des SV, notamment en séquençage d’exome ou de panels ciblés : utilisation d’algorithmes d’étude des profondeurs de lecture, couplés à l’analyse de la répartition des variations ponctuelles, et des paires chimériques ou splittées.

A partir de données d’exome, nous avons évalué 3 approches bio-informatiques pour la détection de CNV : CNV DRAGEN (read depth), SV DRAGEN (split reads) et ROH DRAGEN (snp distribution). Nous avons mesuré leurs apports diagnostique sur une cohorte de près de 600 patients porteurs de troubles du neurodéveloppement, analysés à l’Institut de Génétique Médicale entre Septembre 2020 et Mars 2022. L’ensemble des patients avait bénéficié d’une CGH-array en première intention avant séquençage d’exome.

Nos résultats mettent en évidence la complémentarité de ces approches et leurs limites. Ainsi, CNV DRAGEN identifie avec une grande efficacité les CNV de plus de 500pb alors que SV DRAGEN est plus pertinent pour les variants à partir de 50pb. Cependant, la couverture fragmentée et partielle de l’exome ne permet pas une utilisation optimale de ces pipelines. L’utilisation de ces approches combinées a permis de faire 8 diagnostics supplémentaires par read depth et 2 par split reads, sur 600 patients, soit un apport diagnostique de 1,7%.

Catalysée par les enzymes de la famille ADAR, la déamination A-to-I est une des formes d’editing des ARN les plus fréquentes chez les mammifères et contribue à la diversité transcriptomique et protéomique.

Les données publiées à ce jour suggèrent qu’un dysfonctionnement d’ADAR1 provoque une reconnaissance des ARNs non-edités par des senseurs cytosoliques, Mda5 en particulier, conduisant à une activation de l'expression de centaines de gènes stimulés par l'interféron (ISGs), et une mort cellulaire. En accord avec ces observations, des mutations d’ADAR1 sont responsables du syndrome d'Aicardi-Goutières (AGS : encéphalopathie inflammatoire génétiquement déterminée). Des mutations de ce gène sont aussi responsables de dyschromatose symétrique héréditaire (DSH: macules hyper et hypo-pigmentées). Ces défauts de pigmentation suggéraient un rôle d’ADAR1 au cours du développement des mélanocytes dérivés de la crête neurale, mais le rôle de cette enzyme dans d’autres dérivés de cette structure restait à définir.

Pour avancer dans ce domaine, nous avons généré un modèle murin de délétion conditionnelle d’Adar1 dans la crête neurale. En accord avec le phénotype observé chez l’homme, les mutants présentent une dépigmentation globale due à une apoptose des mélanocytes. Une absence totale de myéline le long des nerfs périphériques, due à un défaut de différenciation des cellules de Schwann, a également été mise en évidence. Comme pour les mélanocytes, ces défauts sont précédés par une augmentation de l’expression d’ISGs. Une analyse transcriptomique combinée à des expériences in vitro et in vivo (doubles mutants murins) nous ont ensuite permis d’identifier les voies de signalisation dont la dérégulation impacte la formation de la myéline périphérique. Comme dans d’autres tissus, nous avons montré le rôle central de l’activation de la voie Mda5/Mavs et la recherche des facteurs de transcription dérégulés suite à cette activation nous a conduit à montrer le rôle central du facteur de transcription EGR1 dans la genèse des anomalies de myélinisation observées chez les mutants. Supportés par une récente description clinique indiquant qu’une neuropathie périphérique peut faire partie du spectre clinique associé à des mutations d’ADAR1 chez l’homme, ces résultats démontrent un rôle essentiel d’ADAR1 et du RNA editing au cours du processus de myélinisation du système nerveux périphérique chez l’homme et la souris.

Le syndrome de l’X-Fragile (FXS) est la forme la plus courante de déficience intellectuelle et comportementale héréditaire associée à des troubles de la sensibilité aux stimuli sensoriels (Penagarikano et al., 2007 ; Hagerman et Hagerman, 2015). Sur le plan de visuel, l’intégration est perturbée sur la sensibilité aux contrastes, formes, textures et mouvement (Kogan et al., 2008 ; Farzin et al., 2011). Une étude électrophysiologique (électrorétinogramme - ERG) associée à une évaluation de la perception des contrastes (tests comportementaux), menée chez des patients avec FXS (CLIBIOMAR, ID-RCB 2019-A01015-52) et chez le modèle murin du FXS (souris FMR1^y/-), nous a permis de mettre en évidence l’existence d’un trouble visuel de la perception rétinienne (Perche et al., 2018 ; Felgerolle et al., 2019 ; Perche et al., 2021). Chez le patient, outre les conséquences comportementales, notre étude semble démontrer que la dys-sensibilité rétinienne semble se manifester par la présence d’une photophobie avec douleur.

La photophobie peut être définie comme une réduction de la sensibilité au contraste provoquée par une lumière éblouissante et une aversion générale pour la lumière (Burstein et al., 2019 ; Chung et al., 2013 ; Noseda et al., 2019). L’existence d’un lien entre les troubles de la discrimination des contrastes et la photophobie suggère qu’elle trouve son origine dans un dysfonctionnement des cellules rétiniennes (Burstein et al., 2019 ; Chung et al., 2013 ; Noseda et al., 2019). L’implication des voies rétiniennes dans la physiopathologie de la photophobie évoquée dans la littérature est confortée par étude de cohorte de patients atteints de FXS (CLIBIOMAR, ID-RCB 2019-A01015-52). En effet, les familles et soignants ont décrit une hypersensibilité avec sensations douloureuses et des comportements d’évitement d’exposition à la lumière dans 55% des cas (11/20) et une « aversion » à la lumière dans 20% des cas (4/20). L’investigation par Short Sensory Profile (SSP) a mis en lumière des comportements significativement altérés sur les paramètres visuels [Sous-score 16.2(6.07) - Probable différence]. Chez le modèle murin, nous avons démontré, en utilisant un Elevated-Plus-Maze modifié, un comportement d’évitement d’exposition à la lumière et de photophobie, à différentes luminances (Delgado de Alba et al., en cours de publication). En effet, l’index d’aversion à la lumière est significativement supérieur chez la souris FMR1^y/- comparé au souris sauvage (WT) pour des intensités lumineuses de 120/300 lux [0.155±0.063 versus 0.041±0.070] et 500/1000 lux [0.155±0.051 versus 0.043±0.070].

Ces résultats préliminaires démontrent pour la première fois un phénotype visuel avec nociception dans le FXS. Ce comportement spécifique à des conséquences comportementales majeures pour la vie du patient. Notre objectif est de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques moléculaires et cellulaires impliqués dans cette photophobie à l’aide du modèle murin.

La maladie d’Alexander est une leucodytrophie démyélinisante de transmission autosomique dominante, causée par des variations pathogènes du gène GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein). Trois formes cliniques principales, toutes postnatales sont décrites : néonatale (/infantile), juvénile et adulte. Au niveau cérébral, elle est caractérisée par une dégénérescence de la substance blanche en lien avec la formation de fibres de Rosenthal le long du système nerveux central. La protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) s’associe sous forme de filaments intermédiaires qui sont un des constituants du cytosquelette des astrocytes. La GFAP mutée entraîne l’agglomération des protéines des filaments intermédiaires dans les astrocytes : ce sont les fibres de Rosenthal. Celles-ci sont décelables sur des coupes de cerveau en colorations anatomopathologiques. Les caractéristiques phénotypiques principales sont une déficience intellectuelle (ou une régression), une épilepsie, des difficultés alimentaires, une hydrocéphalie, une ataxie, spasticité et une dégradation pouvant entraîner le décès du patient. Nous présentons le cas d’un couple non apparenté et sans antécédent, menant une 1^ère grossesse sans signe d’appel échographique jusqu’au 3^ème trimestre. L’échographie de 32 SA (semaines d’aménorrhées), quant à elle, révèle une dilatation triventriculaire avec ventriculomégalie majeure évoquant une sténose de l’aqueduc de Sylvius (atrium gauche 23mm, atrium droit 20mm), évolutive, avec majoration à l’échographie de contrôle. Cette évolution, de mauvais pronostic, conduit le couple à formuler une demande d’IMG (Interruption médicale de grossesse). Les premières investigations génétiques étant négatives (caryotype/ ACPA), une analyse d’exome en trio a été proposée. Celle-ci a révélé l’existence d’un variant faux-sens dans le gène GFAP, apparu de novo : NM_002055.5(GFAP):c.227T > C p.(Leu76Pro). Ce variant, prédit délétère par les outils in silico (SIFT, Provean, FATHMM, REVEL) et absent des bases de données de population, touche le même résidu qu’un variant décrit pathogène. Afin d’étudier l’impact fonctionnel de ce variant, nous avons réalisé des études fonctionnelles sur ce variant ainsi que sur 2 autres variants déjà publiés (c.226C > T (L76F)¹, c.739T > C (S247P)²) sur cellules HEK293T. En microscopie confocale, la désorganisation des filaments est clairement établie pour les 4 variants par comparaison au wild-type, confirmant le caractère délétère du variant mis en évidence. Ce travail représente, à notre connaissance, le premier cas de maladie d’Alexander de présentation anténatale. Il illustre également l’intérêt des études fonctionnelles qui permettent de caractériser des variants génétiques identifiés par NGS (Next-Generation Sequencing).

1. Rodriguez D et al. PMID: 11567214

2. Boczek et al.  PMID: 27648269

Contexte: La macrocrânie désigne un périmètre crânien (PC) au-delà de 2 dérivation standard (DS) et concerne 2-3% de la population. Elle est considérée comme «cliniquement pertinente» si supérieure à 3DS. À l’inverse de la microcéphalie qui sous entend toujours un cerveau de petite taille, la macrocrânie et son spectre large d’étiologie n’implique pas systématiquement une mégalencéphalie (MEG) à savoir une croissance excessive du cerveau. Aujourd’hui la démarche étiologique d’une macrocrânie s’appuie sur son caractère évolutif ainsi que sur son association ou non à des signes cliniques neurologiques ou extra-neurologiques. La découverte d’un caractère familial ou d’un développement psychomoteur (DPM) normal peut rassurer à tort le praticien qui ne poursuivra pas l’enquête étiologique afin d’exclure une pathologie génétique.

Méthode: nous avons l’objectif de clarifier la démarche diagnostique et les étiologies génétiques des macrocéphalies avec MEG à l’ère du séquençage pan-génomique. Notre étude est basée sur deux axes : une recherche et un recueil systématique des informations cliniques et génétiques des patients dont le PC se situe à +3DS, suivis dans notre centre entre 1990 à aujourd’hui et une revue exhaustive des étiologies génétiques de MEG connues sur les bases OMIM et Pubmed avec entrée «macrocephaly», «mégalencephaly».

Résultats: Au total 205 patients répondaient à nos critères d’inclusion, les motifs d’adressage majoritaires étaient «déficience intellectuelle» (46%) «retard de développement» (30%), «macrocéphalie» (21%) et «troubles des apprentissages» (11%). Pour 114 soit 55% patients nous avons trouvé une étiologie génétique, avec un variant PTEN dans 17% des cas. Pour 32 patients soit 28% des patients avec diagnostic confirmé, le tableau correspondait à une macrocéphalie isolée ou avec un décalage modéré des acquisitions. 

Discussion: 74 gènes ont été identifiés, avec une surreprésentation de la voie PI3K/AKT/MTOR, de la voie de signalisation Sonic Hedgehog (SHH) et des gênes de régulation d’expression. Si les troubles du neurodéveloppement et la déficience intellectuelle apparaissent comme des traits phénotypiques fréquents, ils ne sont pas systématiques et cela laisse supposer un retard diagnostic lorsque 15% de ces étiologies sont associées à un risque tumoral impliquant un suivi.

Les expansions GAA dans l'intron 1 du gène FGF14 sont une cause fréquente d'ataxie cérébelleuse héréditaire de transmission autosomique dominante (ataxie GAA-FGF14 ; ataxie spinocérébelleuse 27B, SCA27B), en particulier en cas d’ataxie tardive (Late Onset Cerebellar Ataxia : LOCA). SCA27B se caractérise classiquement par un syndrome cérébelleux lentement progressif à début épisodique dans plus de 2/3 des cas, au-delà de 40 ans. Jusqu’à présent, la confirmation moléculaire des expansions GAA de FGF14 reposait principalement sur le séquençage long-read, technologie non encore disponible en routine dans les laboratoires de génétique.

Nous avons développé et validé une stratégie de diagnostic moléculaire en trois étapes : PCR long-range fluorescente pour déterminer la taille des allèles, triplet-primed PCR (TP-PCR) bidirectionnelle pour vérifier la présence et la nature de l’expansion (profil dentelé si le motif est GAA) et électrophorèse sur gel des produits de PCR long-range et/ou séquençage de Sanger en fonction du profil observé en TP-PCR. Par ailleurs, nous avons mis au point une seconde LR-PCR permettant d’amplifier de façon spécifique les allèles supérieurs à 30 GAA, afin de faciliter la lecture du séquençage Sanger. Enfin, nous avons mis en place l’analyse d’un set de marqueurs microsatellites afin de déterminer les haplotypes des allèles FGF14, afin de préciser la transmission des allèles dans certaines familles.

Nous avons comparé cette stratégie au séquençage long-read Nanopore sur 22 patients canadiens d’origine française SCA27B et l’avons ensuite testée sur une cohorte de 53 patients lorrains atteints de LOCA non résolue. Nous avons identifié 9 patients (9/53 ; 17 %) et 2 apparentés porteurs d'une expansion FGF14 (GAA)_≥250. 

Grâce à un appel à collaboration national, nous avons complété la cohorte par l’étude de 507 patients avec LOCA de cause indéterminée, soit un total de 560 individus. Nous avons identifié au total 107 patients (19,1 %) porteurs d’expansions FGF14 (GAA)_≥250 dont 17/560 (3%) avec des expansions entre 250 et 300 GAA (allèle intermédiaire avec pénétrance incomplète). Des études ultérieures regroupant les données moléculaires des cohortes SCA27B sur le plan international sont nécessaires afin d’aider à l’interprétation de ces allèles intermédiaires. Nous avons identifié des expansions non-GAA-pures non pathogènes en l’état actuel des connaissances et des interruptions au sein des répétitions GAA. L’étude des haplotypes a permis d’élucider la transmission des expansions dans deux familles. Une expansion est observée en méiose maternelle et une contraction en méiose paternelle.

Nous confirmons que SCA27B est une cause fréquente de LOCA. Le phénotypage détaillé des patients apparaît indispensable pour l’interprétation des résultats, en particulier en cas d’allèle intermédiaire. Cette nouvelle stratégie moléculaire permet de détecter les expansions GAA-FGF14 et de déterminer leur taille de façon fiable.

Contexte. La xanthomatose cérébrotendineuse (OMIM#213700/ORPHA:909) est une maladie récessive rare ( < 1/135 000 en Europe) qui résulte d’un déficit en Stérol 27-hydroxylase, enzyme clé de la biosynthèse des acides biliaires. L’accumulation de stérols anormaux en amont du bloc enzymatique, provoque une maladie de surcharge d’évolution progressive vers un tableau neuropsychiatrique sévère.

L’errance diagnostique résulte de symptômes généraux peu spécifiques ou ignorés dans l’enfance, qui évolueront à l’âge adulte vers une démence, une neuropathie diffuse et polymorphe, associées de manière inconstante à une athérosclérose et une xanthomatose tendineuse et cérébrale. Le diagnostic bioclinique repose sur la spectrométrie de masse, qui révèle des taux sanguins normaux ou bas de cholestérol et massifs de cholestanol. L’acide chénodésoxycholique (CDCA) débuté précocement est le seul traitement efficace sur l’évolution de la CTX, par freinage de la production de stérols anormaux.

La génétique moléculaire outre la confirmation diagnostique (VPP=100% si cholestanol > 1,5X ULN), permet le dépistage et le traitement par CDCA d’apparentés présymptomatiques. Bien que les régions d’intérêt diagnostique de CYP27A1 (NM_000784) soient aisément explorées par Sanger, le séquençage à haut débit (NGS) permet l’identification directe des phases alléliques, la détection de CNV et l’exploration des séquences non codantes.

Objectifs. Réévaluer la stratégie diagnostique par analyse rétrospective des génotypes et variants pathogènes observés chez 33 cas de CTX testés par génétique moléculaire depuis 25 ans. 

Résultats. Le diagnostic était effectué dans 70% des cas (16M/17F), après l’âge de 30 ans (39±16 ans), devant un tableau neuropsychiatrique patent et des taux de cholestanol > 10XULN. Les patients étaient homozygotes (n=14) et hétérozygotes composites (n=19), pour 17 variants pathogènes de CYP27A1 dont 12 sont prévalents en Europe, et 5 non décrits. Les patients étaient porteurs de mutations faux-sens, frameshift, et non-sens en régions codantes respectivement sur: 40, 4 et 3 allèles.

Dans 13 cas (27% des allèles pathogènes) au moins un des allèles pathogènes altérait un site consensus d’épissage. Aucun CNV n’a été détecté. Un seul variant en séquence non codante n’a pas été caractérisé, seule sa phase a été déterminée par analyse haplotypique des variants synonymes observés au locus CYP27A1 sur un trio informatif. L’exploration des séquences introniques profondes et périgéniques de CYP27A1 est en cours.

Conclusion. Sur une série de 33 patients atteints de Xanthomatose Tendineuse, 42% étaient homozygotes. Les variants pathogènes en régions non codantes, voire en régions génomiques profondes, représentaient près du tiers des causes génétiques de CTX. Cela souligne l’intérêt d’un premier criblage du locus CYP27A1 par séquençage exomique élargi, complété du séquençage génomique en cas de tableau clinico-biologique typique, offrant une sensibilité diagnostique de 100%.

Contexte : Ces dernières années, la réalisation des tests pré-symptomatiques (TPS) dans la Sclérose Latérale Amyotrophique/Démence Fronto-Temporale (SLA/DFT) a pris de l’ampleur dans l’activité des centres de Neurogénétique, en parallèle de l’essor de la génétique dans ce domaine, de l’augmentation des diagnostics génétiques chez les malades, et de l’arrivée de thérapies innovantes dans ces pathologies. Cette activité relativement récente, s’appuie sur l’expérience des centres de Génétique dans autres maladies neurodégénératives à révélation tardive, en particulier celle de la Maladie de Huntington.

Méthodes : Nous avons fait une cartographie du nombre des demandes et des spécificités des pratiques dans la réalisation des TPS en France. Pour cela, nous avons adressé un questionnaire aux 21 Centres de Référence ou Compétence des Maladies du Neurone Moteur, articulés par la Filière FILSAN (SLA et Maladies du Neurone Moteur).

Résultats : 17/21 des centres ont répondu au questionnaire ; 12/17 avaient reçu, les dernières années, entre 5 et 10 nouvelles demandes de TPS pour une SLA/DFT par an, 2 centres sur 17 ont reçu entre 30 et 45 nouvelles demandes par an. Au total nous avons recensé un nombre total d’entre 230 et 440 demandes par an. Le délai d’attente pour accéder aux consultations est de 1-2 mois pour la moitié des centres et > 4 mois pour un quart des centres. Le parcours des consultants dès la première consultation jusqu’au rendu des résultats est de 2-4 mois pour 50%, et < 4 mois pour 47% des centres, avec seulement un centre déclarant une durée entre 1- 2 mois. Le principal facteur limitant identifié est l’absence de disponibilité des ressources humaines. Le plus souvent, 3 rendez-vous sont proposés avant le rendu du résultat du TPS, faisant intervenir un psychologue, un généticien et/ou neurologue spécialisé et un conseiller en génétique. Dans 30% des centres, le parcours est différent selon la maladie du cas index (SLA ou DFT). Des téléconsultations sont exceptionnellement proposées. Cinq centres ont reçu des couples en demande de DPI/DPN, cette demande concernant jusqu’à 30 couples par an en France, avec < 10 DPN réalisés. Dans 65% des centres, un suivi est systématiquement proposé aux porteurs, le plus souvent avec un neurologue et/ou un psychologue.

Au total, cette activité spécifique répond à une demande croissante, nécessite des intervenants expérimentés et est très consommatrice de ressources humaines. Nous n’avons pas identifié de grandes disparités dans la pratique entre les différents centres. Tous les ans, entre 100 et 200 nouveaux sujets porteurs à risque de SLA/DFT sont identifiés en France. L’arrivée des thérapies génétiques pour certains variants pathogènes nécessite d’être préparée. Une réflexion à l’échelle nationale ou européenne est nécessaire pour définir les modalités de prise en charge et suivi de ces sujets. Des études seront ensuite indispensables pour évaluer l’impact des différentes interventions sur cette population.

Les ataxies spinocérébelleuses (SCA) sont des maladies neurologiques de transmission autosomique dominante. Les SCAs sont soit due aux expansions CAG codantes (SCA polyQ) représentant 60 % des SCA dans le monde, ou des variants pathogènes dans des gènes variés. La présentation clinique prédominante est le syndrome cérébelleux associé à un syndrome pyramidal mais aussi à une atteinte cognitive variable. Le Syndrome Cognitivo-Affectif Cérébelleux (CCAS), a été décrit comme une atteinte cognitive spécifique et secondaire à une lésion cérébelleuse (vasculaire, traumatique, etc.) mais dans les ataxies génétiques la fréquence et la sévérité du CCAS n’est pas connue. L’échelle cognitive spécifique (le CCAS-Scale) évalue 10 domaines cognitifs distincts.

Nous avons inclus 63 porteurs (26 patients présymptomatiques, 37 patients ataxiques, avec une durée moyenne de la maladie de 6,59 ans) avec des expansions dans ATXN1, responsable de SCA1 (n=5), ATXN2/SCA2 (n=15), ATXN3/SCA3 (n=25) et ATXN7/SCA7 (n=18). Tous ont eu la CCAS Scale, une évaluation quantitative du syndrome cérébelleux, une analyse de biomarqueur (Nfl dans le plasma) et l’imagerie cérébrale (3T).

Dans les SCA polyQ nous avons pu montrer une atteinte de 3 domaines cognitifs ou plus sur 10 chez 51%. Un CCAS probable est retrouvé chez 74%. Selon le génotype la fréquence et sévérité varie : SCA2 avait une atteinte cognitive dans 61%, et SCA3 la plus sévère. L’atteinte cognitive était corrélée à la sévérité du syndrome cérébelleux (p < 0,001) et au taux de Nfl (p=0,02). Les domaines les plus touchés étaient la flexibilité mentale et la mémoire de travail, par contre le domaine visuo-spatial a été conservé.

Les résultats obtenus suggèrent la présence d'un profil cognitif spécifique chez les patients SCA polyQ. Les patients présenteraient également une atteinte comportementale, et les fonctions visuo-spatiales semblent préservées (différent du déficit cognitif observé dans d'autres pathologies avec lésions cérébelleuses). Nous allons comparer ce profil cognitif avec des  SCAs non-polyQ et celles en lien avec des variants dans SPG7.

Ce projet propose un élément de réponse au défi général du Séquençage Haut Débit en génétique moléculaire, avec le reclassement de variants de signification incertaine (VSI) en variant probablement pathogène ou pathogène. Nous avons étudié 19 VSI dans différents gènes responsables d’encéphalopathies épileptiques, ayant un effet putatif sur l’épissage prédit par les outils bio informatiques incluant SpliceAI. En effet, avec les recommandations actuelles, lorsqu’un variant ne touchant pas les sites consensus d’épissage est prédit par SpliceAI comme affectant l’épissage, il est nécessaire de réaliser un test fonctionnel pour reclasser ce VSI en variant probablement pathogène. Comme la plupart de ces gènes sont peu ou pas exprimés dans les tissus accessibles (sang notamment) nous avons utilisé un test fonctionnel pour confirmer ou infirmer la pathogénicité de ces variants en étudiant leurs effets dans un modèle hétérologue d’épissage, la technique de Minigène. La technique Minigène consiste à déterminer le profil d’épissage d’une construction plasmidique comportant le variant et l’exon correspondant dans des cellules humaines en culture après transfection. Les cellules utilisées pour la transfection étaient les cellules HeLa, et, pour 3 variants, le test Minigène a été réalisé à la fois après transfection dans des cellules HeLa, mais également après transfection dans des lignées à différentiation neuronales SH-SY5Y (plus proches morphologiquement des cellules dans lesquels sont physiologiquement exprimés ces gènes in vivo). La concordance entre la prédiction de SpliceAI et le résultat du test Minigène pour ces variants était totale pour 12 variants, partielle pour 5 variants et absente pour 2 variants. Ce projet a permis de reclasser 12 variants en probablement pathogène, ce qui a une implication directe en conseil génétique. Nous avons optimisé et simplifié le protocole de minigène (8 variants/2 semaines), mais des modifications seront encore nécessaires pour étudier dans un temps plus court un plus grand nombre de variants, et cette stratégie sera prochainement introduite en routine non seulement dans le cadre du diagnostic des encéphalopathies épileptiques mais aussi dans celui d’autres groupes de pathologies prises en charge dans le département de génétique médicale d’AP-HP Sorbonne Université.

Background: Mitochondrial membrane protein-associated neurodegeneration (MPAN) is caused by mutations in the C19orf12 gene. MPAN typically appears in the first two decades of life and presents with progressive dystonia-parkinsonism, lower motor neuron signs, optic atrophy, and abnormal iron deposits pre- dominantly in the basal ganglia. MPAN, initially considered as a strictly autosomal recessive disease (AR), turned out to be also dominantly inherited (AD). Objectives: Our aim was to better characterize the clinical, molecular, and functional spectra associated with such dominant pathogenic heterozygous C19orf12 variants.

Methods: We collected clinical, imaging, and molecular information of eight individuals from four AD-MPAN families and obtained brain neuropathology results for one. Functional studies, focused on energy and iron metabolism, were conducted on fibroblasts from AD-MPAN patients, AR-MPAN patients, and controls.

Results: We identified four heterozygous C19orf12 variants in eight AD-MPAN patients. Two of them carrying the familial variant in mosaic displayed an atypical late- onset phenotype. Fibroblasts from AD-MPAN showed more severe alterations of iron storage metabolism and autophagy compared to AR-MPAN cells.

Conclusion: Our data add strong evidence of the realness of AD-MPAN with identification of novel monoallelic C19orf12 variants, including at the mosaic state. This has implications in diagnosis procedures. We also expand the phenotypic spectrum of MPAN to late onset atypical presentations. Finally, we demonstrate for the first time more drastic abnormalities of iron metabolism

L’utilisation du séquençage de nouvelle génération dans le diagnostic de maladies génétiques entraîne l’augmentation du nombre de variants de signification incertaine (VSI) identifiés. Certains de ces variants entraînent potentiellement une anomalie d’épissage, nécessitant une caractérisation fonctionnelle. Concernant les maladies neurologiques, les études sur ARN sont limitées par la faible expression de la plupart des gènes impliqués dans le sang, et la non disponibilité du tissu concerné.

Nous avons donc développé un panel dédié à l’étude par RNAseq ciblé des gènes prédisposant à l’ensemble des pathologies neurologiques étudiées au laboratoire (n=252) : épilepsies, démences, dystonies, sclérose latérale amyotrophique, paraplégies spastiques, maladie de Charcot-Marie-Tooth, et ataxies dominantes. Pour cela, nous avons éliminé du panel 22 gènes (soit seulement 9%) bien exprimés dans le sang à partir des résultats d’une technique de RNAseq total développé au centre de génétique, pour qu’ils ne rentrent pas en compétition avec ceux présentant un faible niveau d’expression. Le design du panel sur les 230 gènes restants (séquences codantes et régions 5’UTR) a été effectué avec le logiciel SureDesign, les techniques réalisées avec le kit Sureselect XT HS2 (Agilent), et le séquençage de séries de 16 patients réalisé sur Nextseq500 (Illumina).

Le premier objectif était de déterminer le niveau d’expression de chaque gène du panel dans plusieurs types de prélèvements : paxgenes (n=19), lignées lymphoblastoïdes ou lymphocytes (n=5), et fibroblastes (n=6). Une majorité des gènes (n=151, 60%) a une couverture moyenne supérieure à 50x sur l’ensemble des exons sur les paxgene, et peut donc être analysé sur ces prélèvements facilement accessibles. 29 gènes supplémentaires (12%) peuvent être analysés sur fibroblastes. Au total, seulement 50 gènes (19%) ne peuvent pas être analysés par notre technique RNAseq sur des prélèvements issus de sang ou de biopsie de peau, et devront être étudiés par une technique ex vivo comme le minigene. Par ailleurs, la couverture des régions supérieures à 50x était très élevée, avec une moyenne de 1633x sur paxgene et 1998x sur fibroblastes, respectivement.

Le deuxième objectif était de confirmer des anomalies prédites d’épissage. Nous avons pu analyser à ce jour 20 variants sur 12 gènes différents, et détecter différents types d’effet: création d’exon cryptique, saut d’exon, rétention intronique, délétion partielle d’exons. Les couvertures élevées permettent également d’identifier des épissages physiologiques ou pathologiques minoritaires (jusqu’à 5% environ).

En conclusion, le panel pour étude par RNA seq de l’épissage de gènes impliqués dans les maladies neurologiques que nous avons développé permet d’analyser une grande majorité des gènes (80%) à partir de prélèvements facilement accessibles (sang, peau). Les fortes couvertures obtenues permettent de confirmer ou infirmer de manière fiable des effets prédits sur l’épissage.

Le Plan France Génomique (PFMG) 2025 a permis l’accès au séquençage de génomes sur tout le territoire. La préindication Maladies Osseuses Constitutionnelles (MOC) concerne toutes les ostéochondrodysplasies : fragilité osseuse, atteinte épi et/ou métaphysaire et/ou vertébrale, atteinte lytique ou condensante, prolifération anarchique du tissu osseux, et dysostoses.  L’inclusion des patients dans la préindication MOC a démarré dès la première vague de pré-indication en octobre 2019, elle est réalisée pour les patients avec panel négatif ou avec des phénotypes atypiques pour lesquels les panels disponibles ne sont pas adaptés. Il y a eu à ce jour plus de 500 prescriptions (CRMR MOC Necker : 412, autres centres : 88). Nous faisons ici le bilan des 400 premiers résultats : 124 génomes ont été rendus positifs (31%), 42 ont retrouvé un variant de signification incertaine (10%), et 234 ont été rendus non conclusifs (59%). 

Les 124 génomes positifs concernent 92 gènes différents avec un maximum de 5 patients mutés pour 3 gènes : COL2A1, FGFR3, RPL13. Huit génomes ont permis d’identifier une anomalie de structure (3 inversions, 3 grandes délétions, 1 duplication,1 translocation), 5 ont mis en évidence un variant intronique profond, et 3 ont retrouvé une disomie uniparentale (DUP).

Les variants de signification incertaine concernent 38 gènes différents. Ils comprennent des variants introniques, des variants dans des gènes non décrits en pathologie humaine retenus suite à une soumission dans Genematcher, ou des variants pour lesquels une étude de ségrégation ou un phénotypage fin des parents est en cours.

L’interprétation des génomes ne peut se faire sans un dialogue entre cliniciens et biologistes au travers de réunions dédiées permettant la confrontation clinico-biologique des résultats.

Douze dossiers n’auraient pu être résolus par une autre technique de séquençage que le génome : translocation, inversion, délétions, variants introniques, cela représente 3% des génomes analysés et 10% des génomes positifs). Le séquençage de génome a permis de faire 4 doubles diagnostics.   

L’arrivée du séquençage de génome a révolutionné le diagnostic moléculaire des MOC et permis des diagnostics n’étant pas accessibles par l’approche de séquençage de panels, d’exome ou d'ACPA.

Les Epidermolyses Bulleuses Héréditaires (EBH) sont un groupe de maladies rares caractérisées par une fragilité de la peau conduisant à la formation de bulles et d’érosions cutanées (parfois muqueuses) par désunion entre l’épiderme et le derme. Elles touchent environ 1 nouveau-né sur 20 000. Leur gravité est très variable, allant d’une gêne mineure à des formes rapidement incompatibles avec la vie en passant par des affections chroniques responsables de handicaps sévères par leurs complications infectieuses, nutritionnelles, cicatricielles, fonctionnelles voire viscérales.

On distingue trois groupes d'EBH selon le niveau de clivage dans la peau. Au sein de chacun de ces trois groupes il existe plusieurs formes cliniques d’EBH distinguées par leur symptomatologie et leur mode de transmission héréditaire.

Méthodes : Des RCP mensuelles du Centre de Référence Maladies Rares (cliniciens et infirmières) permettent l’orientation du diagnostic clinique ainsi que des avis et recommandations pour la prise en charge des patients.

Lorsqu’une biopsie cutanée est possible, la détermination du niveau de clivage par immunofluorescence est la première étape du diagnostic. Le niveau de clivage est apprécié de façon rapide et précise par l’utilisation d’anticorps dirigés contre différents constituants de la jonction dermo-épidermique. Cette étape permet une orientation de l’analyse moléculaire mais également une réponse rapide dans l’urgence de la prise en charge néonatale (pronostic vital, évolution). Des marquages spécifiques permettent parfois la validation fonctionnelle des variants de signification incertaine (VSI) identifiés lors de l’étude génétique.

L’identification des variants pathogènes responsables de la maladie permet un conseil génétique aux familles et la réalisation d’un diagnostic prénatal. Si un sous-type est diagnostiqué cliniquement et/ou histologiquement, un séquençage Sanger est réalisé. En deuxième intention ou en l’absence d’orientation, un panel de 17 gènes impliqués dans les EBH est analysé par séquençage haut débit.

Résultats : Sur la période janvier 2021- août 2023, 67 cas index ont été traités par le centre de référence. L’analyse histologique sur 14 biopsies cutanées reçues en bon état a permis d’établir un diagnostic différent de l’orientation clinique initiale dans 50% des cas, 70% ont été ensuite confirmés lors de l’analyse moléculaire. De son côté, l’analyse moléculaire des 67 cas index a permis un taux d’élucidation de 85%, dont environ 25% de résultats obtenus par NGS. Cette démarche réduit l’errance diagnostique à 3 mois en moyenne. En cas d’impasse diagnostique (15%), une demande d’analyse du génome par les laboratoires du Plan France Médecine Génomique (PFMG) est réalisée dans la préindication Génodermatose.

L’extension des études génétiques aux diagnostics différentiels des EBH et le recours à des méthodes de validations fonctionnelles des VSI permettront de réduire les impasses diagnostiques des fragilités cutanées.

Les variations des gènes COL1A1 et COL1A2, codant pour le collagène de type I, sont associées à une grande hétérogénéité phénotypique. Elles sont responsables d’un large éventail de troubles héréditaires du tissu conjonctif incluant l'ostéogenèse imparfaite (OI), quatre types de syndromes d'Ehlers-Danlos (SED arthrochalasique, classique, vasculaire et cardiaque valvulaire) et plus récemment, la notion de « COL1-related overlap disorder (C1ROD) » a émergé. Le C1ROD est une affection très rare et peu décrite, caractérisée par un phénotype chevauchant entre SED et OI. Nous décrivons ici, 16 nouveaux patients issus de 4 familles, présentant les critères diagnostiques de C1ROD. La porte d’entrée des 4 cas index était une hyperlaxité articulaire et une fragilité cutanée, laissant suspecter un SED, avec un morphotype marfanoïde chez l’un d’entre eux. La présence de sclérotiques bleutées, habituellement retrouvées dans l’OI, a conduit à réaliser une analyse génétique qui a mis en évidence 4 variants pathogène (classe 5) dans COL1A1 ou COL1A2, dont: deux jamais décrits*; un intronique dans COL1A1 entrainant un décalage du cadre de lecture précédemment décrit dans un cas d’OI; et une délétion sur COL1A2 décrite chez un cas de C1ROD. (*Le dépistage familial est encore en cours pour 6 individus d’une même famille). Parmi les apparentés, un cas d’OI a été identifié. Les autres individus présentaient un phénotype frontière entre SED et OI à minima. 13/15 individus présentaient une hyperlaxité articulaire généralisée. 14/15 présentaient des manifestations articulaires (luxations/entorses multiples) et 12/15 avaient des signes de fragilité cutanée (7 avec hyperélasticité cutanée, 3 avec cicatrices atrophiques, 11 avec tendance aux ecchymoses spontanées). 11/15 individus avaient les sclérotiques bleutées, 1/15 présentaient une anomalie de l’émail dentaire et 3/15 une hypoacousie. 5/15 individus avaient fait 1 à 3 fractures à l’âge pré-pubère, et 8/15 individus avaient fait des fractures en post-pubère dont 5 avaient une ostéoporose. 8 individus présentaient une atteinte cardiovasculaire (7 des valvulopathies mitrales ou aortiques dont 2 opérées, 4 des dilatations artérielles de l’aorte thoracique et des artères de moyen calibre) et/ou une fragilité tissulaire (hernie abdominale, prolapsus pelvien, éventration, hémorragie de la délivrance…). Cette étude illustre la grande hétérogénéité phénotypique, inter et intrafamiliale, associée aux variants des gènes COL1A1 ou COL1A2 et notamment le chevauchement clinique entre SED et OI. Il est donc important de savoir rechercher des signes d’OI à minima chez des malades se présentant comme des SED et de proposer un test génétique. Les éléments cliniques devant faire évoquer un C1ROD sont : fragilité cutanée, hyperlaxité avec instabilité articulaire, pieds plats valgus, fractures, sclérotiques bleues et hypoacousie. Une surveillance cardiovasculaire chez ces individus est importante pour prévenir d’éventuelles complications.

Malgré le nombre élevé de gènes associés aux anomalies du développement de l'œil, plus de 50 % des individus restent sans diagnostic génétique après analyse. Du fait de leurs difficultés de détection, les variants de structure (SVs), en particulier lorsqu’ils sont équilibrés, complexes ou de petite taille, ne sont pas toujours complètement analysés. Néanmoins, ces variants peuvent perturber des gènes ou leur régulation et représentent un mécanisme pathologique important.

Nous avons utilisé la cartographie optique du génome (OGM) pour rechercher des SVs dans 45 familles présentant des anomalies du développement oculaire appartement au spectre microphtalmie, anophtalmie, colobome.

Cette analyse nous a permis d’identifier des SVs affectant différents gènes ou voies de signalisation impliqués dans le développement oculaire. Parmi eux, nous avons ainsi retrouvé deux petites délétions intragénique de 4,5kb, non détectées précédemment par SNP array, en trans d’un variant faux-sens connu dans les gènes ALDH1A3 et STRA6 chez deux individus présentant une anophtalmie bilatérale. Ces deux gènes codent pour des protéines impliquées dans la voie de signalisation de la vitamine A et sont associés a des anomalies du développement oculaire de transmission autosomique récessive. Nous avons également retrouvé un SV rare et complexe en 10q23.33, correspondant à une inversion de 80kb entourée de deux délétions de 15 et 140kb, chez deux individus non apparentés. Ce SV contient notamment les gènes CYP26A1 et CYP26C1, également impliqués dans le métabolisme de la vitamine A. Enfin, l’OGM a permis une meilleure caractérisation de trois SVs de signification inconnue, déjà connus avant l’analyse, chez un individu avec une microphtalmie unilatérale : une translocation déséquilibrée entre 10q26.3 et 13q32, une duplication de 80kb sur le chromosome 11 en 5’ du gène PAX6 contenant l’élément régulateur SIMO et la délétion récurrente 16p11.2.

Cette étude montre l’importance de la recherche des SVs dans l’explorations des individus avec anomalies du développement oculaire. Elle montre aussi l’apport de l’OGM dans la détection de SV d’intérêt dans ce groupe de pathologies, créant un pont entre les techniques de CNV array et le séquençage génome entier.

Les dystrophies rétiniennes héréditaires sont la cause la plus fréquente de déficience visuelle et de cécité d’origine génétique. Elles sont liées à des anomalies génétiques affectant la fonction des photorécepteurs cônes et/ou bâtonnets. Ces pathologies sont principalement isolées, avec une atteinte limitée à la rétine, mais des formes syndromiques plus rares et graves sont possibles et sont associée à l'atteinte d'autres organes. Ainsi le gène MFSD8, a été initialement décrit dans la céroïde lipofuscinose neuronale infantile tardive (CLN), maladie neurodégénérative avec perte sévère de la vision centrale, épilepsie, déficits moteurs et cognitifs marqués, entraînant un décès précoce. Cependant, il a été récemment associé à des dystrophies maculaires (DM) non syndromiques de transmission autosomique récessive. Le gène MFSD8 code pour la protéine lysosomale CLN7 dont l’effet est peu connu. Notre équipe a identifié plusieurs patients hétérozygotes composites pour des variants du gène MFSD8. En utilisant des lignées cellulaires lymphoblastoïdes des patients atteints de DM et CLN, nous avons montré que les DM non syndromiques étaient associées à la présence de deux variants à effet modéré ou d'un variant sévère avec un variant modéré en trans, alors que les formes syndromiques étaient dues à la présence de deux variants sévères bi-alléliques. Suite à cette étude, nous avons évalué l’effet des variants sur la protéine CLN7 et ses interactants potentiels ainsi que les conséquences cellulaires des variants de MFSD8 associés aux deux pathologies dans le but d’identifier des marqueurs cellulaires et moléculaires spécifiques à la CLN et à la DM. L’analyse de l’expression et de la localisation cellulaire de la protéine CLN7 ne montre pas de différences significatives chez les patients mais un profil d'isoformes modifié selon la sévérité de la maladie. Nous n'avons pas observé de différences d'expression pour les marqueurs lysosomaux LAMP2 et CTSD chez les patients. Au niveau cellulaire, une augmentation du taux de mortalité des cellules de patients a été constatée. En microscopie électronique, des signes d’autophagie avec la présence de fingerprints, un marqueur spécifique de CLN, sont visibles chez tous les patients. En parallèle, une analyse transcriptomique par RNA-seq sur les cellules de patients a été réalisée. Les premières données obtenues montrent que des transcrits impliqués dans l’autophagie, les voies de signalisation mTor et calciques sont différentiellement exprimées chez les patients comparés aux témoins. Nos résultats suggèrent un effet des variants du gène MFSD8 dans des mécanismes impliquant la formation des vésicules et l’autophagie qui reste à démontrer. Une meilleure connaissance de ces phénomènes permettra de comprendre les mécanismes déterminant soit l'atteinte isolée, soit l'atteinte syndromique, et ainsi d’expliquer comment un même gène peut être à l'origine de phénotypes si différents, en termes de sévérité et de pronostic.

Les téloméropathies regroupent un ensemble de pathologies d’expression clinique variable ayant en commun une anomalie dans la maintenance des télomères. La protéine TIN2/TINF2 codée par le gène TINF2 appartient au complexe protecteur des extrémités télomériques. Elle interagit avec d’autres protéines du complexe télomérase, dont POT1, afin de stabiliser les extrémités télomériques.

Initialement rapportées dans les formes pédiatriques sévères, notamment dans la dyskératose congénitale (DC) (Savage et al. 2008) avec un taux important de néo-mutations, les variations monoalléliques de TINF2 ont récemment été décrites dans les formes de l’adulte et plus particulièrement dans la fibrose pulmonaire (Alder et al. 2015).

Nous avons identifié dans le LBMR des téloméropathies (Hôpital Bichat) depuis 2015, 15 patients de tout âge porteurs d’une variation (classe 4 ou 5) monoallélique dans le gène TINF2.

Un phénotype pédiatrique de téloméropathie est présent chez 10 patients avec un âge moyen au diagnostic de 5 ans. Le sex-ratio (H/F) est de 1,5. Les phénotypes de ces patients sont : une aplasie médullaire (n=5), une DC (n=4) ou un syndrome de Revesz (n=1). La taille des télomères se situe invariablement en dessous du 1^er centile.

Au niveau moléculaire, les variants sont tous localisés au niveau de l’exon 6 dans le domaine « DC ». Dans 80% des cas, la mutation touche l’acide aminé hotspot Arg282 avec 7 faux-sens et 1 frame-shift.

Un phénotype pulmonaire plus ou moins associé à une atteinte neurologique type déficience intellectuelle (n=1) ou hématologique (n=1) a été retrouvé chez les 5 patients les plus âgés, tous ayant plus de 34 ans. Tous les patients sont de sexe masculin. Une mesure des télomères montre également une taille très raccourcie ( < 1^er centile) (n=3 patients).

L’étude des variants retrouvés chez ces patients adultes met en évidence des variants de classification difficile en dehors du hotspot caractérisant les patients pédiatriques. En effet, chez les 5 cas index 3 variations faux-sens sont localisées dans l’exon 6 mais 1 seule dans le domaine « DC ». Les 2 autres variants faux-sens sont localisés dans l’exon 3 au niveau du domaine « TRFH – Telomeric Repeat Factor Homology ».

Des données d’autres centres référents de téloméropathies suggèrent que les patients TINF2 présenteraient dans leur sang un mécanisme de sauvetage somatique (ou SGR – somatic genetic rescue) (Revy et al. 2021) entre autre indirect sur le gène POT1 (Gutierrez et al. 2021).  

Finalement, nous mettons en évidence dans une cohorte de patients présentant une variation dans le gène TINF2, un phénotype de téloméropathie variable selon la localisation du variant : comme rapporté dans la littérature, nous confirmons chez les patients pédiatriques le hotspot mutationnel « DC ». Chez les adultes, les variations sont localisées en revanche hors de ce locus. La recherche de SGR chez nos patients adultes permettra de mieux caractériser ces patients et le retentissement clinique.

Introduction

La maladie rénale chronique (MRC) de l'adulte peut être associée à une microangiopathie thrombotique (MAT). Dans un certain nombre de cas, même au terme d'une enquête étiologique poussée incluant la recherche de variants dans les gènes de régulation de la voie alterne du complément, il n'est pas possible d'aboutir à un diagnostic uniciste. Les MAT complément -dépendantes (variations pathogènes dans CFH, CFI, CD46, C3, CFB, CFHRs) est une maladie rare (syndrome hémolytique et urémique atypique, SHUa, ORPHA :2134), touchant 50 nouveaux patients par an en France. Un traitement par Eculizumab a transformé le pronostic depuis 2013. Une analyse génétique systématique des MAT pourrait mieux préciser la prévalence de la maladie SHUa en particulier chez l’adulte. Le Whole Exome Sequencing (WES), pourrait avoir un intérêt dans ces formes cliniques comparé à l’étude Panel.

Description

Étude de cohorte bicentrique prospective.

Méthodes

Nous avons inclus tous les patients consécutifs ayant eu un WES réalisé dans le cadre du soin courant entre le 10/10/2017 et le 31/12/2022 dans le département de Néphrologie de Sorbonne Université (sites Tenon et Pitié-Salpêtrière) devant une MRC de cause inconnue ou incertaine. Le recueil des caractéristiques cliniques - notamment la présence de MAT histologique et/ou biologique - est fait de manière prospective par le médecin prescripteur au moment de la prescription. Les données sont consolidées lors de la réunion de concertation pluridisciplinaire analysant les résultats du séquencage.

Résultats obtenus ou attendus

Sur la période d'étude, 1413 patients ont bénéficié d'un WES et 153/1413 (11%) présentaient ou avaient présenté une MAT. Parmi eux, l'analyse par WES a permis d'identifier un variant expliquant le phénotype rénal - selon la classification de l'American College of Medical Genetics and Genomics - dans 20/153 (13%) des cas. 13/20 (65%) des diagnostics portés n'impliquaient pas les gènes de régulation de la voie alterne du complément : néphronophtises, n=5; collagènes de type 4, n=2; MMACHC, UMOD, IFT140, SOX18, TREX1, WT1, n = 1. La plupart était rate par le panel de référence MAT.

Conclusion

Dans cette étude de cohorte prospective, l'analyse par Whole Exome de 153 patients présentant une MRC associée à une MAT sans diagnostic étiologique évident en premier lieu, a permis de poser un diagnostic dans 20/153 (13%) des cas. 13/20 (65%) des diagnostics portés n'impliquaient pas la voie alterne du complément, expliquant pourquoi l’étude panel était négative, chez ces patients adultes avec atteintes rénale sévère.

Introduction: Paradoxical increase of GH following oral glucose load has been described in ~30% of patients with acromegaly and has been related to the ectopic expression of the glucose-dependent insulinotropic polypeptide (GIP) receptor (GIPR) in somatotropinomas. Recently, we identified germline pathogenic variants and somatic loss of heterozygosity of lysine demethylase 1A (KDM1A) in patients with GIP-dependent primary bilateral macronodular adrenal hyperplasia with Cushing’s syndrome. The ectopic expression of GIPR in both adrenal and pituitary lesions suggests a common molecular mechanism. We, therefore, searched for genetic abnormalities of KDM1A in somatotroph pituitary adenomas.

Methods: We collected somatotropinoma specimens from acromegalic patients followed in two tertiary endocrine centers in France and one in Italy. Somatic DNA was studied by targeted exome sequencing and array-CGH. GIPR and KDM1A expression were quantified in the tumors using digital droplet PCR.

Results: 146 patients were included, and 72.6 % had a classic pathological GH response after oral glucose load, whereas 27.4 % displayed a paradoxical rise in GH concentrations. Amongst the 146 somatotropinomas specimens analyzed, no tumor harbored a KDM1A pathogenic variant. Nonetheless, we identified a recurrent 1p deletion encompassing the KDM1A locus in 29 patients. Paradoxical rise of GH and higher GIPR expression were more prevalent amongst patients displaying KDM1A haploinsufficiency compared to those with 2 copies of KDM1A (p=0.0166 and p < 0.0001, respectively). Further, KDM1A expression was lower and was associated with higher GIPR in somatotropinomas from patients with KDM1A haploinsufficiency than in samples without KDM1A copy number variation (KDM1A expression: 4.47 ± 2.49 vs. 8.56 ± 5.62, p < 0.0001 and GIPR expression: 1.09 ± 0.92 vs.0.43 ± 0.51, p=0.0012).

Discussion: We did not identify KDM1A genetic variants in a large cohort of acromegalic patients independently of their GH response pattern to oral glucose loading. However, we identified a loss of one KDM1A copy due to chromosome 1p deletion in a subset of somatotropinomas harboring higher levels of GIPR transcripts than in adenomas diploid for the KDM1A locus. If KDM1A haploinsufficiency leads to (partial) transcriptional derepression at the GIPR locus and a paradoxical rise of GH after glucose load warrants further investigations.

Nous rapportons un des premiers cas de nourrisson atteint de mucoviscidose dont la mère était tout au long de sa grossesse sous KAFTRIO®. Ce traitement est un modulateur de la protéine CFTR associant trois molécules élexacaftor/ivacaftor/tezacaftor et qui restaure partiellement la fonction du CFTR.

La mère de l’enfant, homozygote pour le variant F508del, a commencé à prendre le KAFTRIO® en octobre 2021. Dans le cadre d’un projet parental les parents du bébé ont consulté dans le passé une conseillère en génétique et le père s’est avéré être hétérozygote pour le variant F508del. Sous Kaftrio la mère n’a pas eu de problème de fertilité avec un début de grossesse 3 mois après l’arrêt de la contraception. Le diagnostic prénatal à 13 SA a révélé une homozygotie F508del chez le fœtus. La balance bénéfices/risques pour la mère était en faveur du maintien du Kaftrio pendant la grossesse. Lors du suivi de grossesse aucune anomalie n’a été mise en évidence sur les échographies anténatales hormis une légère hyperéchogénécité intestinale à 18 SA qui a disparu par la suite. La vésicule biliaire notamment a été visualisée.

L’enfant est né à 39 SA. Un dépistage néonatal a été fait à 3 jours de vie et s’est révélé normal avec une trypsine immunoréative à 14,7 ug/L. Une élastase fécale prélevée à la maternité est revenue aussi normale alors que 98 % des patients homozygotes pour la F508del présentent une insuffisance pancréatique à la naissance.

Dans la littérature Il a été rapporté dans des modèles animaux que la trithérapie traversait la barrière placentaire. Aussi l’exposition in-utéro au Kaftrio chez ce bébé expliquerait l’élastase normale à la naissance et par conséquent un retard dans l’apparition d’un dysfonctionnement pancréatique.

Ce bébé a été pris en charge par le CRCM dès la naissance. L’évaluation de l’exposition anténatale au Kaftrio n’a pas révélé d’impact sur la fonction hépatique ni d’opacité au niveau du cristallin. Sa fonction pancréatique s’est rapidement détériorée dès les premiers mois, nécessitant une supplémentation en enzymes pancréatiques dès le premier mois de vie.  Les autres traitements préventifs notamment la kinésithérapie respiratoire la supplémentation en vitamines ont étaient mis en place dès la maternité. Actuellement âgé de 7 mois il a une bonne croissance staturo-pondérale, pas de symptômes pulmonaires. Le dosage de l’élastase fécale est effondré et son test de la sueur positif.

Grace aux améliorations de la fonction pulmonaire, l’observatoire national note une augmentation significative du nombre de grossesses sous trithérapie. Cette dernière passant la barrière placentaire le dépistage néonatal a été dans ce cas décrit faussement négatif. Le risque de retard diagnostic dans les situations ou les couples ne sont pas demandeurs de diagnostic prénatal doit inciter les pédiatres et obstétriciens à rester vigilants sur le suivi des grossesses chez les femmes sous modulateurs. 

Le syndrome d’hypoplasie du cœur gauche est un syndrome malformatif caractérisé par un développement incomplet du cœur gauche associé à des anomalies de la valve mitrale, de la valve aortique et/ou de l’aorte ascendante. Son expression est congénitale avec une morbidité et mortalité importantes et il nécessite souvent une prise en charge chirurgicale précoce par procédure de Fontan. Les étiologies moléculaires des hypoplasies du cœur gauche ne sont pas encore élucidées.

RBFOX2 est un gène candidat récemment décrit dans les cardiopathies et principalement dans les hypoplasies du cœur gauche. Son implication a été suspectée suite à des modèles murins porteurs de variants perte de fonction de RBFOX2 et présentant un phénotype d’hypoplasie du cœur gauche (McKean et al. 2016). Au niveau moléculaire, son rôle a été décrit dans l’épissage alternatif tissu-spécifique et la polyadénylation alternative notamment vis-à-vis de gènes impliqués dans la régulation et l’adhésion cellulaires. La protéine RBFOX2 est conservée phylogénétiquement et possède plusieurs domaines protéiques déjà identifiés dont un domaine de reconnaissance de l’ARN.

Nous rapportons ici une cohorte internationale de 15 patients issus de 8 familles différentes porteurs de variants perte de fonction ou de délétions hétérozygotes du gène RBFOX2 et atteints de cardiopathies congénitales incluant principalement une hypoplasie ou une atteinte du cœur gauche. Parmi ces patients, 3 cas sporadiques avaient été décrits isolément dans la littérature, atteints d’hypoplasie du cœur gauche (Glessner et al. 2014, Homsy et al . 2015, Vermat et al. 2016). Dans notre cohorte, la totalité des patients porteurs de variants dans RBFOX2 présente une cardiopathie congénitale (pénétrance complète) dont 10 patients avec une hypoplasie du ventricule gauche (66%) et 7 avec une coarctation de l’aorte (46%). Les cas familiaux ont une transmission autosomique dominante avec expressivité variable. En effet, au sein d’une même famille, on peut observer un spectre phénotypique allant de l’hypoplasie du ventricule gauche à la coarctation de l’aorte isolée en passant par la non-compaction isolée du ventricule gauche. Durant ce travail, nous avons aussi recueilli toutes les délétions ou les variants perte de fonction décrits dans les différentes bases de données patient et témoin ce qui nous permet de mieux caractériser le mécanisme derrière cette haploinsuffisance et notamment un phénomène de codon initiateur alternatif initialement décrit par Arya et al. 2014 et ayant un impact sur la pathogénicité des délétions.

Ce travail a pour but de préciser le phénotype lié à l’haploinsuffisance du gène RBFOX2, d’établir des corrélations génotype/phénotype, de caractériser la pénétrance et l’expressivité des variants identifiés, par l’étude d’une première cohorte internationale de 15 patients.

Contexte : Les cardiomyopathies héréditaires sont des pathologies du muscle cardiaque, majoritairement monogéniques, de transmission autosomique dominante. Des investigations moléculaires sont proposées aux patients atteints des cardiomyopathies d’allure primitive afin d’identifier le gène causal, permettant de préciser le conseil génétique et la surveillance cardiologique pour les autres membres de leur famille. Près de 50% des familles restent en impasse diagnostique malgré la réalisation d’un panel de gènes dédié. Dans le cadre du PFMG 2025, il a été proposé d’intégrer les analyses génomiques dans la pratique clinique afin de réduire l’errance diagnostique et d’optimiser la prise en charge des patients et de leur famille. Nous dressons ici l’état des lieux de la pré-indication « cardiomyopathie familiale ».

Méthode : Les données ont été obtenues à l’aide des logiciels Spice (laboratoire SEQOIA - recueil au 15/06/23), Hygen (laboratoire AURAGEN - recueil au 15/07/23), et Rofim (RCP cardiomyopathies nationales), en collaboration avec les responsables des laboratoires, les biologistes interprétateurs et les coordinateurs des RCP nationales. 

Résultat : Au total, 168 dossiers ont fait l’objet d’une discussion en RCP nationale, nous notons 13 dossiers supplémentaires probablement présentés en RCP locale. Sur ces 181 dossiers, les CMD (79) et CMH (59) étaient majoritairement concernées puis les NCVG/CMD (21), les CAVD (16), les CMR (1), CMP histiocytoide (1) et 4 données manquantes. A ce jour, 79 résultats de génome sont disponibles avec 7 diagnostics moléculaires établis et a minima 6 autres dossiers en cours d’analyse. Nous relevons 50 dossiers validés en RCP nationale pour lesquels les résultats ne sont pas disponibles, les prélèvements sanguins nécessaires à l’analyse de génome sont pour la plupart en cours d’organisation. Pour finir, 46 dossiers ont fait l’objet d’un refus en RCP nationale, certains pourraient faire l’objet d’une nouvelle discussion si des éléments complémentaires étaient apportés.

L’analyse en génome a permis d’établir un diagnostic moléculaire pour 9% des dossiers analysés, notamment en identifiant des variants dans différents gènes tels que MYBPC3, DSP, FHOD3, TBX20 et dans un nouveau gène d’intérêt avec une transmission autosomique récessive. A noter qu’il a été identifié pour 18 familles des variants de signification incertaine, pour certains nécessitant une étude de ségrégation afin de conclure sur le lien de causalité de ce variant avec la maladie.

Conclusion : Cette étude pilote montre que l’analyse du génome identifie une cause chez 9% des familles avec cardiomyopathies et panel préalablement réalisés et négatifs. Ces résultats permettront notamment de mettre à jour les panels diagnostiques utilisés en pratique clinique.

Remerciements : This research was made possible through access to the data generated by the 2025 French Genomic Medicine Initiative.

A l'état hétérozygote composite ou homozygote, les variations pathogènes du gène MYL2, situé sur le chromosome 12, constituent une cause rare de myopathie myofibrillaire de début infantile avec cardiomyopathie. Les variations pathogènes du gène MYL2 sont également la cause de moins de 3% des formes dominantes de cardiomyopathie hypertrophique. A ce titre, il fait partie du panel de 16 gènes défini par les laboratoires de la filière Cardiogen (filière nationale de santé maladies cardiaques héréditaires ou rares) pour l'indication "cardiomyopathie hypertrophique " et du panel élargi de 71 gènes "cardiomyopathies".

Le cas index est un nourrisson de 5 mois, troisième enfant d'un couple non apparenté, préalablement suivi pour une hypotonie axiale franche isolée, ayant présenté un tableau de choc cardiogénique avec un diagnostic cardiologique s'orientant initialement plus vers une myocardite qu'une cardiomyopathie. Des prélèvements ont été réalisés pour 1/ étude par NGS du panel élargi cardiomyopathie, 2/ biopsie musculaire (qui a montré un aspect de myopathie congénitale par disproportion des types de fibre), 3/ CGH array (qui n'a pas détecté de déséquilibre chromosomique pathogène connu). Dans notre laboratoire, le wetlab du NGS utilise un panel de 116 gènes incluant les 71 gènes du panel élargi cardiomyopathie. L'analyse bio-informatique permet de restreindre la liste des gènes analysés à ceux de l'indication.

Chez le cas index, l'étude du panel élargi cardiomyopathie a révélé la présence de la variation pathogène du gène MYL2 NM_000432.3:c.45_46delinsT/p.(Asn16Thrfs*34) à l'état homozygote, un génotype compatible avec le phénotype observé. La variation n'étant pas répertoriée dans la base de données GnomAD, sa présence à l'état homozygote chez un cas index issu d'une union non consanguine était surprenante. L'étude des parents a révélé que seul le père était porteur du variant à l'état hétérozygote.

Un ré-examen du fichier .vcf de résultats, incluant tous les gènes du panel (116 gènes) a montré une homozygotie pour tous les SNP des huit gènes situés sur le bras court (gènes CACNA1C, KCNA5, ABCC9 et PKP2) et sur le bras long (TMPO, MYL2, PTPN11 et TBX5) du chromosome 12. Compte-tenu de ce résultat et de ceux obtenus chez les parents, nous avons fait l'hypothèse d'une isodisomie uniparentale d'origine paternelle. Le SNParray réalisé sur l'ADN du cas index a montré en effet une perte d'hétérozygotie sur la totalité du chromosome 12, confirmant l'isodisomie uniparentale d'origine paternelle qui résulte probablement d'une correction de monosomie 12, a priori accidentelle.

Même si le NGS sur panel de gènes ciblés n'est pas l'outil dédié à la détection des isodisomies, un résultat d'homozygotie inattendue doit inciter à un examen attentif des résultats du fichier .vcf.

Background: With the development of advanced sequencing techniques, genetic testing has emerged as a valuable tool for the work-up of non-ischemic sudden cardiac arrest (SCA).

Aims: To evaluate the effectiveness of genetic testing in patients with unexplained SCA, according to clinical phenotype.

Methods: All patients who underwent molecular genetic testing for non-ischemic SCA with no left ventricular cardiomyopathy between 2012 and 2021 in two French university hospitals were included.

Results: Of 66 patients (mean age 37±12 years, 54% men), 32% (n=21) carried a genetic variant, 18% (n=12) with a pathogenic or likely pathogenic (P/LP) variant and 14% (n=9) with a variant of uncertain significance (VUS). Among patients with no phenotypic clues (n=37/66, 56.1%), genetic testing identified a P/LP variant in 24.3% (n=9/37) and a VUS in 13.5% (n=5/37), mainly in SCN5A (n=3) and RYR2 (n=3). None of the 9 patients with phenotypic evidence of channelopathies had P/LP variants, but 2 had VUS in RYR2 and NKX2.5. Among the 20 patients with suspected arrhythmogenic cardiomyopathy, 3 P/LP variants (15%) and 2 VUS were found in DSC2, PKP2, SCN5A and DSG2, TRPM4, respectively. Note that genetic testing was performed sooner after cardiac arrest (p < 0.001) and results were obtained more rapidly (p=0.02) after versus before 2016.

Conclusion: This study highlights the utility of molecular genetic testing with a genetic variant of interest identified in one-third of patients with unexplained SCA. Genetic testing was beneficial even in patients without phenotypic clues, with one-fourth of patients carrying a P/LP variant that could have direct implications. 

Contexte : L'hypercholestérolémie autosomique dominante (ADH) est une maladie monogénique fréquente (1/313)¹ caractérisée par une élévation isolée des taux de LDL-cholestérol en raison d’un défaut de catabolisme. Ainsi, l'ADH est associée à un risque élevé de maladies cardiovasculaires en raison du développement précoce d'athérosclérose. Dans près de 80 % des cas, l'ADH est due à un variant pathogène dans l’un des 4 gènes majeurs (LDLR, APOB, APOE, PCSK9). Les 20 % restants (ADH/M-) n’ont pas de défaut dans ces gènes et ne peuvent bénéficier d’un diagnostic génétique. Précédemment, il a été montré que l'inhibition des gènes codant pour le spliceosome-U2 (S-U2) réduit l'internalisation des LDL dans des lignées cellulaires Huh-7 en raison d’un mécanisme de régulation post-transcriptionnel du récepteur des LDL². Ces résultats suggèrent que les gènes du S-U2 sont des candidats qui pourraient expliquer une partie des cas ADH/M-.

Objectif : Notre objectif était de séquencer les gènes du S-U2 dans une cohorte française de patients ADH/M-. En parallèle, nous avons étudié l’internalisation des LDL dans les cellules de patients porteurs de variants prédits pathogènes dans ces gènes.

Méthodes : Les 11 gènes du S-U2 ont été explorés par séquençage nouvelle génération chez 476 patients ADH/M- recrutés grâce au Réseau Français ADH selon un bilan lipidique et un score Dutch Lipid Clinic Network > 6 (ADH probable et certaine).  Les variants sont sélectionnés selon (1) une profondeur de lecture > 15, (2) une fréquence < 1 % dans GnomAD³ et (3) un effet prédit délétère selon les outils de prédiction CADD (score > 20)⁴ et/ou MutationTaster⁵.
L’étude du phénotype cellulaire par cytométrie en flux a été réalisée sur des lymphocytes-B des patients immortalisés par le virus d’Epstein-Barr.

Résultats : Le séquençage a révélé 24 variants exoniques rares prédits délétères dans 7 gènes du S-U2 chez 35 patients. Ces variants présentent une fréquence plus élevée dans la cohorte ADH/M- que dans la population générale selon gnomAD[MV1] . Par exemple, le variant p.(Arg642Pro) dans SF3A1 est identifié avec une fréquence de 1,05 % dans notre cohorte ADH/M-, soit vingt-et-une fois la fréquence dans la population totale de GnomAD. Pour les variants p.(Ala67Thr) dans RBM25 et p.(Pro675His) dans SF3A1, un élargissement familial a été réalisé et a montré une ségrégation avec le phénotype ADH dans chaque famille. Les cellules des patients porteurs du variant RBM25 ont montré une diminution du nombre de récepteurs aux LDL en surface ainsi que de l’internalisation des LDL.

Conclusion : Ces résultats pourraient révéler les gènes du S-U2 comme de nouveaux facteurs génétiques de l’ADH.

References          
1. Beheshti et al. J Am Coll Cardiol. 2020;75(20):2553-2566. 
2. Zanoni et al. Circ Res. 2022;130(1):80-95.              
3. https://gnomad.broadinstitute.org/

4. https://www.mutationtaster.org/

5. https://cadd.gs.washington.edu/snv

La neuropathie optique héréditaire de Leber (NOHL) est une maladie neurodégénérative primaire du nerf optique et l'une des maladies mitochondriales les plus fréquentes. Elle se caractérise par une phase aigüe ou subaiguë de perte d'acuité visuelle, suivie d'une phase chronique de perte de fibres optiques. La maladie a été attribué à des variants du génome mitochondrial, en particulier les mutations m.3460G > A, m.11778G > A et m.14484T > C respectivement localisées dans les gènes ND1, ND4 et ND6. Mais, il existe de nombreux cas de NOHL qui échappent à la détection de mutation dans le génome mitochondrial, même lorsque celui-ci fait l’objet d’analyses de dernière génération. En 2016, nous rapportions l’identification de mutations bialléliques dans le gène  NDUFS2 chez trois frères souffrant d’une authentique NOHL. Pour la première fois, l'implication de l’ADN nucléaire était évoquée dans des cas de NOHL non-résolus par le séquençage du génome mitochondrial. Cette hypothèse a été confirmée de manière retentissante en 2021 et 2022, avec les publications de mutations bialléliques dans les gènes nucléaires DNAJC30, NDUFA12 et MCAT à l’origine de LHON non résolus, en très grande majorité masculins, les femmes apparentées porteuses des mutations étant le plus souvent asymptomatiques.

La découverte de cas de NOHL autosomique récessive (arNOHL) met un terme à l’énigme ayant longtemps intrigué la communauté scientifique des cas de LHON sans mutation du génome mitochondrial et rompt avec le dogme d’une transmission maternelle exclusive. Elle définit un nouveau paradigme ophtalmo-génétique qui doit être considéré chez les individus manifestant un phénotype NOHL, mais dont le diagnostic moléculaire n'est pas concluant. Les DNAJC30, NDUFS2, NDUFA12 et MCAT doivent être étudiés chez ces individus, sachant que d'autres gènes d’arNOHL restent à découvrir.

Ces dernières années, la génétique moléculaire a été complètement révolutionnée par l'émergence des technologies de séquençage haut débit (NGS, Next Generation Sequencing) qui ont permis d'augmenter rapidement le diagnostic génétique des maladies mitochondriales (MM), de 10% à 20% dans l'ère pré-NGS, à plus de 50 % dans certaines cohortes.

Les MM sont secondaires à des variants pathogènes de l’ADN mitochondrial (ADNmt) ou de gènes nucléaires. Le séquençage haut débit de l'ADNmt est désormais systématiquement utilisé dans les laboratoires de diagnostic, cependant, le NGS a également conduit à l'identification d'un nombre exponentiel de variants de signification inconnue (VSI) et leur interprétation reste difficile. Un des critères majeur, permettant de classer les variants de l’ADNmt de bénin à pathogène, est une bonne corrélation du taux d’hétéroplasmie d’un variant avec l’atteinte tissulaire ou cellulaire. En effet, les mutations de l’ADNmt sont en général hétéroplasmiques, ce qui correspond à la coexistence de molécules normales et mutées dans une même cellule ou un même tissu, les tissus les plus atteints ayant un fort taux d’hétéroplasmie. De même, la présence d’un fort taux d’hétéroplasmie dans les fibres musculaires présentant un déficit en cytochrome oxydase (COX-négatives), contrairement aux fibres sans déficit, est un argument fort en faveur de la pathogénicité d’un variant.

Nous avons développé une nouvelle technique de quantification d’hétéroplasmie sur fibre musculaire unique, par NGS, afin de faciliter son utilisation en routine. Ainsi nous avons pu reclasser 4 nouveaux variants de signification inconnue affectant des ARNt. De plus, nous avons montré l’utilité de cette technique chez des patients présentant des variants pathogènes à des faibles taux d'hétéroplasmie pour lesquels l’implication de ces variants dans la pathologie du patient peut aussi être interprétée comme une découverte fortuite.

La mise en place de cette nouvelle technique plus rapide et facile d’utilisation a permis d’éviter une impasse diagnostique chez ces patients atteints de maladie mitochondriale et ainsi améliorer leur prise en charge, y compris le traitement et le conseil génétique.

Les maladies mitochondriales, caractérisées par un dysfonctionnement de la chaine respiratoire, forment un groupe de pathologies très hétérogène cliniquement et génétiquement, et pour lesquels le séquençage de l’exome ou de génome montre un réel intérêt. En effet, pour plus de la moitié des patients avec suspicion de maladie mitochondriale, testés par ces deux stratégies, le gène responsable s’avère codant pour une protéine non mitochondriale ou non inclus dans les panels de diagnostic des mitochondripathies. Nous rapportons ici 8 patients issus d’une grande famille suspectés d’avoir une maladie mitochondriale devant l’atteinte multisystémique. Ils présentaient une encéphalopathie précoce, un retard de croissance, une dystonie et un retard de développement sévère. L'analyse biochimique a révélé une altération de l'activité et de l'assemblage des complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale pour les patients testés. Le séquençage de l’exome ou du génome chez 2 patients a permis l’identification du variant pathogène c.-273_-271delTCA (mutation fondatrice, Hamilton et al. 2017) dans le promoteur du gène UFM1 à l’état homozygote. L’analyse familiale par séquençage Sanger des ADN disponibles a montré que tous les patients étaient homozygotes pour ce variant sauf un qui était hétérozygote. L’analyse du génome de ce dernier a révélé de manière surprenante la présence, en trans du variant dans le promoteur, d’une indel affectant la jonction intron-exon5 du gène UFM1. Il s’agit d’un nouveau variant complexe avec une délétion de 22 nucléotides et une insertion de 17 nucléotides. UFM1 (ubiquitin-fold modifier 1) est une protéine de 9,1 kDa qui joue un rôle d’ufmylation (liaison d’UFM1 aux protéines cibles). Le rôle de l’ufmylation dans le neurodéveloppement et la neurodégénérescence n’est pas encore bien connu. L’identification d’un variant pathogène dans UFM1 chez des patients présentant un déficit de la chaine respiratoire est intrigante et soulève la question de la relation entre ce gène et les mitochondries. Très peu de cas sont décrits dans la littérature. Des études explorant le lien entre UFM1 et la fonction mitochondriale pourraient aider à une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels les défauts de l'UFMylation conduisent à une encéphalopathie précoce et à d'éventuelles pistes thérapeutiques.

Contexte : Les collagénopathies rénales liées aux anomalies du collagène IV (COL4R) représentent la seconde cause d’insuffisance rénale chronique terminale (IRCT) d’origine génétique par absence et/ou anomalie d’une des 3 chaînes de la membrane basale glomérulaire (COL4A3, COL4A4, COL4A5). La multikystose rénale (MKR) a été observée dans d'autres collagénopathies (COL4A1). Nous avons étudié la présence de la MKR dans les COL4R.

Méthode : Etude de cohorte de COL4R multicentrique, rétrospective incluant des patients avec une variation de classe IV ou V selon les critères de l’ACMG-AMP sur les gènes COL4A3, COL4A4 et COL4A5. La présence d’une MKR a été définie par la présence d’au moins 3 kystes dans chaque rein décrit sur les comptes rendus d’imagerie rénales. Les données ont été recueillies à partir des dossiers médicaux et des registres de génétique de chaque centre (CHU de Bordeaux, Lille, Marseille et Paris-Tenon). Un variant été défini à effet « nul » lorsqu’il était responsable d’un décalage du cadre de lecture, atteinte d’un site d’épissage, non-sens, ou délétion de plusieurs exons.

Résultats : Parmi les 271 patients inclus, 38 (14%) présentaient une MKR, sans variation détectées dans le panel in silico des gènes associés aux néphropathies kystiques séquencé par Whole Exome Sequencing (WES). Les patients MKR développaient significativement plus d’IRCT (56.76% vs 37.56%, p=0.0276) mais avec un âge de diagnostic plus tardif (64.9 (55.1-73.9) vs 48.2 (42.2-52.8) ans, p<0.0001). Les COL4R autosomiques avaient tendance à être surreprésentées (78.1% vs 67.2, p=0.05) et les variations hétérozygotes à effet « nul » étaient significativement associées à la MKR (31.6 vs 15.6 %, p=0.05).  L’hématurie microscopique était plus rare dans ce groupe (30.6% vs 11.7%, p=0.0035). Il n’y avait pas de différence entre les groupes en termes de protéinurie, d’atteinte ophtalmologique ou auditive. 2/37 patients ont présentaient un anévrisme de l’aorte ou de ses branches chez les MKR versus 3/223 patients. Les facteurs de risques cardiovasculaires classiques – le sexe masculin (p=0.002), le tabagisme (p=0.03), l’obésité (p=0.006), la dyslipidémie (p=0.0001) et l’HTA (p=0.008) étaient plus fréquents dans le groupe MKR. Sur le plan histologique, les patients MKR présentaient une atteinte vasculaire significativement plus importante (40 vs 9.1%, p=0.006) avec notamment plus d’endartérite fibreuse (p=0.0064), plus d’athérosclérose (p=0.01), et plus d’artériolosclérose (p=0.013).

Conclusion : Nous rapportons pour la première fois un phénotype multikystique dans 14% des cas de COL4R. Le phenotype de MKR semblait correspondre à une présentation de néphropathie vasculaire tardive dont le pronostic rénal était plus favorable, notamment devant la survenue plus tardive de l’IRCT. La physiopathologie sous-tendant cette association, de même que la nature de ces kystes, mériteraient d’être étudiée de manière plus approfondie au travers de futures études fondamentales.