SLITRK2 est une protéine transmembranaire exprimée au niveau des neurones postsynaptiques qui régule la croissance des neurites et le maintien des synapses excitatrices. Dans cette étude, nous rapportons des variations rares de SLITRK2, localisé sur le chromosome X, identifiées en exome chez des patients atteints de troubles du neuro-développement (TND). Ces variants comprenaient un variant non-sens (p.Glu461*) et six variants faux-sens qui n'ont pas été rapportés précédemment à l'état hémizygote dans les populations de la base de données gnomAD. Quatre variants sont apparus de novo chez les patients ou chez la mère de l’un d’entre eux, et trois variants ont été hérités de mères asymptomatiques. Les individus porteurs de ces variants présentaient une déficience intellectuelle de sévérité variable, un retard de langage, une démarche instable pouvant s’associer à une spasticité des membres inférieurs, une épilepsie et des manifestations neuropsychiatriques, notamment une anxiété majeure et un trouble du spectre de l’autisme. Des études fonctionnelles ont montré que les variants Leu74Ser, Pro374Arg, Arg426Cys et Glu461* induisaient, dans des cellules HEK293, une altération de la localisation des protéines SLITRK2 mutantes à la membrane et de leur capacité à interagir avec leur ligand extracellulaire, PTPδ. L’analyse de neurones d’hippocampe issus de souris knock-out conditionnelles (cKO), chez lesquelles Slitrk2 a été inactivé dans le système nerveux central, a révélé une altération de la transmission synaptique. Cette altération, caractérisée par une diminution de l’amplitude des courants synaptiques excitateurs, est reversée par l’expression de la protéine SLITRK2 humaine mais pas par celle des protéines mutantes Leu74Ser, Pro374Arg, Arg426Cys, Thr312Ala et Glu461*. De plus, nous avons pu montrer que les souris Slitrk2 cKO pour Slitrk2 présentaient une altération de la mémoire à long terme et une démarche anormale, récapitulant un sous-ensemble de caractéristiques cliniques des patients porteurs de variations du gène SLITRK2. Collectivement, ces données suggèrent que le gène SLITRK2 est impliqué dans une nouvelle forme de TND lié à l'X causée par la perturbation de diverses facettes de la fonction de SLITRK2.

L’évolution rapide des connaissances scientifiques dans le domaine des maladies rares et en particulier pour les troubles du neurodéveloppement ainsi que l’amélioration continue des outils bioinformatiques  rendent indispensables la réanalyse périodique des études pangénomiques telles que le séquençage d’exome et de génome.

Nous avons réanalysé les données de séquençage d’exome de 49 patients atteints d’une trouble du neurodéveloppement pour lesquels un résultat négatif ou un variant de signification inconnue avait été rendu. Le taux diagnostic initial était de 39% (31/80). La réanalyse a été réalisée entre 18 et 36 mois après la première analyse. Ceci a permis d’identifier 5 nouveaux diagnostics ce qui représente 10% des dossiers réanalysés. Pour 3 d’entre eux, il s’agissait de gènes décrits après la première analyse (FOXP4 : +10 mois, AP2M1 : +13 mois, AGO2 : +22 mois). Les 2 autres ont été identifiés grâce à une amélioration du logiciel utilisé permettant de mettre en évidence une délétion hétérozygote de plusieurs exons dans le gène CNOT2 et un variant hérité d’un parent dans le gène MAGEL2. Cette réanalyse a donc permis de passer d’un rendement diagnostic de 39% à 45%.

La réanalyse régulière pose des problèmes en termes de temps puisque le nombre d’exomes à réanalyser est croissant, notre plateforme de bioinformatique a donc développé un outil (PolyBTF) permettant de rechercher automatiquement tous les 3 mois, les patients porteurs de variants nouvellement décrits dans les bases de données de patients HGMD et ClinVar. Ceci est particulièrement utile pour les variants en dehors des régions codantes des gènes déjà connus et pour les variants récurrents des nouveaux gènes ce qui était le cas pour les variants des gènes FOXP4 et AP2M1. La plateforme a également développé un outil (PolyDejaVu) permettant de rechercher dans un gène donné tous les variants présents dans notre base de données, nous permettant de rechercher des patients éventuellement porteurs de variants dans des gènes nouvellement décrits.

Avec la montée en puissance des études pangénomiques, il devient indispensable de développer des outils informatiques d’aide à la réanalyse afin d’optimiser au maximum les données génomiques de nos patients.

Le gène RTTN (OMIM 614833) code pour la protéine rotatine, cruciale pour l’établissement de l’asymétrie droite-gauche et la rotation axiale de l’embryon. Cette protéine est requise lors des premières étapes d’élongation et maturation des centrioles, régule le cycle cellulaire et participe à la formation du cil primaire, organelle à la surface des cellules qui fonctionne comme une antenne relais de nombreux signaux essentiels au développement et à l’homéostasie tissulaire.

Les variants pathogènes de RTTN sont associés à un syndrome autosomique récessif associant une petite taille, un retard de développement, une microcéphalie avec anomalies de gyration et une épilepsie. Ici, nous rapportons deux cas, celui d’un fœtus présentant une micro-lissencéphalie, et celui d’une patiente présentant un phénotype fortement chevauchant avec le syndrome de Taybi-Linder (TALS/MOPD1, OMIM 210710). Dans les traits caractéristiques de la patiente : un retard de croissance sévère, un retard d’ossification, une microcéphalie avec une pachygyrie et un corps calleux fin, une dysmorphie faciale marquée avec des yeux proéminents et un menton fuyant, des cheveux épars et de l’eczéma. Les deux cas portent le même variant pathogène c.2953A > G du gène RTTN, qui affecte un site donneur d’épissage. TALS est une pathologie très rare causée par des mutations récessives dans le gène RNU4ATAC, qui est transcrit en un petit ARN nucléaire non-codant, U4atac, composant du splicéosome mineur impliqué dans l’épissage des 850 introns mineurs du génome humain.

Afin d’élucider les causes physiopathologiques du TALS, restées inconnues à ce jour, nous avons choisi d’étudier la mutation RTTN dans différents modèles. Tout d’abord, nous avons confirmé que le variant entraîne un défaut d’épissage de RTTN comme décrit précédemment, dans les fibroblastes de nos deux patients, et ce sans affecter le niveau d’expression des transcrits. Par la méthode de super-résolution appelée microscopie à expansion, nous avons montré une légère réduction de la localisation de rotatine aux centrioles, accompagnée d’une diminution de leur taille. Enfin, nous avons observé une diminution de la longueur des cils dans les fibroblastes du fœtus seulement, et aucun défaut concernant le désassemblage du cil.

Pour étudier plus spécifiquement les processus de neurogenèse, nous avons introduit par CRISPR-Cas9 la mutation c.2953A > G dans des cellules souches pluripotentes induites (iPSC), et réalisé des différenciations en monocouche de neurones et en organoïdes corticaux. Les données préliminaires montrent de manière surprenante une augmentation de la taille des cils dans les progéniteurs neuronaux mutés pour RTTN, ainsi qu’un défaut de différenciation en organoïdes observable dès J32. Nous poursuivrons notre étude par l’analyse morphologique des organoïdes et des processus de ciliogenèse, prolifération, apoptose et migration, qui seront par la suite appliqués aux modèles iPSC mutés RNU4ATAC que nous avons générés.

The evolutionarily conserved transport protein particle (TRAPP) complexes (TRAPP II and III) perform fundamental roles in subcellular trafficking pathways. Here we identified biallelic sequence alterations in TRAPPC10 , a component of the TRAPP II complex, in individuals with a severe microcephalic neurodevelopmental disorder. Molecular studies revealed a weakened interaction between mutant TRAPPC10 and its putative adaptor protein TRAPPC2L. Studies of patient lymphoblastoid cells revealed an absence of TRAPPC10 alongside a concomitant absence of TRAPPC9, another key TRAPP II complex component associated with a clinically overlapping neurodevelopmental disorder. The TRAPPC9/10 reduction phenotype was recapitulated in TRAPPC10^-/- knockout cells, which also displayed a membrane trafficking defect. Notably, both the reduction in TRAPPC9 levels and the trafficking defect in these cells could be rescued by wild type but not mutant TRAPPC10 gene constructs. Moreover, studies of Trappc10^-/- knockout mice revealed neuroanatomical brain defects and microcephaly, paralleling findings seen in the human condition as well as in a Trappc9^-/- mouse model. Together these studies confirm TRAPPC10 gene mutation as a cause of human disease and define TRAPP-mediated pathomolecular outcomes of importance to TRAPPC9 and TRAPPC10 mediated neurodevelopmental disorders in humans and mice.

La maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) est la neuropathie périphérique héréditaire la plus fréquente résultante de lésions des nerfs moteurs et sensoriels. PMP22 a été le premier gène décrit comme étant impliqué dans la CMT via une variation structurelle (SV ; Structural Variation) de type duplication, expliquant environ 15% des cas globaux de CMT dans notre cohorte. À ce jour, plus de 90 gènes sont connus pour être impliqués dans la CMT, sur lesquels principalement des variants ponctuels (SNV ; Single Nucleotide Variants) et des courts insertions ou délétions ont été décrits, tandis que les SVs sont souvent sous-diagnostiqués. Dans notre étude, nous avons utilisé du NGS ciblé et l'outil bioinformatique CovCopCan pour analyser les données NGS de deux familles non apparentées présentant des symptômes de CMT associés à un syndrome pyramidal. Nous avons alors découvert deux grands SVs dans le gène KIF5A, un gène associé à des formes axonales de CMT (CMT2), dans lequel aucun SV n'a encore été décrit. Dans la première famille, le patient présentait une large délétion de 12 kb dans KIF5A incluant les exons 2-15. Dans la seconde famille, deux cas présentaient une large délétion de 3 kb dans KIF5A incluant les exons 24-28. De plus, l'analyse bioinformatique de la séquence de la région du point de cassure a révélé que le mécanisme de NAHR (Non-Allelic-Homologous-Recombination), similaire à celui impliqué dans la duplication du PMP22, pourrait être responsable de l'un de ces SVs de KIF5A et pourrait potentiellement être présent chez plusieurs autres patients. Cette étude établit un nouveau concept de mécanisme impliqué dans les maladies neurologiques, puisque de grandes délétions de KIF5A peuvent causer le CMT2. En outre, nous soulignons l'importance d'analyser non seulement les SNVs mais aussi les SVs lors du diagnostic des neuropathies, car elles pourraient être impliquées dans les neuropathies périphériques plus fréquemment que suspecté actuellement.

Nous rapportons le cas d’un patient et de sa sœur présentant tous deux une paraparésie spastique ayant débutée vers l’âge de deux ans avec une atteinte modérée des membres supérieurs sans autre signe associé.

La réalisation d’un exome, dans cette fratrie, issue de parents cousins germains, a mis en évidence un variant d’épissage à l’état homozygote, absent de gnomAD, dans le gène COQ9 : Chr16(GRCh37):g.57481490G > A, NM_020312.3(COQ9):c.73G > A, p.(Val25Met). Les logiciels de prédictions d’effet sur l’épissage montrent que ce variant situé sur la dernière base de l’exon 1 diminue la force du site donneur.

L’analyse des ARNm extraits de différents tissus (lignée lymphoblastoïde, myoblastes, fibroblastes et muscle) montre la présence du transcrit attendu ainsi que la présence de trois transcrits additionnels de taille supérieure à celle de l’amplicon attendu. Ces trois transcrits additionnels sont absents chez des contrôles. Le séquençage du transcrit additionnel majoritaire a montré la rétention de 113 pb de l’intron 1 de COQ9 conduisant à un frameshift. Ce transcrit illégitime représente entre 10 et 60% des transcrits totaux en fonction du tissu. C’est au niveau des lignées lymphoblastoïdes qu’il est le plus retrouvé (60% versus 8-9% du transcrit normal) ; dans les myoblastes et le muscle les rapports s’inversent avec 50 à 60% du transcrit attendu contre 10 à 20 % du transcrit contenant l’insertion de 113 pb. Les deux autres transcrits additionnels n’ont pas été séquencés; ils représentent 5 à 30% du total des transcrits en fonction du tissu.

Bien que sa fonction précise ne soit pas encore complètement élucidée, la protéine mitochondriale COQ9 est impliquée dans la biosynthèse du Coenzyme Q10 (CoQ10) et les variants pathogènes de COQ9 entraînent un déficit de la molécule. L’analyse des complexes de la chaîne respiratoire sur la biopsie musculaire du patient a retrouvé de façon cohérente un déficit partiel des complexes CoQ10-dépendants (complexes I+III et II+III), corrigé par l’ajout de CoQ10. Ces résultats ont été confirmés par la mise en évidence d’un déficit musculaire et plasmatique en CoQ10.

Sept patients ont été décrits dans la littérature, avec un phénotype beaucoup plus sévère que celui de nos deux patients. L’atteinte était caractérisée par une encéphalopathie néonatale associée à une atteinte cardiaque et/ou rénale, conduisant pour 6 à un décès dans les premiers mois ou premières années de vie.

Une supplémentation en Coenzyme Q10 a pu être proposée à cette famille. Nous n’avons que peu de recul pour décrire son effet ; mais aucune aggravation du phénotype n’est constatée.

Nous rapportons donc, un variant d’épissage homozygote du gène COQ9 conduisant à une paraparésie spastique isolée ; élargissant le spectre phénotypique des mutations dans ce gène. La moindre sévérité du phénotype de nos patients par rapport à ceux publiés pourrait s’expliquer par des taux résiduels en CoQ10 plus importants dans cette famille.

Les ciliopathies sont des maladies génétiques rares, très hétérogènes génétiquement et à spectre phénotypique très large et chevauchant. Elles résultent d’anomalies ciliaires, secondaires à des mutations de gènes codant des protéines centrosomales ou ciliaires. A l’inverse des cils motiles, le cil primaire (CP) est quasi ubiquitaire expliquant la pléiotropie des atteintes. En particulier, des malformations cérébrales sont fréquemment associées aux ciliopathies, de même que des troubles cognitifs ou comportementaux sans base neuro-anatomique, soulignant l'importance de la fonction ciliaire pour le développement et le fonctionnement du cerveau. Avec l'avènement du séquençage haut débit, les études génomiques ont largement accéléré notre compréhension des bases moléculaires des anomalies neuro-développementales. Cependant, les mécanismes sous-jacents sont restés largement inexplorés en raison de l'absence de modèles récapitulant les processus clés spécifiques au développement du cortex cérébral humain. La possibilité de reprogrammer des cellules somatiques de patients en cellules souches pluripotentes (IPS) capables de s'auto-organiser et de se différencier en ébauches d’organes ou organoïdes a révolutionné la modélisation des maladies humaines. 

Afin d'étudier les mécanismes physiopathologiques qui sous-tendent les anomalies cérébrales chez les patients atteints de ciliopathies, nous avons ainsi tiré profit des avancées technologiques en matière de cellules souches et généré des modèles du développement néocortical en 2D et 3D à partir de cellules IPS, i.e. rosettes neurales et organoïdes cérébraux. Ces deux systèmes de modélisation récapitulent de nombreux aspects du développement néocortical, notamment la génération des divers types de cellules progénitrices neurales ainsi que de neurones néocorticaux. Ces systèmes de modélisation nous permettent d'étudier la biogenèse et la fonction des CP. La transduction de la voie Sonic Hedgehog (SHH) est analysée par quantification de l’expression de gènes cibles de cette voie et par analyse immunochimique de la dynamique de localisation ciliaire des acteurs de la voie SHH. Afin de tirer parti de l'organisation 3D des organoïdes cérébraux, nous avons mis au point une méthode simple permettant d’imager les organoïdes cérébraux entiers après immunomarquage et permettant de détecter, à l’échelle de l’oragnoïde entier, à la fois les centrosomes et les CP des progéniteurs et neurones néocorticaux. 

L’utilisation de ces méthodes de modélisation à partir de cellules IPS humaines générées soit par reprogrammation de cellules de patients atteints de ciliopathies, soit par l'utilisation de la technologie CRISPR/CAS9 pour éditer spécifiquement les gènes ciliaires, devrait permettre des progrès significatifs dans la compréhension de la contribution du CP au cours du développement normal et pathologique du cortex cérébral.

Introduction :  Le syndrome de l’X Fragile (FXS), lié à une expansion de plus de 200 triplets CGG du gène FMR1, est la première cause de déficience intellectuelle (DI) héréditaire.  Les Sociétés Savantes de différents pays recommandent sa recherche en première intention avec l’aCGH chez tous les patients présentant un trouble neurodéveloppemental (TND)/DI/trouble du spectre autistique (TSA)/ trouble du déficit de l’attention (TDAH). Dans la littérature, le taux diagnostique de FXS a été évalué à 2,5% chez les patients avec DI et à 1,2% chez les patients avec TSA, ce qui est inférieur à l’aCGH (15-20%) et l’exome (30-40%). De ce fait, la dernière recommandation de l’American College of Medical Genetics soulève la question de la pertinence de la recherche de FXS en première intention.  Nous avons tenté d’évaluer ce point.

Méthodes : 1) Détermination du taux diagnostique de FXS, toute indication confondue, de 2014 à 2020 au sein du laboratoire de génétique moléculaire du CHU Necker. 2) Analyse des dossiers des patients FXS à la recherche de la mention de signes dysmorphiques évocateurs de FXS selon genereview et d’histoire familiale évocatrice (DI lié à l’X, FXS, FXTAS, FOIP). 3) Rétrophénotypage des photos des patients FXS disponibles selon les signes dysmorphiques de genereview. Utilisation et évaluation de l’application Face2Gene (FDNA Inc., Boston, USA) et de son logiciel de reconnaissance faciale DeepGestalt afin d’orienter la prescription.

Résultats : 1) 2324 tests ont été effectués sur 1620 hommes et 704 femmes. Un FXS a été diagnostiqué chez 23 (1,4%) hommes et 12 (1,7%) femmes. L’âge au diagnostic était compris entre 11 mois et 43 ans.  Pour 13/34 (38%) des patients positifs le test avait été prescrit dans un contexte familial de pathologies du spectre FMR1. 21/34 (62%) étaient des cas index présentant un TND/DI ou TSA. 2) 30/34 (88%) des patients avaient des signes dysmorphiques ou une histoire familiale mentionnés dans leur dossier médical. 3) Par rétrophénotypage, 15/16 patients présentaient ≥ 1 signe évocateur. Au total, des signes dysmorphiques évocateurs étaient retrouvés chez 33/34 patients.  L’application Face2Gene a classé le FXS en première position chez 12/16 patients.

Discussion : Le taux diagnostique de notre cohorte (1,5%) est concordant avec ceux de la littérature, ce qui reste bien inférieur à l’exome. Chez la grande majorité des patients (30/34) le FXS pouvait être évoqué devant la présence de signes dysmorphiques (l’application Face2Gene ne semble pas très discriminante chez les patients jeunes) et/ou une histoire familiale évocatrice d’où la justification d’une consultation de génétique avant prescription. La possibilité d’acquérir une présomption diagnostique forte chez les rares patients atteints de FXS semble justifier la relégation du test FXS en seconde intention   sous réserve d’une étude du rapport coût-bénéfice versus l’exome.

Le syndrome d’Ellis-Van Creveld (EVC) fait partie du groupe de ciliopathies squelettiques ou Côtes Courtes-Polydactylie (CCP), et est caractérisé par une dysplasie ectodermique, une chondrodysplasie, une polydactylie et une cardiopathie congénitale, avec une grande variabilité phénotypique allant de formes létales à des formes modérées. Les gènes EVC et EVC2 sont connus pour être les principaux gènes responsables du syndrome EVC. Cependant, un nombre croissant de gènes impliqués dans le fonctionnement du cil - WDR35, GLI1, DYNC2LI1, PRKACA, PRKACB, et SMO - ont été identifiés dans le syndrome EVC, permettant une meilleure compréhension de sa physiopathologie. Ces gènes codent tous pour des protéines du cil primaire, jouant un rôle clé dans la transduction du signal au sein des voies Hedgehog (Hh). L’objectif de cette étude était l’analyse de 50 patients, issus de 45 familles, diagnostiqués EVC, afin de mieux définir les bases phénotypiques et moléculaires du syndrome EVC. Nos critères d’inclusion pour le diagnostic clinique du syndrome EVC étaient la présence d’au moins trois critères parmi : 1) un aspect typique squelettique (brachydactylie, membres courts, thorax étroit) et/ou radiologique (os courts et tubulaires, côtes courtes, ailes iliaques courtes, acetabulum en trident), 2) une polydactylie, 3) la présence d’anomalies unguéales ou de la sphère orofaciale, 4) une cardiopathie congénitale. Notre taux de détection moléculaire au sein de la cohorte des 45 familles a été de 91,11%, avec des variants identifiés dans EVC/EVC2 (77.8%), DYNC2H1 (6.7%), DYNC2LI1 (2.2%), SMO (2.2%), et PRKACB (2.2%). Nous avons identifié une grande proportion de délétions (26.92%, 14/52) dans les gènes EVC et EVC2, dont deux délétions récurrentes retrouvées respectivement six et quatre fois dans le gène EVC. Ces CNVs étaient majoritairement hérités de la mère, et probablement médiés par un mécanisme de recombinaison homologue non allélique impliquant des séquences Alu. Sur le plan clinique, nous avons retrouvé de nombreuses anomalies supplémentaires, dont plusieurs sont décrites ici pour la première fois. La taille finale était rarement impactée dans notre cohorte, même au sein des patients mutés EVC/EVC2. Nous n’avons pas noté de corrélation génotype-phénotype significative, mais quelques éléments sont notables : taille normale chez les individus mutés dans DYNC2LI1, SMO et PRKACB ; et corrélation entre la présence d’une cardiopathie congénitale et le degré d’altération de la fonction protéique pour DYNC2LI1. Notre étude confirme qu’EVC et EVC2 sont les gènes majeurs avec une fréquence importante de CNV non décrite à ce jour.

Les surdités prélinguales ont une transmission liée à l’X dans 1 à 2% des cas et 50% des cas de surdité isolée liée à l'X sont causés par des mutations du gène POU3F4 impliqué dans la surdité héréditaire liée à l'X-2 (DFNX2). DFNX2 est une surdité de transmission et de perception associée à une malformation de l’oreille interne. Des études récentes ont montré une expression de POU3F4 durant le développement cérébral et dans le tube neural. Notre étude visait à constituer une cohorte française de patients présentant une DFNX2, d’établir leur génotype et leur phénotype précis, notamment sur le plan neurodéveloppemental. Notre second objectif était de rechercher une éventuelle corrélation génotype-phénotype.

Les patients ont été identifiés auprès des laboratoires de génétique faisant l’analyse du gène POU3F4. Les données cliniques ont été recueillies auprès des médecins responsables de chacun de ces patients par un questionnaire clinique.

Nous avons constitué une cohorte de 33 patients, âgés de 2 à 52 ans, issus de 25 familles différentes. En étudiant le génotype de ces patients, nous avons observé 5 grands réarrangements, 7 petites délétions intragéniques, 2 petites duplications intragéniques et 12 substitutions nucléotidiques. Nous avons mis en évidence 16 nouvelles mutations. En regardant le phénotype auditif, on voit que la surdité est d’apparition prélinguale chez 70% des patients. 23 patients ont une surdité de perception, 4 ont une surdité mixte et 1 a une surdité de transmission. Cette surdité est sévère ou profonde dès le diagnostic chez 20 patients et modérée chez 9 patients. Le TDM des rochers retrouvait une malformation de l’oreille interne chez 96% (25/26) des patients. Concernant le phénotype neurologique, on observe un trouble de l’équilibre chez 35% (8/23) des patients et des troubles du sommeil chez 40% (10/25) des patients. Concernant le neurodéveloppement 48% (12/25) des patients ont un retard à la marche. Sur 20 patients, 1 a un retard de développement psychomoteur à 3 ans et 9 mois et 6 patients ont une déficience intellectuelle. 43% (7/16) des patients ont un trouble du spectre de l’autisme (TSA) et 41% (9/22) ont déficit de l’attention avec ou sans hyperactivité (TDAH).

Depuis sa description en 1971 par Nance et al, DFNX2 est connue comme une surdité isolée de transmission liée à l’X. Notre étude montre que d’autres symptômes peuvent être associés à la surdité. Le retard à la marche et les troubles de l’équilibre s’expliquent par les malformations de l’oreille interne. Cependant, la déficience intellectuelle, le TSA et le TDAH semblent plus fréquents que dans la population générale. Cela pourrait s’expliquer par un rôle de POU3F4 dans le développement cérébral. Au vu de ces résultats, il semble intéressant de suivre le neurodéveloppement de ces patients. Cela permettra d’étendre nos connaissances sur le phénotype des patients atteints de DFNX2, d’améliorer leur prise en charge et de préciser le conseil génétique.

Les maladies rénales dépistées par l’échographie fœtale représentent un groupe hétérogène de pathologies dont certaines ont une cause monogénique. Elles se présentent principalement sous forme d’anomalies de développement des reins et des voies urinaires ou de gros reins hyperéchogènes parfois kystiques. Leur sévérité est extrêmement variable. Elles peuvent être isolées ou syndromiques. L’existence de formes familiales a fait suspecter une composante génétique, hypothèse validée par l’identification de variations pathogènes dans un très grand nombre de gènes. L’identification des variations causales dans les formes monogéniques de ces pathologies est essentielle pour le conseil génétique. L’objectif de cette étude était d’évaluer la fréquence des causes monogéniques au sein d’une cohorte de 100 fœtus présentant des anomalies rénales sévères. Cinq fœtus présentaient une atteinte compatible avec une dysgénésie rénale tubulaire, 79 des anomalies de développement des reins et des voies urinaires (CAKUT) et 16 une atteinte rénale évoquant une ciliopathie (gros reins hyperéchogènes et/ou kystiques). Une analyse moléculaire a été réalisée par une technique de séquençage moyen débit d’un panel de gènes mis en place dans le laboratoire de génétique de l’hôpital Necker-Enfants malades, le panel « Rénome ». Chez les fœtus présentant une atteinte évocatrice de dysgénésie rénale tubulaire, des variations bialléliques de classe 4 des gènes AGT et AGTR1 ont été identifiées chez deux fœtus, et des variations homozygotes de classe 3 des gènes AGT, ACE et AGTR1 chez les trois autres fœtus. Des variations pathogènes responsables du phénotype ont été mises en évidence chez 10 fœtus avec anomalies de développement des reins et des voies urinaires (dans les gènes PAX2, FRAS1, EYA1, MYOCD et BICC1), et des variations de classe 3 dans le gène GREB1L ont également été identifiées chez trois fœtus avec agénésie rénale bilatérale. Une nouvelle variation de splice dans le gène MYOCD, associé chez les fœtus de sexe masculin à une mégavessie congénitale, a été identifiée chez deux jumeaux grâce à une technique de séquençage haut débit de cDNA issus de rein fœtal. Un diagnostic moléculaire a pu être établi chez 75% des fœtus avec un phénotype évocateur de ciliopathie, avec l’identification de variations pathogènes dans 11 familles (gènes PKHD1, PKD1, PKD2, NPHP3, CEP290 et TMEM67). Ce travail a également permis de montrer qu’une variation bi-allélique du gène DNAJB11 était associée au syndrome d’Ivemark II (OMIM #208540), ciliopathie fœtale sévère associant dysplasie rénale, hépatique et pancréatique. Au total, une variation causale ou possiblement causale a été identifiée dans 30% des cas, avec un taux diagnostique variable en fonction du phénotype et bien plus faible pour les CAKUT que pour les ciliopathies ou les dysgénésies rénales tubulaires.

Etude monocentrique, par exome ciblé chez 112 enfants, de l'architecture génétique des DSD 46,XY. Huby Thomas*, Avril Tristan*, Lambert Anne-Sophie, Proust Alexis, Laddada Lilia, Lucie Tosca, Young Jacques, Guiochon-Mantel Anne, Linglart Agnès, Bouvattier Claire**, Bouligand Jérôme**.  *co-premiers auteurs, **co-derniers auteurs.

Contexte : Les DSD pour « Disorders of Sex Development » sont des pathologies regroupant un grand nombre de situations médicales congénitales où le développement du sexe chromosomique, gonadique ou anatomique est atypique. Ce développement est régulé par de nombreux gènes et la recherche étiologique par séquençage nouvelle génération (NGS) est devenue le standard pour le diagnostic moléculaire de ces maladies.

Objectifs : Étudier l’architecture génétique des DSD 46,XY et discuter de l’intérêt de l'exome ciblé par NGS pour certaines catégories de patients.

Patients : 112 patients avec DSD 46,XY ont été inclus dans notre étude monocentrique : 13 patients dans un groupe de DSD 46,XY syndromiques, 44 dans un groupe avec retard de croissance intra-utérin, 21 dans un groupe DSD 46,XY isolé avec dysgénésie gonadique (AMH < 250 pmol/l) et 34 dans un groupe DSD 46,XY isolé sans dysgénésie gonadique (AMH > 250 pmol/l).

Méthodes : Analyse par exome ciblé (EC) d’un panel de 39 gènes. Deux approches : Analyse supervisée (AS), interprétation des variants génétiques selon la classification ACMG 2015 ; Analyse non supervisée (ANS) de l’ensemble des données génotypiques de notre cohorte.

Résultats : Au cours de l'AS, des variants pathogènes ou probablement pathogènes (classe 4 ou 5) ont été identifiés chez 25 patients soit 22,3% (IC₉₅[14,6%-30%]), des variants de signification inconnue (classe 3) chez 42 patients soit 37,5% (IC₉₅[28,5%-46,5%] et des variants probablement bénins ou bénins (classe 2 ou 1) chez 45 patients soit 40,2% (IC₉₅[31,1%-49,3%]). Entre les 4 groupes, il n’a pas été retrouvé de différence significative du nombre de variants de classe 4 ou 5, de classe 3 et de classe 2 ou 1. L'AS confirme que NR5A1/SF1 est le gène principal responsable des DSD 46,XY avec dysgénésie gonadique. Parallèlement, l'ANS a permis d'identifier des variants de classe 3 qui sont candidats prioritaires pour une ré-interprétation ultérieure.

Conclusion/Perspectives : Après EC, plus de 75% des patients DSD 46,XY restent dans l’errance diagnostique. Dans ce contexte, la poursuite de ces analyses par séquençage complet de génome dans le cadre de la préindication France Médecine Génomique « Anomalies sévères de la différenciation sexuelle d’origine gonadique et hypothalamo-hypophysaire » constitue une véritable opportunité. 

Introduction

Smooth muscle cells (SMCs) capacity to switch between proliferative (synthetic) and quiescent (contractile) phenotypes is a widely studied mechanism in cardiovascular disease. Primary SMCs tend to lose many physiological features in culture, which makes the study of their contractile function challenging. Recently, an optimized protocol of induced pluripotent stem cells (iPSCs) differentiation into contractile SMCs was described. Here we aimed at defining the transcriptomic and open chromatin dynamics during the acquisition of SMCs phenotypes.

Methods

We differentiated 4 human iPSC lines (2 males, 2 females) towards either contractile (Repsox induced) or synthetic (PDGF-BB/TGF-β induced) SMC phenotypes using a 24-days protocol. We performed RNA-Seq and assay for transposase accessible chromatin (ATAC)-Seq at 6 time points of differentiation. We compared gene expression and open chromatin profiles between them and to existing datasets of primary human SMCs and artery tissues.

Results

iPSCs derived SMCs showed expected morphology and positive expression of SMC markers. Synthetic SMCs exhibited greater capacity of proliferation, migration and lower calcium release capacity, compared to contractile SMCs. RNA-Seq results showed that multiple disease-associated genes involved in the contractile function of arteries, including smooth-muscle myosin heavy chain (MYH11), myosin light chain kinase (MYLK) and angiotensin type 1 receptor (AGTR1) genes, were highly expressed in contractile compared to synthetic SMCs. Interestingly, multiple genes coding for extracellular matrix components were also enriched in contractile SMCs.  Analysis of transcriptomic and open chromatin profiles suggests contractile SMCs retained a high level of activity for transcription factors involved in vascular smooth muscle development. Synthetic SMCs however presented open chromatin profiles similar to cultured primary SMCs. Open chromatin regions of contractile SMCs were highly enriched in variants associated to vascular diseases such as hypertension, spontaneous coronary artery dissection and intracranial aneurysm , whereas synthetic SMCs were more enriched for variants associated to peripheral artery disease and aortic aneurysm.

Conclusions

Differentiation of SMCs from iPSC using two complementary protocols provides valid cellular models suitable for the study of a variety of vascular diseases. Utilization of these cells in combination with genome-editing tools is a promising approach to the study of complex regulatory mechanisms at genetic risk loci while taking into account phenotypic variability of arterial cellular components.

Introduction

La maladie de Menkes (MNK), maladie récessive liée à l’X (ATP7A), résulte d’un défaut de transport du cuivre, est une maladie multi-organes (atteintes neurologiques, cutanées, urologiques, vasculaires, osseuses) et conduit historiquement au décès avant 3 ans. L’histidinate de cuivre (HisCu) est le seul traitement spécifique proposé, avec des résultats variables en fonction des études. L’objectif était d’étudier les caractéristiques cliniques et génétiques d’une cohorte française pour discuter de la prise en charge thérapeutique.

Méthodes

Une cohorte a été constituée à partir des diagnostics génétiques (gène ATP7A) de MNK en France et comparée à une analyse systématique de la littérature.

Résultats

Un variant pathogène causal a été identifié dans 81% des 88 dossiers analysés. 94% des variants sont privés dont la moitié non-décrite dans les bases de données. 24,6% sont des délétions/duplications intragéniques, 50,8% des variants de type perte de fonction et 24,6% des variants faux-sens. Ces derniers se répartissent exclusivement à partir de l’exon 7, avec pour conséquence d’un certain nombre une anomalie d’épissage avec délétion partielle d’exon.

Sur les 24 individus dont les données cliniques ont pu être étudiées, l’âge moyen au diagnostic est de 4,5 mois (78% entre 3 et 6 mois). Les signes au diagnostic sont : l’hypotonie (96% ; un seul patient non hypotonique diagnostiqué en période néonatale sur antécédents familiaux), l’épilepsie (88% ; souvent le point d’appel à la démarche diagnostique), les anomalies des phanères (83% de pili torti, 44% de pâleur cutanée). Une hypothermie néonatale (35%) et des céphalhématomes (27%), bien que non spécifiques, sont sur-représentés.

55% des individus ont été mis sous HisCu, à un âge moyen de 5,1±2,78 mois. On ne met pas en évidence de différence de survie entre le groupe traité par HisCu et le groupe non traité ni de corrélation génotype-phénotype distinguant les individus ayant le mieux répondu. En comparant ces données à celles issues de la littérature, on ne retrouve une efficacité de l’HisCU sur le plan de la survie et du neurodéveloppement que lorsque le traitement est mis en place chez des nourrissons n’ayant pas encore d’atteinte neurologique soit avant 1 mois de vie. 

L’épilepsie apparait chez tous les individus de la cohorte même quand l’HisCu a été instauré avant les premiers symptômes, bien que, dans la littérature, est décrit une efficacité de l’HisCu sur la fréquence des crises.

L’HisCU pourrait aussi permettre de mieux contrôler l'atteinte urologique mais ne paraît pas avoir d'impact sur les phénotypes vasculaires et osseux.

Conclusion

La MNK reste une maladie non curable avec un éventail thérapeutique limité et un pronostic sombre. L’introduction de l’HisCu ne devrait être basée que sur des critères cliniques et amènent à ne la proposer que chez des patients présymptomatiques. Dans ce cadre, il permettrait d’avoir un effet sur la survie et le développement psychomoteur de certains patients.

Actuellement, plus de 250 variants pathogènes ont été identifiés sur le génome mitochondrial (ADNmt), avec un large spectre clinique, notamment en raison du phénomène d'hétéroplasmie. De plus, le séquençage de nouvelle génération a considérablement augmenté l'identification de nouveaux variants de signification inconnue (VSI), augmentant la complexité de l'interprétation de l'ADNmt.

L'objectif de notre étude était de comparer l'hétéroplasmie des variants de l'ADNmt dans le sang et l'urine afin d'améliorer les corrélations génotype-phénotype et prioriser les VSI. Les taux d'hétéroplasmie ont été quantifiés pour 179 variants chez 174 patients, sur des échantillons d'urine et de sang.

Comme précédemment rapporté, la corrélation génotype-phénotype est apparue plus significative dans l'urine que dans le sang pour les patients porteurs du m.3243A > G. Des résultats similaires ont été obtenus pour d'autres variants pathogènes de l'ADNmt, accréditant l'utilité de l'urine pour le diagnostic des maladies mitochondriales. Cependant, la correction de l'hétéroplasmie, en tenant compte de l'âge ou du sexe, n'a pas amélioré ces corrélations.

En raison de la variabilité de la distribution tissulaire des variants hétéroplasmiques de l'ADNmt, l'analyse multivariée a permis de distinguer les polymorphismes des variants pathogènes et de discriminer les porteurs asymptomatiques des patients symptomatiques, suggérant l'intérêt de cette comparaison pour la priorisation des VSI. Cette approche a été appliquée à 10 VSI, dont 9 nouveaux variants, et permet de classer 6 d'entre eux : Cinq comme probablement pathogènes (m.5668G > A, m.7778T > C, m.8186G > A, m.10161A > C, m.15243G > A) et un comme polymorphisme (m.8809A > G). Pour 4 variants (m.5770C > G, m.8816A > C, m.8980C > T, m.13679C > T) cette approche n'a pas permis de conclure.

Notre étude confirme l'utilité des cellules uroépithéliales pour le diagnostic mitochondrial, permettant de meilleures corrélations génotype-phénotype et facilitant la priorisation des nouveaux variants.

Muscle contraction is triggered by a massive release of Ca2+ within myofibers in response to nerve excitation. This process, known as excitation contraction coupling (ECC), relies on the interaction of two Ca2+ channels, the dihydropyridine receptor (DHPR) and the type I ryanodine receptor (RYR1). The DHPR is a voltage-gated L-type Ca2+ channel composed of four subunits (α1, α2δ, β, and γ). The α1S subunit of DHPR forms the pore domain which is essential for proper functioning of ECC in skeletal muscle. Variants in the CACNA1S gene, encoding the α1S subunit, have been recently identified in patients with congenital myopathies. We identified compound heterozygosity for nonsense variants of the CACNA1S gene in two unrelated patients presenting with muscle weakness. Here, we characterized the impact of these two CACNA1S truncating variants on transcript and protein expressions in one of them. Whole RNA-sequencing, completed by functional studies, revealed the unexpected consequences of these variants. Our findings could open up new perspectives in the understanding of pathophysiological mechanisms associated with CACNA1S-related diseases.

Le syndrome de Townes-Brocks (TBS) est une pathologie génétique autosomique dominante, à pénétrance complète et expressivité variable, liée à des mutations du gèneSal-like 1 (SALL1). Il comprend classiquement une triade clinique : imperforation anale, oreilles dysplasiques (tubercules, fistules, anomalies des hélix) et malformations des pouces (triphalangés, polydactylie pré-axiale), pouvant être associée à d’autres atteintes notamment auditives. Plus de 150 cas ont été rapportés dans la littérature permettant une bonne description du phénotype malformatif associé au TBS. La surdité y est décrite comme fréquente (65%), le plus souvent neurosensorielle et de sévérité variable. Cependant, l’âge d’apparition, le profil évolutif ou la présence de malformations de l’oreille interne sont rarement précisés. Or ces éléments peuvent permettre d’ajuster le suivi et la prise en charge précoce de ces patients.

L’étude du gène SALL1 est réalisée au CHU de Lille depuis 2006. L’objectif de notre étude est de préciser le phénotype, notamment auditif, des patients présentant un TBS confirmé sur le plan moléculaire. Nous disposons d’une cohorte de 42 patients issus de 25 familles. D'après les données présentes au laboratoire, qui sont parcellaires, 15/42 patients (36%) présentaient une surdité au moment du diagnostic. Elle était congénitale (1/4) ou apparue dans l’enfance (3/4), le plus souvent neurosensorielle (6/8), bilatérale (5/6) et légère (3/5). L’imagerie des rochers montrait des malformations des osselets chez un patient sourd et un patient sans donnée quant à son audition (2/3). 14/15 patients sourds avaient des malformations des oreilles externes comparativement à 18/27 patients normo-entendants a priori, ce qui en faisaient le signe clinique le plus fréquent dans notre cohorte.

Par ailleurs, 20/42 présentaient une malformation des membres supérieurs avec une majorité de patients ayant une polydactylie pré-axiale ou un pouce triphalangé et 17/42 présentaient une imperforation anale. Enfin, 18/42 patients présentaient une anomalie réno-urinaire, ayant évolué vers une insuffisance rénale chronique pour 10 d’entre eux.

25 variations pathogènes ou probablement pathogènes de SALL1 ont été identifiées : 8 non-sens, 16 frameshift et 1 large délétion emportant tout le gène. A notre connaissance, 7 étaient survenues de novo et 9 étaient héritées. Il n’y a pas de corrélation génotype-phénotype évidente dans cette cohorte, tout comme dans la littérature.

Les données dont nous disposons ayant été recueillies au moment de la prescription de l’analyse moléculaire, la surdité a pu apparaître secondairement chez certains patients. Ces résultats préliminaires vont donc être précisés en recontactant les cliniciens référents des patients, afin de connaître leur évolution et compléter les données manquantes. Nous suggérons d’étendre cette étude aux patients ayant bénéficié de l’analyse du gène SALL1 dans un autre laboratoire, dans le cadre d’un appel à collaboration.

Le gène MYRF code pour un facteur de transcription qui agit comme facteur de régulation de la myéline et qui est fortement exprimé dans le diaphragme, les poumons, le cœur en développement ainsi que dans les tissus oculaires. L'haploinsuffisance de MYRF est impliquée dans le syndrome cardio-urogénital (MIM 618280). Les caractéristiques communes de ce syndrome rare, décrit chez 16 patients dans la littérature (dont 1 cas en prénatal), sont une hernie de coupole diaphragmatique, une cardiopathie congénitale et des anomalies génito-urinaires. Des cas d’encéphalopathie aigüe transitoire avec lésion réversible du splénium du corps calleux (MERS) ainsi que des cas de nanophtalmie ont également été décrits associés aux variations du gène MYRF.

Après avoir fait dans notre service le diagnostic moléculaire de syndrome cardio-urogénital chez un fœtus, nous avons collaboré avec d'autres centres pour constituer une cohorte prénatale internationale de cas similaires. Nous rapportons ici les données échographiques, radiologiques, histologiques, pathologiques et moléculaires de six nouveaux fœtus non apparentés porteurs d'une variation délétère du gène MYRF. Tous présentent une association syndromique polymalformative similaire dont les signes cardinaux sont une hernie de coupole diaphragmatique, des anomalies cardiaques congénitales, une hypoplasie pulmonaire et des anomalies génito-urinaires. Le séquençage de l'exome ou du génome a permis d'identifier chez chacun un variant hétérozygote pathogène ou probablement pathogène de MYRF. 

A ce jour, les caractéristiques cliniques récurrentes chez les enfants présentant des variants délétères du gène MYRF ont déjà été décrites mais le phénotype fœtal reste encore à définir pour en permettre le diagnostic prénatal. Ce travail confirme également l'intérêt du séquençage de l'exome en prénatal en cas de hernie de coupole diaphragmatique syndromique.

Le gène MSH3 appartient au système de réparation des mésappariements de l’ADN. Sa déficience entraîne l’instabilité de certains microsatellites de type tétranucléotides, mais aucun variant du gène MSH3 n’a jamais été mis en cause dans le syndrome de Lynch. Cependant, son implication dans les prédispositions héréditaires au cancer est suspectée depuis 2016, puisqu’Adam et al. ont rapporté quatre patients porteurs de variants constitutionnels bialléliques dans MSH3 appartenant à deux familles différentes. Ces patients présentaient, à l’âge adulte, une polypose adénomateuse colorectale atténuée ainsi que différentes tumeurs extra-digestives. Leurs tumeurs présentaient un phénotype appelé « EMAST » (pour « elevated microsatellite alteration at selected tetranucleotide repeats »), caractéristique de la déficience de MSH3. Depuis cette publication, aucun nouveau patient MSH3 n’a été rapporté.

Nous rapportons quatre nouveaux patients non apparentés porteurs de variants constitutionnels bialléliques dans MSH3, sans variant pathogène retrouvé dans les autres gènes connus de prédisposition. Nous avons recueilli leurs antécédents personnels et familiaux et étudié les caractéristiques moléculaires de divers prélèvements de tissu sain et de tissu tumoral, dont le phénotype EMAST (panel de 8 microsatellites développé dans le laboratoire de génétique de l’Institut Curie).

Les patients, deux hommes et deux femmes, présentent tous une polypose adénomateuse colorectale atténuée. Deux d’entre eux ont eu un cancer colorectal et deux une polypose duodénale. Un des deux hommes a également développé un cancer pulmonaire à 58 ans et les deux femmes un cancer du sein à 46 et 63 ans. Aucun patient n’a d’antécédents familiaux de cancer digestif. Trois patients sont homozygotes pour des variants pathogènes jamais rapportés dans MSH3 (deux de ces patients présentent le même variant). Le dernier patient est hétérozygote composite pour un variant pathogène et un variant de signification inconnue. Le phénotype EMAST a été retrouvé à des degrés différents (instabilité d’un nombre variable de microsatellites parmi les 8 testés) dans tous les prélèvements testés exceptés dans les leucocytes, avec un gradient dans les polypes dépendant de leur degré de dysplasie.

La déficience constitutionnelle de MSH3 est donc responsable d’une polypose adénomateuse colorectale survenant à l’âge adulte contrairement à celle observée dans la déficience constitutionnelle des autres gènes MMR. Ces résultats plaident pour l’ajout de MSH3 aux panels de gènes utilisés dans le cadre des prédispositions aux cancers digestifs. L’identification de nouvelles familles pourrait permettre de préciser le spectre tumoral et le risque de cancer chez les porteurs de variants dans MSH3 à l’état mono et biallélique. La caractérisation du phénotype EMAST dans les tumeurs extra-digestives de ces patients peut également aider à définir le spectre tumoral, ainsi qu’à interpréter la pathogénicité des variants.

L’implémentation du séquençage de nouvelle génération (NGS) dans les laboratoires de diagnostic moléculaire a permis la recherche simultanée des altérations dans plusieurs gènes, augmentant notre rendement diagnostique dans le cadre du cancer de l’ovaire familial. L’identification de variants de signification inconnue (VSI) dans les gènes associés aux formes familiales de cancer de l’ovaire, BRCA1, BRCA2, BRIP1, PALB2, RAD51C et RAD51D (GACO), ainsi que dans les gènes hors spectre des panels de routine, est en augmentation constante (entre 15% et 40%). Le véritable défi consiste aujourd’hui en l’interprétation de ces VSI afin d’optimiser le conseil génétique et la prise en charge diagnostique et thérapeutique pour ces patientes. Par ailleurs, la moitié des tumeurs de l’ovaire présenteraient un déficit dans la voie de réparation par recombinaison homologue (HRD), dont environ 20% seraient secondaires à des pertes bialléliques dans les gènes BRCA1/2 d’origine constitutionnelle ou somatique. Dans ce contexte, la connaissance du statut HRD ainsi que la recherche d’une rétention allélique par perte d’hétérozygotie (LOH) tumorale pourraient nous apporter un poids supplémentaire pour l’interprétation des VSI. Le but de notre étude était de rechercher des arguments en faveur ou non de la pathogénicité des VSI à l’aide du séquençage constitutionnel et tumoral. Nous avons analysé de manière rétrospective 158 patientes atteintes de cancer de l’ovaire séreux de haut grade en combinant l’étude du statut HRD (MyChoice® - Myriad Genetics), et l’évaluation du statut d’hétérozygotie dans les GACO par comparaison des statuts génétiques constitutionnel et tumoral. Nous avons retrouvé 18 variants tumoraux de classe 4 et 5 dans les GACO ainsi que dans les gènes ARID1A, ATM, et CDK12. Un total de 22 VSI tumoraux a été identifié dans les GACO ainsi que dans les gènes ATM et MSH6. Environ 30% des tumeurs étaient porteuses d’une signature HRD. Parmi ces 22 variants, seuls 19 ont pu faire l’objet d’une interprétation de comparaison entre statut HRD et LOH. Un total de 5 variants VSI avec LOH ont été identifiées dans des tumeurs HRD-positives dans les gènes BRCA1, BRCA2 et BRIP1, sans différence observée avec les scores HRD des variants tronquants pathogènes connus (t-test, p = 0,43). A l’inverse, nous avons identifié 8 VSI sans LOH et dans des tumeurs HRD-négatives. Enfin, 6 VSI présentaient une discordance entre le statut LOH et la signature HRD. En accord avec les précédentes études, les variants associés à une LOH étaient significativement associés à un score HRD positif (t-test, p ≤ 0,001). Malgré notre cohorte de faible effectif, et la nécessité de tests fonctionnels afin de statuer définitivement sur la pathogénicité de ces VSI nous avons été en mesure d’identifier des VSI au caractère pathogène probable. Actuellement non reconnue par les critères ACMG, la combinaison de la LOH et du statut HRD pourrait devenir un critère d’interprétation phénotypique modéré (PP4).

Introduction : Les mutations constitutionnelles du gène MET sont impliquées dans la prédisposition aux carcinomes papillaires du rein de type I (KP1). Il s’agit de mutations activatrices de type faux-sens du domaine tyrosine kinase. A ce jour, dix mutations ont été rapportées dans la littérature.

Méthodes : Notre cohorte a porté sur 153 cas index présentant un carcinome papillaire du rein de type I. Une étude génétique à la recherche des mutations constitutionnelles du gène MET (NM_001127500.2) a été réalisée par les méthodes dHPLC ou qPCR-HRM et séquençage Sanger des exons 2 à 21 (98 cas) ou par séquençage de nouvelle génération (55 cas – XT HS Agilent). Tous les variants détectés ont été confirmés par séquençage Sanger ou par MLPA. Une étude fonctionnelle a été réalisée pour les nouveaux variants faux-sens identifiés du domaine tyrosine kinase. Nous avons étudié le taux de phosphorylation de ERK et la capacité de formation de clones après transfection sur des fibroblastes NIH3T3. Trois tumeurs de patients présentant un nouveau variant faux-sens du gène MET ont été relues par un anatomopathologiste expert à la recherche du variant alvéolaire squamoïde biphasique. Les grands réarrangements ont été caractérisés par cartographie optique par le système Bionano (BioNano Genomic, San Diego USA).

Résultats : Nous avons identifié sept variants faux-sens du domaine tyrosine kinase du gène MET chez 19 cas index dont trois variants classés comme pathogènes dans la littérature : MET p.H1112R (5 cas); MET p.V1238I (4 cas); MET p.Y1248C (3 cas). Les nouveaux variants MET p.L1130S (4 cas), MET p.C1125G (1 cas) et MET p.I1102T (1 cas) étaient associés à un KP1 bilatéral (6/6) et multifocal (5/6). Nous ne disposions pas de données concernant la tumeur du patient porteur du quatrième nouveau variant MET p.H1086L. Le variant anatomopathologique alvéolaire squamoïde biphasique a été retrouvé sur trois tumeurs porteuses du variant MET p.L1130S. Ces tumeurs présentaient également une triplication du chromosome 7. L’étude fonctionnelle a conclue au caractère pathogène des quatre nouveaux variants du domaine tyrosine kinase MET p.L1130S;p.C1125G;p.I1102T et p.H1086L. Une duplication des exons 6 à 21 et incluant le domaine tyrosine kinase du gène MET a été identifiée chez trois cas index de la cohorte. Sa caractérisation par cartographie optique par le système Bionano a montré qu’elle se situait en aval de la région 3’ du gène à plus de 70kb laissant supposer qu’elle serait probablement neutre. Cette duplication a été retrouvée chez au moins 25 cas non associés sur plus de 10000 analyses avec un syndrome de prédisposition aux cancers.

Conclusion : Il s’agit de la première étude Française réalisée sur une large cohorte incluant 153 cas index et décrivant les mutations constitutionnelles du gène MET dans le carcinome papillaire du rein de type I. Nous avons pu identifier quatre nouveaux variants pathogènes en s’appuyant sur des arguments cliniques, tumoraux et fonctionnels. 

Le syndrome de Peutz-Jeghers (PJS) (MIM 175200) est une maladie héréditaire causée par des variants hétérozygotes perte-de-fonction du gène STK11. Les délétions de tout ou partie de STK11 sont responsables d’un tiers des cas de PJS. Seuls 22 cas de délétions constitutionnelles ont été décrits dans la littérature. Les 3 principaux mécanismes impliqués sont le non-allelic homologous recombination (NAHR) médié par la présence de séquences Alu (10 cas), le non-homologous end joining (NHEJ) (8 cas) et la micro-homologie de séquence (4 cas).

L’objectif de ce travail a été de caractériser les mécanismes mutationnels par l’identification des points de cassure des délétions de STK11 d’une cohorte de 25 patients. Trois délétions étaient récurrentes : délétion de l’exon 1 (9 cas), délétion complète du gène (7 cas), délétion des exons 2-3 (3 cas). Pour déterminer les points de cassure des délétions de l’exon 1, nous avons réalisé un séquençage long read (Oxford Nanopore Technologies) avec enrichissement dans la région d’intérêt (ROI) : (1) par informatique par échantillonnage adaptatif en temps réel ; (2) par CRISPR/Cas9. Dans le premier cas, les molécules d’ADN étaient éjectées du pore si la séquence déterminée en temps réel ne correspondait pas à la ROI. Dans le second cas, l’intron 1 de STK11a été coupé en 3 sites par CRISPR/Cas9 et les fragments générés à partir des points de coupure ont été séquencés.

Nous avons pu identifier les points de cassure d’une délétion de l’exon 1 de STK11. Les autres délétions sont en cours de séquençage. Cette délétion résultait d’un NAHR : les points de cassure se situaient dans des séquences AluSx en amont du gène (GRCh37(hg19) chr19:1182917-1183237) et AluSp de l’intron 1 (chr19:1211014-1211309).

Les enrichissements en temps réel et CRISPR/Cas9 ont permis d’obtenir des profondeurs respectives de 18X et 42X au point de cassure intronique avec 39% et 45% de lectures du fragment de jonction de la délétion.

Nous avons mis à profit la capacité de l’enrichissement à augmenter la profondeur de séquençage des ROI pour déterminer les mécanismes mutationnels de délétions du gène STK11. L’enrichissement par CRISPR/Cas9 permet d’obtenir une profondeur décroissante de la ROI à partir du site de coupure mais nécessite de cibler une région précise connue comme non délétée ou des analyses quantitatives préliminaires. L’enrichissement en temps réel aboutit à une profondeur plus faible mais relativement homogène de la ROI permettant une analyse sans a priori.

Nous avons montré que le NAHR médié par la présence de séquences Alu est à l’origine de la délétion étudiée mais également des délétions des exons 2-3 que nous avons caractérisées par PCR long range. Les points de cassure se situaient au sein de séquences AluY de l’intron 1 (chr19:1212990-1213294) et AluY de l’intron 3 (chr19:1219530-1219843). Ce mécanisme pourrait expliquer la récurrence de ces délétions et la forte proportion de cas de novo parmi les patients délétés (16 cas sur 25).

Le gène BRCA2, impliqué dans la prédisposition au cancer du sein et de l'ovaire, a un très large spectre mutationnel, avec un nombre particulièrement important de variations de signification inconnue (VSI). Parce qu’il s’agit d’un gène cliniquement actionnable, BRCA2 est devenu un emblème du défi actuel d’interprétation des VSI identifiées en Génétique Médicale, et une priorité pour le développement de tests fonctionnels visant aider la classification de ce type de variations. Parmi toutes les VSI de BRCA2, celles qui provoquent des défauts d'épissage partiels sont spécialement difficiles à interpréter car le niveau minimal de transcrits pleine-longueur (PL) requis pour une fonction normale reste à établir.  

Ici, nous avons exploré l'exon 3 de BRCA2 (BRCA2e3) pour dépister des variations splicéogéniques avec des effets partiels et effectuer la première estimation des seuils d'haplo-insuffisance de BRCA2, spécifiquement au niveau de l’ARN. Cet exon a été choisi comme modèle parce qu’il est essentiel pour le rôle suppresseur de tumeurs de BRCA2.  Afin de s’affranchir d’effets combinés « ARN-protéine » potentiellement induits par les VSI, nous avons exclusivement étudié des variations introniques ou synonymes. Nos approches ont compris : (i) des analyses in silico (prédictions sur des altérations des sites d’épissage et/ou d’éléments régulateurs d’épissage), (ii) des tests indicateurs d’anomalies d'épissage basés sur l’utilisation de minigènes, (iii) des analyses de l'ARN de patients porteurs hétérozygotes des variations d’intérêt, (iv) des essais de complémentation basés sur l’utilisation de cellules souches embryonnaires de souris (mESCs),  (v) l’étude de données cliniques et génétiques relatives aux patients et leurs familles, et (vi) l’analyse de la fréquence des variations dans la population générale.

Parmi les 100 variations de BRCA2e3 analysées dans le test-minigène, 64 se sont révélés être splicéogeniques, provoquant des sauts d’exon plus au moins prononcés selon la variation. Les défauts d'épissage identifiés dans ce test ont été confirmés par analyse de l'ARN de patients lorsque de tels échantillons étaient disponibles, ainsi que dans des mESCs porteuses des variations d’intérêt. De façon importante, l'analyse de la VSI c.231T > G a montré qu'une perte de ~40% des transcrits BRCA2 PL exprimés par l’allèle mutant n'entraîne aucune augmentation du risque de cancer chez les individus porteurs de cette variation, ce qui à permis de la classer comme non-pathogène et d’établir un seuil minimal d’expression de BRCA2 PL. De plus, les variations provoquant une perte de ~70% PL pourraient aussi être non-pathogènes étant donné que, dans ces conditions, les mESCs restent viables et résistantes aux agents endommageant l'ADN. En revanche, les mESCs produisant des quantités plus faibles de BRCA2 PL présentent des phénotypes nuls ou hypomorphes. Nos résultats ont des implications pour l'interprétation de toute variation diminuant l’expression de BRCA2 PL

Le sarcome histiocytaire (SH) est un cancer rare mais extrêmement agressif. Du fait de sa rareté et de son hétérogénéité, il n’existe pas de consensus pour sa prise en charge ni de facteurs pronostiques. Chez le chien, certaines races sont fortement prédisposées à ce cancer, partageant de nombreuses similitudes cliniques et histologiques avec le SH humain. Notre objectif est d’identifier les bases génétiques, prédisposantes et somatiques de ce cancer agressif grâce au modèle spontané unique qu’est le chien.

Afin d’identifier les facteurs prédisposants, nous avons réalisé des études d’association pan-génome (GWAS) sur 800 chiens appartenant à 4 races prédisposées. Nous avons confirmé le rôle majeur du locus de CDKN2A et identifié de nouveaux loci sur les chromosomes canins 2, 5, 12, 14, 20, 26 et X. Le séquençage NGS de ces régions a permis d’identifier des variants suspectés régulateurs (ilots de méthylation). L’effet additif de ces variants entraine une forte prédisposition au SH (Odd Ratio  5.4 [4.04-7.24]) mais aussi à d’autre cancers hématopoïétiques ( lymphome ou mastocytome ) (Hédan et al., 2021).

Sur le plan des altérations somatiques, à partir de 3 cas de SH chez le Bouvier bernois, nous avons identifié des altérations récurrentes de TP53 et de PTPN11. La validation de ces altérations sur 111 cas de SH a permis d ‘identifier des altérations dans la voie des MAPKinases dans 64% des cas de SH avec des mutations exclusives de PTPN11 (56.75%), KRAS (7.2%) et BRAF (0.9%). Ces mutations sont retrouvées aux mêmes hotposts que dans les cancers humains, reflétant la forte conservation de ces voies oncogéniques. Grace aux présentations cliniques spécifiques observées dans les races canines prédisposées et à l’analyse de 19 cas de SH humain, nous avons montré que les mutations de PTPN11 sont, chez l’homme et  le chien, associées à un sous-type de SH viscéral et disséminé de plus mauvais pronostic (Rault et al., 2020). Très récemment, nous avons réalisé le séquençage des exomes de 39 tumeurs, représentatives de 3 races canines fortement prédisposées et de différentes présentations cliniques.  Les premiers résultats confirment l’implication majeure de la voie MAPKinase et révèle d’autres altérations récurrentes pertinentes

De plus, en testant des drogues ciblant la voie des MAPKinase sur 8 lignées canines de SH, nous avons démontré que les inhibiteurs de MEK avaient une meilleure inhibition de la prolifération cellulaire que les inhibiteurs ciblant en amont, PTPN11.

Ces résultats illustrent l’intérêt du modèle canin pour comprendre les bases génétiques de cancers rares chez l’homme, mais fréquent dans certaines races canines prédisposées.  L’identification de sous-types moléculaires et de cibles thérapeutiques partagés entre l’homme et le chien permettra de sélectionner et de tester de nouvelles thérapies avec un bénéfice pour la médecine humaine et vétérinaire.

Introduction : Le séquençage pangénomique joue un rôle de plus en plus important dans la caractérisation des cancers et dans le choix de la thérapeutique antitumorale. En parallèle cette technologie permet aussi de détecter les variants responsables d’effets iatrogènes en relation avec la chimiothérapie, les antiémétiques ou les antalgiques, fréquemment prescrits aux patients atteints de cancer. 

Matériels et Méthodes : Nous avons évalué l’intérêt pharmacogénétique de cette approche en détectant les variants d’intérêts au sein d’une cohorte de 445 patients porteurs d’au moins une tumeur solide et ayant bénéficié d’un séquençage d’exome. Nous avons appliqué un pipeline dédié pour extraire 67 variants contenus dans 8 gènes. Après consultation des dossiers d’hospitalisation, nous avons retenu 2 gènes avec des variations d’intérêts, le gène DPYD (dihydropyrimidine déshydrogénase) et le gène CYP2D6. Pour le gène CYP2D6 nous avons prédit le statut métaboliseur pour chaque patient. Nous avons ensuite rétrospectivement analysé les concentrations plasmatiques et les effets indésirables en lien avec les variants identifiés. 

Résultats : Quatre paires allèles-molécules furent analysées : DPYD/5FU, CYP2D6/Opioïdes, CYP2D6/Tamoxifène et CYP2D6/Ondansétron. Six patients avec au moins un variant sur le gène DPYD montrent une clairance en 5FU diminuée par rapport aux non-porteurs (p=0.01). L’ensemble des patients (n=5) avec un statut métaboliseur lent ou métaboliseur ultra-rapide vis-à-vis du CYP2D6 ont montré un effet indésirable en lien avec leur statut métaboliseur (p=0.02 et p < 0.01). L’analyse de la proportion de métaboliseur lent ayant reçu du tamoxifène et ayant rechuté, n’a pas montré de différence significative avec la population générale. 

Conclusion : Nous avons montré que le séquençage pangénomique peut fournir des informations pharmacogénétiques supplémentaires pour les patients porteurs d’une tumeur solide. Cette information peut être utile dans les choix thérapeutiques auquel sont confrontés les prescripteurs, notamment par la transmission des variants du gène DPYD et du statut métaboliseur du CYP2D6.

Introduction

Actuellement, la technique de première intention pour la détection de Copy Number Variation (CNV) est l’ACPA (analyse chromosomique par puce à ADN). Cette technique a une résolution d’environ de 200kb et a un rendement diagnostique limité (~10% dans la déficience intellectuelle). En conséquence, pour bon nombre de ces patients, la réalisation d’explorations complémentaires est nécessaire, notamment l’analyse des Single Nucleotide Variation (SNV) et indels sur Panel ou Exome. Pourtant, avec un pipeline bioinformatique adéquat, il est possible de réaliser l’identification des CNV à partir des données de séquençage d’exome. Le but de ce travail est d’évaluer si cette approche peut permettre de remplacer l’ACPA, et de quantifier le rendement diagnostique additionnel.

Matériel et Méthode

L’ADN de plus de 2000 patients, adressés majoritairement pour déficience intellectuelle ou maladie rénale, a été séquencé sur la Plateforme de séquençage d’Exome Eurofins-Biomnis (Kit Twist Biosciences / Séquençage NextSeq500 Illumina). Nous avons développé un pipeline bioinformatique pour la détection des CNV basé sur le module gCNV de l’outil GATK4.

Afin de valider cette méthode de détection des CNV, nous avons comparé les données issues de ce pipeline aux résultats d’études génétiques préalables permettant la détection de CNV (majoritairement ACPA, mais aussi caryotype, MLPA et CNV sur panel).

Résultats

Pour 616 patients ayant bénéficié d’une technique orthogonale de détection de CNV, nous obtenons avec la méthode proposée, après exclusion de 25 échantillons en échec pour le CNV-Exome, 100% de concordance : 528 sans anomalies, détection de 63 anomalies d’intérêt clinique (variants de signification inconnue ou pathogènes : délétion ou duplication allant de 725pb à 156Mb).

De plus, dans la cohorte de 2000 patients, cette méthodologie a permis l’identification de 31 autres CNV responsables de la pathologie du patient (ACPA non réalisé en première intention ou non assez résolutive), allant de 700pb (1 exon de CLDN16) à 80Mb (chromosome 18). Plus précisément, nous avons mis en évidence :

- 20 CNV de taille supérieure à 50kb

- 10 CNV de taille inférieure à 50 kb, classiquement inaccessible aux techniques d’ACPA.

- 1 CNV, associé à un SNV dans un gène entrainant une pathologie de transmission récessive.

Conclusion/Discussion

De plus en plus de patients ont bénéficié ou bénéficieront d’un séquençage d’exome. Pourtant, les CNV ne sont pas toujours recherchés sur cette base, malgré leur implication en génétique médicale. Nous proposons un processus qui permet l’obtention de données de CNV non seulement fiables et robustes mais aussi, assez spécifique pour être directement interprétable. Nous proposons donc l’approche Exome first puisqu’elle permet de réaliser une étude pan-exonique complète (SNV et CNV, de la taille d’un exon à un chromosome entier) sur un même prélèvement et dans un même laboratoire. Le parcours diagnostique du patient est simplifié et accéléré.

La déficience intellectuelle (DI) a une prévalence estimée entre 1% et 3%. Plus de 1400 gènes sont déjà connus pour être impliqués et plus de 1200 sont candidats. Le séquençage de nouvelle génération a considérablement contribué à l’amélioration du rendement diagnostique et à l’identification de nouveaux gènes responsables de DI. Le diagnostic moléculaire repose aujourd’hui essentiellement sur le séquençage d'exome (ES), mais son rendement plafonne à environ 35%, ce qui laisse près de 2/3 des patients sans diagnostic. 

Le séquençage de génome (GS) peut, en théorie, permettre d’améliorer ce rendement. L’accès à des régions peu ou pas couvertes en ES autorise une meilleure couverture de certaines régions exoniques, la détection des variants dans les régions non codantes et la détection des variants structuraux (SV) équilibrés ou non. Afin d’évaluer le potentiel diagnostique du GS, nous avons effectué un séquençage de génome en trio de 33 patients atteints de DI, négatifs en ES. Les SNV/INDELs ont été appelés en suivant les recommandations de GATK et leur annotation/filtration a été réalisée par VEP et un pipeline snakemake maison. Un autre pipeline snakemake combinant les outils CNV de GATK4 et MANTA incluant la filtration et l’annotation des SV a également été développé. Les pipelines sont disponibles sur gitlab. 

Nous avons mis en évidence un variant pathogène ou probablement pathogène chez 24% des patients. Nous avons été identifié 11 SNV (9 par effet de ré-analyse; 2 non détectés en ES) et 9 SV. Parmi ces variants structuraux, 6 étaient de novo, un transmis selon un mode récessif, un lié à l’X et un variant avec point de cassure dans NUS1 transmis par une mère saine. Le taux de faux positifs est relativement faible. En moyenne moins de 10 SV de novo par patient ont été retenus par notre algorithme de détection et de filtration. L’ensemble de ces résultats confirme les bonnes performances de notre pipeline. De plus, notre méthode a montré son efficacité dans l’identification d’évènements complexes et de variants dans des régions non-codantes du génome. Nous avons notamment pu mettre en évidence une délétion du long ARN non-codant CHASERR dont l’implication dans des troubles neurodéveloppementaux est fortement suspectée. 

Nous présenterons ici notre méthode, les résultats obtenus et discuterons des difficultés que posent l’annotation et la filtration.

Les môles hydatiformes (MH) sont des grossesses humaines avec un développement embryonnaire anormal et une prolifération trophoblastique excessive. En France, on estime la fréquence des môles à environ 1 pour 1000 grossesses.

Il y a 2 types de môles : môle complète dans laquelle il n’y a jamais d’embryon ou de fœtus identifiable et môle partielle où un embryon peut se développer sans pouvoir survivre longtemps.

La très grande majorité des môles (98%) sont accidentelles. Seulement 2% sont récurrentes lors d’une grossesse suivante. Parmi ces môles récurrentes une fraction est d’origine génétique, le plus souvent il s’agit de môles complètes, biparentales et aucune grossesse n’aboutit à une naissance vivante. Six gènes ont été impliqués dans ces môles récurrentes : NLRP7, KHDC3L, PADI6, TOP6BL/C11orf80, MEI1 et REC114. Les femmes ont des variant bi-alléliques. La transmission est autosomique récessive. Ces femmes ont une diminution importante voire une impossibilité de produire des ovocytes fonctionnels.

Des patientes ayant présenté au moins deux môles ont pu avoir une ou plusieurs grossesses normales, mais ceci reste exceptionnel en cas de mutation bi-allélique. Il est important pour ces couples et ces familles de déterminer si la récurrence de môle est sous la dépendance d’un tel génotype du fait de cet élément malheureusement de mauvais pronostic pour la procréation, faisant orienter le couple vers une AMP avec don d’ovocytes. On peut aussi s’interroger sur le caractère éventuellement plus modéré de certains génotypes qui permettrait de continuer à envisager une grossesse naturelle, même si cela parait peu probable. Enfin d’autres gènes pourraient être impliqués dans ces situations.

C’est pourquoi nous avons développé un panel contenant les 6 gènes connus donnant des môles récurrentes et 68 gènes candidats. Nous avons obtenu une couverture de 100% à une profondeur de 30X, pour tous les exons de ces 6 gènes sur une série de 24 patientes. La couverture était de 99% à une profondeur de 30X sur l’ensemble du panel.

Une patiente a été utilisée comme témoins positif. Les 2 mutations, connues, de cette patiente ont bien été retrouvées.

Sur les 23 patientes testées en prospectif, nous avons identifiés 2 hétérozygotes composites NLRP7, 2 hétérozygotes NLRP7. Les variants bi-alléliques sont considérés comme responsables de la pathologie molaire à répétition des 2 patientes concernées. Les deux patientes ayant une mutation bi-allélique de NLRP7 ont une histoire obstétricale correspondant à ce qui est décrit : MH et absente d’enfant. L’interprétation pour les 2 patientes hétérozygotes est plus délicate puisque seuls les altérations bi-alléliques aboutissent à des môles : le variant en trans n’a pas été identifié ou s’agit-il seulement d’hétérozygote simple ? Des études complémentaires familiales et sur l’ARN sont nécessaires.

Pour certaines patientes sans mutation identifiée, une étude pangénomique serait intéressante afin d’essayer d’identifier d’autres gènes.

On estime qu'au moins 4000 gènes sont impliqués dans la spermatogenèse humaine qui représentent autant de candidats pour expliquer les anomalies spermatiques responsables de la majorité des infertilités masculines. La composante génétique de l'infertilité masculine est complexe et hétérogène. Dans cette étude, nous avons analysé par séquençage exomique deux patients infertiles non apparentés. Ces deux sujets présentaient une azoospermie non-obstructive (ANO) non syndromique et idiopathique. Comme ces sujets sont issus de parents apparentés, nous avons postulé que l’étiologie de leur affection était très probablement liée à une cause génétique à transmission autosomique récessive. L’analyse bio-informatique a donc été focalisée sur les variants homozygotes. Après une première étape d’analyse des données d’exome basée sur l’investigation des variants localisés dans des gènes candidats dans l’ANO (panel in silico de 151 gènes), nous nous sommes intéressés aux variants localisés dans des gènes à expression testiculaire spécifique ou dominante chez l’homme et la souris, et dont la fonction et/ou l’implication dans l’infertilité masculine ne sont pas connues. Cette dernière analyse nous a permis d’identifier pour chaque sujet testé un variant homozygote perte de fonction dans un gène exprimé spécifiquement dans les cellules germinales testiculaires, C1orf185 (c.250C>T ; p.Gln84Ter) et CCT6B (c.615-2A>G). Ces deux variants sont rares dans la population générale (fréquence allélique <0.005% selon gnomAD) et absents de notre cohorte locale de sujets contrôles (n=445). Pour vérifier l'implication de ces gènes candidats dans l’ANO, nous avons employé la technique CRISPR/Cas9 pour invalider les orthologues murins des gènes candidats identifiés chez nos patients et avons produit deux lignées de souris knockout (KO). Nous avons montré que les mâles KO homozygotes sont fertiles et présentent des paramètres spermatiques et un volume testiculaire comparables aux souris contrôles ainsi qu’une spermatogenèse fonctionnelle. Ces résultats montrent que tous les gènes fortement et spécifiquement exprimés dans les testicules ne sont pas essentiels à la spermatogenèse et en particulier, C1orf185 et CCT6B. 

Le syndrome microdéltionnel 8q21.11 (OMIM # 614230) est un syndrome rare caractérisé par une déficience intellectuelle, une dysmorphie faciale, des anomalies des extrémités, associées à d’autres anomalies ophtalmologiques, cérébrales et/ou cardiaques. Les délétions décrites à ce jour sont de tailles variables et le gène ZFHX4 est le seul gène candidat identifié pour expliquer essentiellement les signes oculaires identifiés dans ce syndrome. 

Nous rapportons le cas d’un garçon de six ans présentant un retard psychomoteur syndromique. L’examen clinique a montré une dysmorphie faciale et une hypotonie. Le bilan malformatif a objectivé une atrophie corticale avec une agénésie du corps calleux à l’IRM cérébrale et une communication inter-auriculaire à l’échographie cardiaque.

Le caryotype standard a objectivé la présence d’une translocation t(8;16)(q21;q11.2) de novo et l’analyse par FISH a confirmé qu’il s’agit d’une translocation réciproque n’impliquant que les chromosomes 8 et 16. L ‘analyse chromosomique par puces à ADN (ACPA) (Agilent 4X44K) a révélé une délétion interstitielle de 9.4 Mb de la région 8q21.12-q21.3 n’emportant pas le gène ZFHX4.

L’alignement de cette délétion avec toutes les délétions chevauchantes précédemment rapportées dans la littérature et dans la base de données Decipher nous a permis de délimiter une nouvelle région de chevauchement (SRO) contenant cinq gènes dont HEY1 ( hairy/enhancer of split related to the YRPW motif 1). Ce gène code pour un facteur de transcription impliqué dans la voie de signalisation Notch, dans l’embryogenèse cardiaque et dans la neurogenèse. Compte tenu de son expression et de sa fonction, nous suggérons que HEY1 est un nouveau gène candidat qui serait responsable à la fois des manifestations neurologiques et cardiaques dans le syndrome microdélétionnel 8q21.11. Cette étude permettra d’avancer dans la compréhension bases moléculaires de ce syndrome microdélétionnel encore non expliquées à ce jour.

Les technologies de séquençage nouvelle génération ont ouvert la possibilité de séquencer de grands échantillons de malades et de tester l'association avec des variants rares. Pour ce faire, les données de séquence des malades sont comparées à des données obtenues sur des témoins qui peuvent être séquencés spécifiquement pour l’étude ou, pour limiter les coûts, extraites de panels de témoins partagés comme le panel d’exomes FREX. Les données de séquence de ces panels de témoins peuvent avoir été générées sur des plateformes de séquençage différentes de celles utilisées pour séquencer les malades et se pose alors un problème de comparabilité des données et la possibilité de biais dans les analyses. Pour limiter ces biais et éviter de détecter de faux signaux d’association, des contrôles de qualité rigoureux sont nécessaires.

Nous proposons un pipeline complet en 5 étapes, RAVAQ, qui a) effectue un contrôle de qualité spécifique en 3 étapes tenant compte du statut cas-témoin pour assurer la comparabilité des données, b) sélectionne les variants pour les tests d’association selon la stratégie définie par l'utilisateur, et c) effectue les tests d’association avec variants rares par région génomique. Le pipeline RAVAQ est intégré dans un package R. Il est convivial et flexible dans ses arguments pour s'adapter à la spécificité de chaque projet de recherche. Nous montrons par des exemples sur des données réelles comment RAVAQ améliore les tests d'association avec variants rares. Le contrôle de qualité par défaut de RAVAQ est meilleur que la méthode VQSR (Variant Quality Score Recalibration) largement utilisée pour identifier des données de bonne qualité et aboutit à un test d'association mieux contrôlé, éliminant l'inflation due aux faux signaux d’association. Dans l’étape de contrôle de qualité des échantillons, RAVAQ intègre une méthode de détection des échantillons contaminés. Sur des données réelles, nous montrons que cette méthode est comparable à la méthode standard actuellement utilisée. Le package R RAVAQ est open source et disponible gratuitement sur https://gitlab.com/gmarenne/ravaq. La documentation du package est détaillée avec une vignette-tutoriel et deux scripts R qui peuvent être testés sur un vcf exemple inclus dans RAVAQ.

Abstract

Les fibroses pulmonaires idiopathiques (FPI) familiales ont été associées environ 30% des cas à des mutations germinales dans les gènes liés aux télomères (TRG). Dans cette étude, nous avons étudié la taille et la stabilité des télomères, l’intégrité des chromosomes et la réponse à l’exposition à un stress génotoxique tel que l’irradiation dans des fibroblastes pulmonaires primaires de patients atteints de FPI associées (FPI-TRG) ou non à une mutation d’un TRG. 

Matériels et méthodes :

Treize patients atteints de FPI, dont 7 patients porteurs d’un variant pathogène de  TRG (TERT et RTL1), et 7 témoins ont été introduits dans cette étude.  

La quantification de la taille des télomères et les aberrations télomériques ont été analysées par Aging kit. L’instabilité chromosomique a été étudiée après marquage des télomères et des centromères suivi par la technique de M-FISH. L’expression des protéines 53BP1, gH2AX et pATM ont été dénombrée par immunofluorescence avant et après irradiation in vitro.

Résultats :

La détection automatisée à haut débit des signaux télomériques a mis en évidence une intensité de signal plus faible dans les fibroblastes pulmonaires des patients atteints de FPI, suggérant un raccourcissement des télomères dans ces cellules. L’analyse des aberrations télomériques (pertes et délétions) a montré une fréquence significativement plus importante chez les patients FPI par rapport au contrôle et en particulier chez les FPI-TRG montrant une instabilité des télomères chez ces patients. Des chromosomes dicentriques, marqueur d’instabilité chromosomique, ont été trouvés chez tous les patients FPI-TRG.  Une accumulation spontanée des dommages de l'ADN (foyers spontanés de 53BP1 et gH2AX) a été détectée dans la majorité des cellules des FPI. Une sensibilité plus élevée aux rayonnements avec un retard systématique dans l’activation de la protéine ATM, nécessaire à la reconnaissance complète du DSB, était associée à la persistance d'un taux élevé de foyers gH2AX et 53BP1 après irradiation.

Conclusion :

Les fibroblastes issus de FPI présentent une instabilité télomérique et chromosomique avec un déficit de réparation des cassures double brin, instabilité qui pourrait jouer un rôle dans la physiopathologie de la maladie.  

Lors des dernières assises, nous avions présenté l’élaboration d’un outil digital en étroite collaboration avec l’Union Régionale des Médecins Libéraux et financé par l’ARS Normandie, destiné à faciliter l’accès à la génétique auprès des praticiens non généticiens (sage femmes, médecins généralistes, gynécologues…). Cet outil d’aide à la décision, disponible gratuitement, sur smartphone et ordinateur, vise à faciliter l’orientation des patients dont l’histoire personnelle et/ou familiale relève d’une consultation d’oncogénétique. L’outil s’intègre à la procédure basée sur les Entretiens Téléphoniques de Préparation (ETPs) et de routage implantée en Normandie, permettant d’accélérer la prise en charge des patients. Le but de cet outil n’est pas d’apporter une expertise en oncogénétique mais de déterminer si un(e) patient(e) doit être adressé(e) vers une consultation d’oncogénétique. Cette application repose sur une arborescence constituée d’une succession de questions simples à 2 ou 3 réponses possibles. L’algorithme est construit en commençant par les questions les plus discriminantes (cancer du sein chez un homme, cancer du sein triple négatif...) puis en intégrant les antécédents familiaux afin d’arriver le plus rapidement possible, en moins de 2 minutes, à la conclusion : « indication à un ETP » ou « pas d’indication à un ETP ». Cette application intègre également la possibilité de propositus asymptomatique, considérant que les professionnels de santé sont amenés à prendre en charge des apparentés asymptomatiques dont un proche a présenté un cancer du sein et/ou de l’ovaire. Lorsque l’indication à un ETP est retenue, l’application indique les coordonnées du service de génétique le plus proche, ainsi qu’un code que le patient communique lors de sa prise de rendez-vous. Ce code permet de façon cryptée et anonyme de tracer le parcours sur l’application qui a conduit à cette prise de rendez-vous dans le service de génétique correspondant et justifie l’ETP.  Ce nouvel outil nommé « SmartGenetCancer », associé à la stratégie des ETPs, s’inscrit dans un nouveau parcours en oncogénétique, offrant réactivité. En effet, l’outil a été pensé comme un vecteur simple des connaissances actualisées, auprès des professionnels de santé non formés à la génétique. A terme, compte tenu de l’impact de la consultation d’oncogénétique dans le parcours thérapeutique des patients pris en charge en oncologie (exemple des inhibiteurs de PARP), cette application pourra être un outil évolutif en accord avec les recommandations, s’inscrivant dans une médecine génomique personnalisée, accessible rapidement et au plus grand nombre. Cette application est maintenant diffusée en Normandie et son impact sur le parcours du patient et le retour des professionnels utilisateurs est en cours d’évaluation. A l’occasion de ces assises, « SmartGenetCancer » est mis à disposition afin de permettre son test dans le cadre de la prédisposition héréditaire au cancer du sein et de l’ovaire.

Les anomalies du gène DMD sont responsables de la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Nous avons identifié pour la première fois une délétion de l’exon 49, respectant le cadre de lecture du gène DMD, et associée à un phénotype musculaire normal. Sur la base de cette observation, et de données préalables d’efficacité thérapeutique du saut d’exon dans la DMD, y compris avec des applications cliniques pour d’autres exons, nous avons débuté un projet dont l’objectif sera d’étendre l’utilisation clinique de cette approche aux patients porteurs de mutations ponctuelles dans l’exon 49. Ainsi, cela permettra d’élargir le nombre de patients pouvant bénéficier de cette approche thérapeutique.  Pour cela, nous avons réussi d’abord à caractériser la taille génomique précise de la délétion. Puis, nous avons transfecté, in vitro, des myotubes différenciés à partir de myoblastes humains sains avec des AON et démontré leur efficacité pour effectuer le saut de l’exon 49. Nous présenterons aussi de futures études fonctionnelles. Notre projet est une preuve de concept pour concevoir des AON thérapeutiques, et initier des essais cliniques dans le but d’élargir l’utilisation du saut d’exon pour la DMD.

Les déficits de la voie de réparation de l’ADN par excision de nucléotides (NER) sont à l’origine de plusieurs maladies de transmission autosomique récessive, de sévérité et de pronostic variables. Peu de données existent sur la reconnaissance précoce des premiers symptômes, nécessaires à l’amélioration de la prise en charge, du suivi ainsi que du conseil génétique de ces patients et de leur famille.

Nous avons inclus l’ensemble des fœtus avec une variation pathogène dans un des gènes de la voie NER présentant un phénotype clinique détaillé (autre qu’un RCIU isolé). Les données ont été collectées à partir de patients de la littérature ainsi que de patients diagnostiqués au sein de notre laboratoire.

13 cas fœtaux issus de 7 familles différentes ont ainsi été rapportés, 11 d’entre eux sont décédés in utero (10 lors d’une interruption médicale de grossesse et 1 mort fœtale in utero), 1 lors de l’accouchement et 1 enfant est décédé à 6 ans. Des mutations d’ERCC5/XPG était retrouvées chez 77% (10/13) d’entre eux. Les 1ers signes cliniques sont retrouvés à l’échographie entre 20 et 32 semaines d’aménorrhées, plutôt aspécifique avec pour la majorité d’entre eux une arthrogrypose (9 cas), une réduction des mouvements fœtaux (8 cas), et/ou une microcéphalie (7 cas). Devant ces anomalies, 3 IRM fœtales in utero ont été réalisées mettant en évidence pour tous une hypoplasie cérebelleuse.10 fœtus ont eu une autopsie post-natale avec analyse microscopique notamment cérébrale et 2 un examen post-natal mini invasif (IRM + examen macroscopique).  A l’examen post-natal on retrouve une microcéphalie pour la totalité des cas (100% ; 12/12), une dysmorphie pour 83% (10/12) d’entre eux (essentiellement une micrognathie et des oreilles basses implantées), un RCIU pour 72% (8/11) et une cataracte uniquement pour 33% (3/9) d’entre eux. Sur le plan cérébral, 70% (7/10) des cas présentaient des anomalies de la fosse postérieure (à type d’hypoplasie ponto-cérebelleuse ou hypoplasie cérébelleuse isolée), 70% (7/10) une dilatation des ventricules latéraux et 50% (6/12) un retard de maturation corticale. Au total 11 présentaient un phénotype correspondant au syndrome cérébro-oculo-facio-squelettique (COFS), 1 avec un phénotype de trichothiodystrophie et une patiente avec un syndrome de Cockayne de type 2.

Les anomalies associées aux syndromes de la voie NER en anténatal diffèrent des atteintes retrouvées habituellement en post-natal avec notamment une plus forte prévalence des anomalies cérébrales à type de malformation corticale notamment hypoplasie ponto-cérébelleuse qui pourraient attirer l’attention des cliniciens en l’absence de la totalité des critères cliniques habituellement associés à ces pathologies en post-natal.

Introduction

L’analyse d’exome a pris une place prépondérante dans le bilan étiologique des syndromes malformatifs avec un rendement diagnostique pouvant être estimé entre 25 et 40% selon les études, leur ancienneté, le design (solo, trio, autre), le cadre diagnostique ou l’extension en recherche contribuant à identifier de nouveaux gènes et/ou nouveaux mécanismes physiopathologiques. Dans un premier temps, l’exome a été utilisé en période post-natale (patients vivants ou décédés dont post-IMG). Depuis quelques temps, la prescription s’est élargie au contexte prénatal devant des signes d’appel échographiques afin de tenter de préciser le pronostic de grossesses. Ce travail a pour but de contribuer à évaluer l’apport de l’exome, comprenant la détection des CNV, dans ce cadre.

Méthode

Les exomes ont été prescrits par différents médecins intervenant au sein de CPDPN entre juin 2020 et aout 2021 inclus pendant ou après ACPA. Les interprétations ont été réalisées au laboratoire Eurofins Biomnis et au CHU de Saint-Etienne à l’aide de la plateforme bioinformatique SeqOne pour les SNV et un pipeline interne pour les CNV, après séquençage Illumina.

Résultats

Quarante analyses ont été réalisées. Il existait une atteinte de plusieurs organes dans 11 à 13 cas (2 cas diagnostiqués en cours de récupération de données complémentaires). Le motif principal d’atteinte d’organe isolée était une anomalie du corps calleux dans 9 cas (22,5%) sur 13 cas (32,5%) d’anomalies uniquement cérébrales. Dans 22/37 cas, la recevabilité d’une IMG pouvait s’envisager avant la prescription.

Au total, 10/40 diagnostics (25%) ont été posés dont 1 duplication intra-génique. Dans un autre cas, un variant chromosomique (vu en ACPA et sur le pipeline CNV) prédisposant aux troubles neurodéveloppementaux pouvait participer à l’anomalie isolée du corps calleux (sans autre cause identifiée).

Parmi les syndromes polymalformatifs, 4/11 à 6/13 diagnostics ont été posés ; parmi les anomalies du corps calleux isolées, 0/9 diagnostic posé (intérêt pour réduire le risque résiduel dans la majorité).

Concernant l’apport de l’exome pour le pronostic pour les 8 cas diagnostiqués avec données cliniques suffisantes :

- pour 6 cas, l’apport de l’exome a été principalement diagnostique, les signes en imagerie étaient déjà associés à un pronostic réservé ;

- dans 1 cas, le résultat a permis de rassurer le couple (polydactylie isolée des 4 extrémités) ;

- dans 1 cas, le résultat a permis de diriger la surveillance échographique et envisager un pronostic possiblement moins marqué (SLC26A2/DTDST).

Discussion

Il s’agit d’une cohorte hétérogène avec prescription débutante d’exome en prénatal rendant la pertinence des pourcentages limités. Plus les tableaux seront légers, plus le rendement diagnostique attendu diminuera. Des tests supplémentaires en cours vont enrichir la cohorte.

Il existe un intérêt à détecter les CNV pour le diagnostic et à une concertation régulière génétique-imagerie pour préciser le pronostic.

Introduction

Le rendement diagnostique de l’exome dans les anomalies du développement est de 35 à 40 %, laissant plus de la moitié des patients sans diagnostic. Solve-RD, un projet européen Horizon 2020, a pour but de résoudre l’impasse diagnostique et d’identifier les causes moléculaires des maladies rares génétiques non connues. Le projet agrège près de 19000 exomes et génomes de patients sans diagnostic partagés par les réseaux européens de référence (ERN) pour réanalyser les données à l’aide de pipelines bioinformatiques automatisés et standardisés. Parmi ceux-ci, celui dédié à la recherche de variations (probablement) pathogènes dans ClinVar dans les données des patients permet d’identifier rapidement les variations présentant un intérêt clinique. Nous présentons les résultats de cette réanalyse, appelée « ClinVar low-hanging fruits », les raisons de l’absence de diagnostic au moment de la première analyse et les leçons à en tirer.

Méthodes

À partir des données brutes des cas non résolus de la cohorte ERN-ITHACA, nous avons retenu les SNV et indels 1) situés dans des gènes associés à la déficience intellectuelle ou aux troubles du neurodéveloppement (1740 gènes) 2) de fréquence allélique dans gnomAD <  1 % et dans la base de données interne RD-Connect <  2 % et 3) rapportés dans ClinVar comme étant pathogènes ou probablement pathogènes. Les résultats ont été retournés aux centres d’inclusion pour une interprétation clinico-biologique.

Résultats

Nous avons réanalysé 1522 cas, priorisé 147 variations et retenu 9 variations permettant 9 nouveaux diagnostics :

- 2 faux-sens de novo dans des gènes non connus en pathologie humaine au moment de la première analyse : 1 dans TRRAP associé à un retard de développement depuis 2018 ; 1 dans NFIA rapporté morbide dans OMIM depuis 2017.

- 3 variations mal interprétées : 1 d’épissage dans SYNGAP1 qui n’avait pas été retenue ; 1 faux-sens dans PTEN qui avait été rendu comme étant de signification incertaine car hérité de la mère paucisymptomatique ; 1 indel homozygote dans ANO10 qui avait été lue comme hétérozygote du fait d’un alignement mal interprété sur IGV.

- 4 variations non détectées ou filtrées par les pipelines locaux : 1 faux-sens dans TUBB3 situé dans une région non ciblée par le kit d’enrichissement ; 1 faux-sens dans TUBB éliminé du fait d’une faible profondeur de couverture ; 1 en mosaïque dans EEF1A2 non identifiée car seuls quelques reads la soutenaient ; 1 frameshift dans FKBP14 filtré car annoté « commun » dans dbSNP (6ꞏ10^-4 dans gnomAD), responsable dans 70 % des cas de la pathologie.

Conclusion

La réanalyse « ClinVar low-hanging fruits » des cas négatifs de la cohorte ITHACA, montre l’utilité d’une réanalyse systématique des exomes négatifs, notamment ciblée sur les variations rapportées (probablement) pathogènes dans ClinVar, avec des critères peu stricts. Des outils développés par la communauté comme VariantAlert permettent de réaliser une telle réanalyse à mesure des soumissions dans ClinVar.

L'holoprosencéphalie (HPE ; MIM# 236100) est la malformation cérébrale congénitale la plus fréquente (1 sur 10 000 naissances vivantes, 1 sur 250 conceptions). Elle résulte d'un défaut de clivage médian du prosencéphale, entre le 18e et le 28e jour de gestation, affectant à la fois le cerveau antérieur et le visage.

Le spectre phénotypique est très large, allant de l'HPE alobaire sévère avec ventricule cérébral unique et cyclopie jusqu'aux porteurs asymptomatiques dans le cas des HPE familiales. Trois classes anatomiques classiques ont été décrites, par ordre décroissant de gravité : HPE alobaire, semi-lobaire et lobaire. Le spectre complet du HPE comprend également des microformes caractérisées par des anomalies de la ligne médiane craniofaciale, avec fente labiale/palatine, hypotélorisme, colobome, microcéphalie, sténose des sinus piriformes et/ou incisive médiane maxillaire unique (IMU).

Les bases génétiques de l'HPE ne sont que partiellement comprises car ∼70% des cas familiaux restent sans cause moléculaire établie. Différents modes de transmission ont été décrits, notamment l'hérédité autosomique dominante, récessive, digénique et oligogénique, illustrant l'architecture génétique complexe de ce spectre. La plupart des variants pathogènes rapportés présentant une pénétrance incomplète et une expressivité variable, les modificateurs génétiques apparaissent désormais comme des modulateurs clés du phénotype de cette pathologie.

La plupart des gènes d'HPE connus appartiennent à la voie Sonic Hedgehog (SHH) - une cascade moléculaire complexe qui joue un rôle central dans le développement du cerveau. Le principal effet commun des variants pathogènes identifiés est l'altération de l'activité de la voie SHH, ce qui entraîne une perturbation de la ligne médiane ventrale du cerveau.

DISP1 est un facteur positif nécessaire à la sécrétion efficace du morphogène SHH et à l'établissement de son gradient de concentration le long de la ligne médiane du tube neural. Les souris déficientes (KO) Disp1 présentent une HPE sévère associée à une cyclopie et une signalisation SHH défectueuse. Chez l'homme, des études génétiques supplémentaires sont nécessaires pour élucider le rôle précis de DISP1 dans la pathogénèse de la maladie.

Dans cette étude, nous décrivons la première cohorte de patients atteints d'HPE et présentant des variants de DISP1. Nous élucidons la contribution de DISP1 à l'HPE en effectuant une évaluation de la pathogénicité des variants de DISP1 associés à l'HPE. Nous décrivons une cohorte de 28 individus issus de 23 familles non apparentées, en regroupant les variants de DISP1 retenus lors du diagnostic moléculaire dans notre laboratoire, ainsi que les résultats obtenus en collaboration et ceux publiés précédemment.  Nous analysons plus précisément le spectre clinique de l'HPE associée à DISP1, nous donnons un aperçu du processus pathologique sous-jacent et nous décrivons des facteurs modulant les conséquences phénotypiques des variants de DISP1.

Le syndrome hamartomateux lié au gène PTEN, ou PHTS (PTEN-related Hamartoma Tumor Syndrome), est un syndrome de prédisposition au cancer dans lequel on décrit diverses anomalies cérébrales : fistules artério-veineuses durales (FAVD), tumeurs cérébelleuses de Lhermitte-Duclos (TLD), malformations d’Arnold-Chiari (MAC) et des anomalies veineuses du développement (AVD). Les FAVD sont rares, leur développement est lent et pauci-symptômatique mais leurs conséquences parfois fatales. Les TLD, dont la fréquence parmi les patients PHTS varie de 9 à 50%, et les MAC, dont la fréquence est comprise entre 12 et 33%, nécessitent parfois des interventions neurochirurgicales. Malgré cela, il n’existe pas de consensus d’exploration ni de suivi par imagerie cérébrale chez ces patients. 

Le but de notre étude était de quantifier et de décrire les anomalies cérébrales afin de proposer un protocole d’exploration. Elle a porté sur une série de patients diagnostiqués dans le laboratoire de génétique moléculaire de la Pitié-Salpêtrière dont nous avons relu les IRM cérébrales. Nous avons inclus 58 patients. L’âge moyen était de 15.7 ans [0.6 ; 55.9] au moment du diagnostic avec un sex ratio H/F de 1.9. Les portes d’entrée diagnostiques étaient diverses : oncogénétiques, enquête familiale, trouble du neurodéveloppement/macrocéphalie ou malformation vasculaire. Deux patients avaient une FAVD, suggérant un risque supérieur à celui de la population générale (incidence de 0.3/100 000/an). Alors que les FAVD se manifestent généralement après 50 ans, ces deux patients étaient âgés de 21 et 36 ans. Les patients n’ayant pas tous bénéficié des séquences d’IRM dans le but de visualiser les anomalies vasculaires, ce chiffre est possiblement sous-estimé. Par ailleurs, 10,3 % des patients avaient une AVD dont un symptomatique (épilepsie). 63,2% avaient des anomalies non progressives de la substance blanche. La fréquence des TLD était de 12,3 %, celui de MAC de 14,0% et un patient présentait un méningiome, ce qui est en cohérence avec les données de la littérature existante. Il n’y avait ni cavernome ni dysplasie corticale.

Ces observations confirment l’intérêt d’une IRM cérébrale systématique chez les patients porteurs d’un variant pathogène dans le gène PTEN. Nous proposons un protocole de surveillance comprenant : 1) une séquence T1 sans injection et 2) FLAIR pour éliminer une MAC, faire le bilan des anomalies de la substance blanche et vérifier l’intégrité du cortex ; 3) une susceptibilité magnétique SWI ou SWAN, ou à défaut une T2*, afin de visualiser les lésions d’allure vasculaire de type cavernome ou AVD ; enfin, la recherche systématique d’une FAVD implique 4) l’acquisition avec injection en 5) ARM dynamique, ainsi qu’une 6) séquence perfusion ASL à la recherche de shunts vasculaires ou d’AVD puis 7) une séquence d’angio-IRM en temps de vol (grand 3D-TOF). Les FAVD étant des lésions qui se développent, une répétition de cet examen est envisageable tous les 5 à 7 ans.

La vision, considérée comme le sens le plus complexe, le plus développé et le plus important, semble particulièrement affectée chez les patients FXS. Des preuves relient également directement les anomalies sensorielles à l'expression clinique des troubles du comportement chez les personnes atteintes de FXS.

En utilisant l'électrorétinographie (ERG) et la sensibilité au contraste (CS), nous avons précé-demment décrit la présence de déficits sensoriels dans le système visuel du modèle de souris Fmr1-/y (Ros-signol et al, 2014 ; Perche et al, 2018 ; Felgerolle et al, 2019). La présente étude rapporte une approche similaire dans une cohorte de garçons avec FXS (n=20, 18-45 ans) et de témoins appariés en âge (n=20, 18-45 ans). L'enregistrement des données a été réalisé avec succès pour l'ERG et le CS chez la plupart des individus. Des anomalies de l’ERG et CS similaires à celles observées chez le modèle souris Fmr1-/y ont été caractérisées chez les sujets avec FXS.

Notre étude montre la pertinence d'utiliser l’ERG et CS pour évaluer le système visuel dans le FXS. La similitude du phénotype humain et du modèle souris valide l’utilisation de ce modèle animal pour l’étude préclinique du déficit sensoriel visuel chez l’homme.

Enfin, en objectivant un phénotype électrophysiologique (ERG) associé à un phénotype fonction-nel, notre étude suggère la possibilité d’utiliser l'ERG et la CS (ERG-CS) comme biomarqueurs complémen-taires pour caractériser les anomalies sensorielles visuelles observées dans le FXS (Perche et al, in press).

Bibliographie :

Rossignol R et al. Visual sensorial impairments in neurodevelopmental disorders: evidence for a retinal phenotype in Fragile X Syn-drome. PLoS One. 2014;9(8):e105996

Perche O et al. Early Retinal Defects in Fmr1-/y Mice: Toward a Critical Role of Visual Dys-Sensitivity in the Fragile X Syndrome Pheno-type? Front Cell Neurosci. 2018;12:96

Felgerolle C et al. Visual Behavior Impairments as an Aberrant Sensory Processing in the Mouse Model of Fragile X Syndrome. Front Behav Neurosci. 2019;13:228

Perche et al. Electroretinography and contrast sensitivity, complementary translational biomarkers of sensory deficits in the visual system of individuals with Fragile X Syndrome. J Neurodev Disord. 2021; in press.

Contexte :

Le syndrome de CANVAS (Cerebellar Ataxia, Neuropathy, Vestibular Areflexia Syndrome) est une maladie autosomique récessive rare d’apparition tardive, caractérisée par une atteinte cérébelleuse lentement progressive (démarche ataxique, nystagmus, dysarthrie), une atteinte vestibulaire bilatérale, une neuropathie sensitive axonale ainsi qu’un syndrome dysautonomique. La présence d’une toux chronique antérieure à l'apparition du tableau neurologique est fréquente. La prévalence de ce syndrome serait de 1 sur 20 000 dans la population caucasienne soit plus fréquent que l’ataxie de Friedreich.

Récemment, une expansion bi-allélique d’un pentanucléotide (AAGGG) dans l’intron 2 du gène RFC1 a été identifiée comme la cause moléculaire de ce syndrome (Cortese et al. Nature Genetics 2019).

Méthode :

Nous rapportons le bilan de 2 ans de diagnostic moléculaire du syndrome de CANVAS par analyse des expansions RFC1 par RP-PCR et PCR longue, chez 130 familles (120 cas sporadiques et 10 cas familiaux) présentant une ataxie d’apparition tardive.

Résultats :

Au sein de notre cohorte, nous avons pu identifier une expansion pathologique du pentanucléotidique AAGGG dans le gène RFC1 chez 50% des cas index à l’état homozygote et chez 9% à l’état hétérozygote.

Des profils de PCR longue atypiques ont parfois été identifiés chez certains de ces patients. Le séquençage Sanger des allèles a permis de mettre en évidence des expansions complexes non-décrites à ce jour et dont la signification est inconnue.

Nous constatons une forte hétérogénéité clinique chez nos patients présentant l’expansion pathogène à l’état bi-allélique (AAGGG) :

- 25% avec un syndrome de CANVAS (triade : Ataxie, Neuropathie, Vestibulopathie dont 5% présentent un phénotype plus complet : triade + toux chronique + dysautonomie). 

- 48% au moins 2 signes (Ataxie + Neuropathie ou Neuropathie + Areflexie Vestibulaire)

- 27% 1 seul signe (majoritairement la Neuropathie).

Nous notons que la neuropathie sensitive est quasi constante (99%) et que la toux chronique est retrouvée chez 58 % des patients porteurs de l’expansion à l’état homozygote.

Nous ne disposons pas toujours des résultats des investigations cliniques (IRM et EMG) ce qui explique peut-être des phénotypes incomplets.

Conclusion :

Notre étude permet de confirmer la forte implication du gène RFC1 dans les ataxies d’apparition tardive associées à une neuropathie sensitive. L’absence de neuropathie sensitive rend le diagnostic de CANVAS peu probable, justifiant la nécessité d’une bonne caractérisation clinique de l’atteinte neurologique afin d’optimiser le criblage génétique. A l’heure du séquençage haut-débit systématisé, il apparait justifié d’exclure une expansion bi-allélique du gène RFC1 avant toute étude génomique (recommandations du PFMG2025), au vue la grande proportion de CANVAS identifiée sur le plan moléculaire au sein de notre cohorte.

Les neurodégénérescences avec accumulation intracérébrale de fer, ou NBIA (pour Neurodegeneration with Brain Iron Accumulation) constituent un groupe de pathologies héréditaires très rares, ayant pour dénominateur commun une accumulation excessive de fer dans les ganglions de la base du cerveau visible en IRM cérébrale. L’IRM cérébrale est en général l’examen clé révélant la surcharge en fer. Les signes cliniques sont variables, dominés par des mouvements anormaux (dystonie, parkinsonisme, chorée, ataxie, spasticité), des troubles du comportement et des troubles cognitifs. L’âge de début est très variable de même que l’évolution, pouvant conduire en quelques années au décès ou être d’évolution lente avec des périodes de stabilité. Des variants pathogènes de NBIA ont été identifiés dans une quinzaine de gènes différents, la plupart étant soumis à une hérédité autosomique récessive (AR).

Les variants pathogènes de C19ORF12 sont à l’origine de la NBIA type 4 ou Mitochondrial membrane Protein Associated Neurodegeneration (MPAN) dont la présentation classique débute au cours de la première décennie par des troubles de la marche de type cérébellospastique. Les symptômes fréquents sont des difficultés d’apprentissage, des troubles psychiatriques qui peuvent être présents dès la petite enfance, une dysarthrie, une dystonie habituellement limitée aux pieds et aux mains et une atrophie optique quasi constante avec une baisse d’acuité visuelle. La transmission est AR. Récemment quelques familles avec MPAN de transmission autosomique dominante ont été décrites avec des présentations cliniques et des âges de début relativement similaires aux formes classiques ( AR.

Nous décrivons 8 patients supplémentaires de MPAN dominant issus de 5 familles et identifiés par séquençage haut-débit d’un panel de 9 gènes impliqués dans les NBIA. Le tableau clinique et paraclinique des 8 patients est très détaillé, reproduisant en partie les données de la littérature.  Cependant de façon plus originale, un phénotype très fortement évocateur d’une démence fronto-temporale a été relevé chez plusieurs patients, éventuellement associé à une atteinte du motoneurone (suspicion de DFT-SLA). Les variants pathogènes hétérozygotes dans C19ORF12 sont tous de type tronquant (3 non-sens et 1 délétion d’une base), localisés dans le 3^ème exon  codant la moitié C-terminale de la protéine. Le cerveau d’un patient décédé a été analysé, révélant des anomalies déjà décrites, incluant des corps de Lewy abondants dans les ganglions de la base. Enfin sur le plan fonctionnel, nous avons obtenu des cultures primaires de fibroblastes de 3 de ces patients permettant d’analyser les fonctions mitochondriales, l’autophagie et le métabolisme du fer. Les données obtenues suggèrent une homéostasie anormale du fer, et des défauts de biogénèse mitochondriale ou de mitophagie chez les patients présentant une forme dominante.

L’achondroplasie est une maladie osseuse constitutionnelle autosomique dominante causée par la présence du variant pathogène récurrent p.Gly380Arg du gène FGFR3, responsable d’une anomalie de l’ossification endochondrale et de la fermeture prématurée des synchondroses. Les patients présentent un sur-risque de mort subite dans la première année de vie due à une myélopathie compressive secondaire à un rétrécissement significatif du foramen magnum (FM). Un suivi multidisciplinaire incluant une IRM de la charnière cranio-vertébrale (CCV) et une polysomnographie vers l’âge 6 mois est préconisé afin d’identifier les patients nécessitant une chirurgie de décompression. Cependant, la corrélation entre la dimension du FM et le risque de complications neurologiques n’est pas complétement élucidée et l’évaluation de l’indication neurochirurgicale reste complexe.

Nous avons réalisé une étude rétrospective des patients suivis dans notre centre entre 2008 et 2020 afin de mieux caractériser les modifications anatomiques précoces de la CCV et leur évolution et de proposer des critères anatomiques de sévérité.

Des mesures anatomiques de la CCV ont été réalisées sur l’IRM cervicale des 21 patients et 84 contrôles sains, en aveugle par deux radiologues. L’âge médian à l’IRM était de 1,5 ans pour les filles et de 5,4 ans pour les garçons. Les 21 patients ont bénéficié d’une ou plusieurs IRM avec un temps moyen de suivi de 5,7 ans. Les données cliniques et de polysomnographie disponibles ont également été collectées afin d’évaluer la corrélation entre l’évolution radiologique et clinique.

Une sténose de la CCV a été retenue chez 52,4% des patients, dans tous les cas avant 2 ans. Notre étude confirme la diminution du FM (13,6±6,2mm vs 28,5±4,7mm, p<0,001) en accord avec la littérature. Cependant, nous avons observé chez tous les patients présentant une sténose de la CCV que celle-ci n’est pas liée au diamètre du FM mais plutôt au diamètre antéro-postérieur entre la dent de C2 et l’opisthion (8,7±3,9mm vs 24,6±5,1mm, p<0,001). D’autres modifications anatomiques précoces incluent un antelisthesis de l’opisthion, une bascule postérieure de C1-C2, un épaississement de la dent de C2. Nous avons donc défini 3 formes anatomiques de CCV à l’IRM chez les nourrissons porteurs d’achondroplasie : 1) absence de sténose, 2) compression postérieure, 3) association de compressions postérieure et antérieure (en « Z »). Concernant le pronostic, tous les nourrissons dont le diamètre C2-opisthion était supérieur à 6 mm ont présenté une bonne évolution clinique et radiologique spontanée. L’absence d’apnée centrale ne semble pas être un argument permettant d’écarter une sténose sévère.

Une étude prospective à l’échelle nationale concernant une série plus large de patients serait souhaitable pour confirmer ces résultats préliminaires, dans le but de mieux préciser l’indication de la prise en charge neurochirurgicale des patients achondroplases dans la première année de vie.