Introduction Les cardiomyopathies dilatées (CMD) ont une prévalence estimée à 1:250 et sont une des causes de la mort subite cardiaque. Des variants pathogènes (P) ou probablement pathogènes (LP) liés à une transmission autosomique dominante de CMD ont été rapportés dans plus de 50 gènes. Cependant, des variants de signification incertaine (VSI), ne permettant pas d’apporter un conseil génétique sans étude fonctionnelle complémentaire, sont identifiés chez un grand nombre de patients (36,5 % dans notre étude récente portant sur 1300 patients atteints de CMD). Les variants P ou LP du gène RBM20 sont responsables de plus de 3% des cas de CMD et sont associées à un mauvais pronostic. En se fixant à l’ARN, RBM20 favorise la synthèse de l’isoforme cardiaque de gènes d’expression musculaire et cardiaque (TTN, RYR2,…). Objectifs Le projet visait à mettre au point une méthode d’exploration des VSI du gène RBM20. Matériel & Méthodes Le modèle retenu est basé sur la co-transfection de cellules HEK293T par un vecteur d’expression contenant l’ADN complémentaire du gène RBM20 et par un vecteur minigène rapporteur. Les variants à tester (six pathogènes et deux bénins pour mise au point et validation de la méthode ; onze VSI) ont été introduits par mutagénèse dirigée. Après extraction des ARN totaux, rétrotranscription, l’impact fonctionnel des VSI est évalué via séquençage MinION (Oxford Nanopore) et analyse du profil d’épissage du minigène rapporteur par SashimiPlot. Résultats Après validation de la méthode, trois des 10 VSI explorés montrent un profil d’épissage anormal et peuvent donc être reclassés comme variant LP et utilisés pour le conseil génétique. Conclusion Ce test fonctionnel peut être proposé lorsqu’un VSI candidat faux-sens est identifié dans le gène RBM20 afin de mieux appréhender son éventuel caractère pathogène. Sa réalisation a ainsi pu être transférée vers le laboratoire de diagnostic moléculaire du CHU de Lyon.

Contexte : Les malformations cardiaques congénitales (MCC) sont les malformations congénitales les plus fréquentes et associées à une importante morbi-mortalité. Grâce aux progrès considérables de la chirurgie et de la réanimation cardiaque ces dernières décennies, les patients guéris de leur MCC arrivent en âge de procréer et sont en demande croissante de conseil génétique. Jusqu’alors le risque de récurrence familiale de MCC était seulement estimé de manière empirique par des études observationnelles populationnelles. Les études génétiques, quand elles sont contributives permettent de donner un risque de récidive plus précis et d’orienter le dépistage familial. Objectif : Établir un bilan du diagnostic génétique des MCC non-syndromiques familiales en France et évaluer l'apport des différentes techniques diagnostiques. Méthodes : Étude rétrospective multicentrique incluant les familles avec au moins deux individus atteints de MCC au premier ou second degré, avec une analyse génétique réalisée dans les laboratoires du CHU de Bordeaux, du CHU d'Amiens-Picardie, ou sur les plateformes SeqOIA et AURAGEN du Plan France Médecine Génomique 2025 (PFMG). Les analyses comprenaient l'analyse chromosomique par puce à ADN (ACPA), des panels de gènes (14, 92 puis 320 gènes au CHU de Bordeaux, panel 110 puis 320 gènes au CHU d'Amiens) et le séquençage du génome. Résultats : 239 individus issus de 87 familles ont été inclus (médiane de 2 individus atteints par famille). Les phénotypes prédominants étaient la tétralogie de Fallot (17,2%), les communications inter-atriales (10,3%) et le syndrome d'hypoplasie du cœur gauche (10,3%). Un diagnostic moléculaire a été établi dans 35 familles (40,2%) avec 15 diagnostics monogéniques différents. Les gènes les plus fréquemment impliqués étaient NOTCH1 (8%), MYH6 (6,8%), puis NKX2.5 (3,4%) et ELN, JAG1 et RBFOX2 (2,3% chacun). Le séquençage du génome s'est révélé l'approche la plus contributive (37,1% des diagnostics), permettant notamment la détection de variants de structure non identifiables par d'autres techniques. Conclusions : Cette première description mondiale d’une cohorte de MCC non-syndromiques familiales étudiées par NGS confirme l’intérêt du diagnostic moléculaire dans ces familles avec un rendement diagnostique élevé de 40,2%. De plus, le dépistage cardiologique des apparentés du 1er degré est primordial afin de ne pas méconnaitre une forme familiale et d’aider à l’interprétation moléculaire. L'étude souligne l'apport du séquençage du génome et met en évidence l'émergence de nouveaux gènes candidats rares comme RBFOX2, justifiant des collaborations internationales pour mieux caractériser leur implication.

La filamine C, codée par le gène FLNC, est une protéine cytosolique exprimée dans les cellules musculaires et cardiaques. Les variants nuls de ce gène sont principalement associés au développement de cardiomyopathies dilatées (CMD). Toutefois, peu de données existent sur le lien entre les délétions d’exons en phase et le développement de CMD. Dans ce travail, le phénotypage d’un modèle zebrafish a été utilisé afin d’évaluer l’implication de délétions d’exon en phase du gène FLNC dans le développement de la CMD (exons 2, 25 et 42, dont certaines identifiées chez des patients atteints de CMD). Le taux de survie, ainsi que les phénotypes musculaires et cardiaques d’embryons de zebrafish injectés au stade unicellulaire par 2ng de morpholino (MO) (ARN antisens modifiant l’épissage) ciblant les exons 2 (MO2), 25 (MO25) et 42 (MO42) du gène orthologue de FLNC chez le poisson-zébre flncb, ont été comparés aux contrôles adaptés (contrôle négatif p53, et positif MO11 ciblant l’exon 11 publié comme responsable de CMD (Begay, 2016)). La validation de l’effet des MO a été réalisée par RT-PCR. Le phénotype cardiaque est évalué par la présence d’œdème cardiaque à 3 jours post fertilisation (dpf). Le phénotype musculaire à 5dpf est évalué par 1) la mesure de la distance parcourue en 20min (tracking automatisé, DanioVision), 2) l’évaluation de la masse musculaire en loupe à polarisation et 3) la réalisation d’immunomarquage de la myosine (MF20) et de l’actine (phalloïdine). L’analyse statistique a été faite par test de Fisher et Mann Whitney. Le taux de survie à 5dpf des zebrafish MO2 (n=94, 69%), MO11 (n=27, 52%), MO25 (n=83, 30%) et MO42 (%, n=33) n’est pas significativement réduit comparé au contrôle p53 (n=154, 63%). Les zebrafish MO25 présentent une proportion d’œdèmes cardiaques à 3dpf significativement plus importante (18%) que le contrôle p53 (0,6%, p=10-8) et comparable au contrôle CMD MO11 (11%, p=0.19). Les zebrafish MO2 et MO42 ne présentent pas d’œdème cardiaque. La distance parcourue en 20min est significativement réduite pour les zebrafish MO2 (269+/-426mm, p= 2.10-6, n=8), MO25 (542+/-617mm, n=11, p=2.10-5), et MO11 (523+/-929mm, n=10, p=1.10-4) et normale pour les MO42 (1994+/-1290mm, n=12, p=0.44) en comparaison au contrôle p53 (2097+/-1069mm, n=24). Une réduction de la masse musculaire en biréfringence associée à une désorganisation des sarcomères par immunomarquage pour les MO2, MO11 et MO25 a été observée. En conclusion, ce travail conforte l’implication fonctionnelle du saut en phase de l’exon 25 comme possible cause de CMD. Les phénotypes musculaires décrits, sont nouveaux mais cohérents avec la fonction de la protéine, en particulier pour le saut de l’exon 2 localisé dans le domaine de liaison à l’actine. Le modèle zebrafish offre la possibilité de réaliser des tests fonctionnels sur des variants identifiés chez les patients dans une délai rapide (<6mois) et se place comme un outil intéressant pour l’exploration post génomique des variants.

L’un des contributeurs majeurs de l’athérosclérose est l’hypercholestérolémie sévère (HS). Elle correspond à une entité multi étiologique définie par des valeurs de LDL Cholestérol (LDL-C) supérieures à 1,90 g/L (4,9 mmol/L). L’étiologie la mieux caractérisée est l’hypercholestérolémie familiale dont le dépistage génétique représente un défi sanitaire mondial puisqu’elle entraine un surrisque cardiovasculaire. Elle ne représente cependant qu’un tiers des HS et la prévalence des autres étiologies comme l’hypercholestérolémie polygénique, évaluée par des scores de risque génétique (GS), restent largement à préciser. Notre étude à pour but de mieux caractériser l’HS, d’évaluer les prévalences de ses étiologies afin d’améliorer la prise en charge des patients dont le diagnostic moléculaire est négatif. Depuis 2015, nous avons dépisté plus de 5000 cas index par une approche NGS sur les gènes responsables de l’HF (LDLR, APOB, PCSK9 et APOE). Sur 4564 patients (≥ 18 ans, LDL-C ≥ 1,90 g/L, TG < 4 g/L), 1 816 cas présentent un variant pathogène ou vraisemblablement pathogène (M+), 2481 ne présentent pas de mutation (M-) et 267 un variant de signification inconnue. Dans une approche combinant la distribution des déciles de concentration LDL-C de l’ensemble des patients (M+ et M-) et la distribution des déciles des valeurs de GS des patients M+, puis en appliquant un modèle additif généralisé nous avons obtenu des distributions modélisées pour les patients M+ et M-. Le biais de distribution des patients, les données relatives au risque cardiovasculaire et les variations du LDL-C au cours du suivi indiquent que les patients M- du 1er décile présentent les caractéristiques de l'HF monogénique, ce qui est validé par la mise en évidence de nouvelles altérations génétiques par une approche Long Read Sequencing. Par ailleurs, 50 % des patients M- regroupés sur seulement 25 % de notre nouvelle distribution combinée (déciles 6 à 10) permettent de définir les caractéristiques de l’hypercholestérolémie d’origine polygénique. Grâce à cette approche il est possible de caractériser plus de 70 % des HS. D’une part en précisant les limites de l’hypercholestérolémie polygénique qui représente la moitié des patients sans mutation qui peuvent ainsi bénéficier d’un diagnostic moléculaire. D’autre part, elle identifie les patients pour lesquels des investigations génétiques supplémentaires sont nécessaires.

Contexte : Les maladies rares, principalement de cause génétique, affectent 250 millions de personnes dans le monde. Dans les maladies autosomiques dominantes comme les cardiomyopathies dilatées (CMD), le taux diagnostic ne dépasse pas 40%, menant à une perte de chance pour les patients en impasse diagnostique. Les variants d’épissage échappent fréquemment aux approches de séquençage ADN standards, car situés dans des régions peu couvertes ou d’interprétation difficile. Leur effet transcriptionnel peut cependant être révélé par séquençage de l’ARN. Alors que la technologie Short-Read (SR-ARN-seq) peine à restituer la complexité du transcriptome, le séquençage ARN Long-Read (LR-ARN-Seq) permettant le phasage haplotypique pourrait s’imposer comme un outil prometteur pour détecter des altérations transcriptionnelles jusqu’ici inaccessibles. Objectif : Evaluer l’apport du séquençage ARN Long-Read et du phasage haplotypique pour réduire l’impasse diagnostique en particulier chez les patients CMD. Méthodes : Nous avons réalisé un séquençage d’exome et de transcriptomes par LR-ARN-Seq et SR-ARN-Seq pour 25 échantillons de coeurs explantés de patients CMD. Les anomalies de structures des transcrits patient-spécifiques ont été explorées avec FRASER, avec ou sans phasage haplotypique. Résultats : L’approche LR-ARN-Seq permet de détecter 90% des variants identifiables sur l’exome, à une couverture minimale de 20X, compatible avec la détection de mutations dans la majorité des gènes associés aux maladies génétiques rares. Dans les gènes d’intérêt, le taux diagnostic en LR-ARN-Seq ou en exome est identique avec 11 mutations identifiées (~40%). En élargissant à l’ensemble des gènes, l’analyse d’épissage par LR-ARN-Seq permet d’augmenter de 50% le taux de détection d’épissages aberrants par rapport au séquençage de l’exome. Cette amélioration s’explique notamment par l’identification de variants non accessibles (dont 17% de pseudo-exons) ou insuffisamment prédits in silico : 60% des variants causaux retrouvés ont une prédiction faible ou intermédiaire (score SpliceAI ou Pangolin < 0.8). À l’inverse, l’abaissement des seuils de prédiction à partir de l’ADN génère de nombreux faux positifs, avec 83 % des variants prédits (SpliceAI > 0,2) sans impact réel sur l’épissage. Le LR-ARN-Seq surpasse le SR-ARN-Seq avec 70% d’évènements d’épissage identifiés en plus, principalement dans les régions répétées. Le phasage, possible uniquement en LR et qui concentre l’analyse sur l’haplotype porteur du variant, amplifie la puissance de détection des effets quantitatifs d’expression, et permet d’identifier 25 évènements d’épissage aberrant supplémentaires. Conclusion : Le séquençage ARN Long-Read améliore nettement la détection des anomalies transcriptionnelles et révèle des mécanismes potentiellement pathogènes inaccessibles aux approches classiques. Il constitue ainsi une piste prometteuse pour réduire l’impasse diagnostique dans les maladies mendéliennes.

Contexte: Les cardiomyopathies héréditaires, à transmission autosomique dominante, permettent l’identification du variant causal dans 35% des cas par séquençage d’ADN génomique (ADNg). Les variants d’épissage expliqueraient une partie des formes non résolues, mais leur détection sur ADNg reste partielle, d’où l’intérêt de stratégies basées sur l’analyse des ARNm. Toutefois, le caractère tissu-spécifique des ARNm limite cette approche. Nous avons évalué, après optimisation analytique, une stratégie de NGS sur cellules sanguines avec capture ciblée des ARNm et ses conséquences pratiques sur la détection et la classification des variants. Objectifs : 1) Évaluer une approche de NGS ciblé sur ARNm de cellules sanguines pour déterminer l‘impact des variants affectant l’épissage dans MYBPC3. 2) Identifier le type de prélèvement permettant de séquencer les ARNm des principaux gènes de cardiomyopathies. Matériel et méthodes: Nous avons sélectionné 26 variants (16 introniques et 10 exoniques) du gène MYBPC3 détectés sur l’ADN et affectant potentiellement l’épissage. A partir de sang/tubes PaxGene, les ARN polyA+ ont été rétro-transcrits, capturés avec un design de sondes optimisé pour les 28 gènes du panel CMH et séquencés sur un NextSeq550. Avec l‘objectif d’une optimistation de la méthode pour son extension à plusieurs gènes difficilement analysables,, nous avons évalué comparativement différentes techniques de prélèvements et de préparations des ARNm sanguins. Résultats: A partir des tubes PaxGene, la profondeur de couverture des jonctions de MYBPC3 est améliorée par la capture ciblée (x 1000), permettant une analyse fiable de l’épissage (RPM~6809, Profondeur moyenne ~ 2947X). Parmi 13 variants considérés comme des variants de signification incertaine, 11 (85%) ont pu être reclassifiés dont 10 en classe 4, soulignant l’intérêt majeur de cette approche dans la résolution de l’impasse diagnostique. La comparaison de la profondeur aux jonctions pour 3 types de prélèvements (PaxGene (n=64) ; LCL (n=32) et préculture cellulaire sur tubes ACD (n=64)) a permis de déterminer qu‘une profondeur minimale de 10X constitue le seuil minimal permettant l’interprétation des évènements d’épissage. Ce seuil est atteint dans plus de 80% des jonctions uniquement pour 50% et 46% des 28 gènes d’intérêts respectivement avec les approches PaxGene ou LCL. La préculture des cellules avant extraction démontre un meilleur rendement avec 79% des gènes d’intérêt accessibles, incluant les 9 gènes majeurs. Conclusion: Le séquençage ciblé des ARNm à partir de cDNA issus des cellules sanguines permet une amélioration de la classification des variants d’épissage. L’utilisation d’une culture courte sur ACD améliore significativement le nombre de gènes accessibles, donnant accès à 79% des gènes d’intérêt dont les 9 gènes majeurs. Un prélèvement simploe et l’émergence d’outils informatiques de criblage dédiés à l’ARN-Seq permettent d’envisager cette approche comme une méthode de diagnostic .