Apport  de l’IRMS  pour la connaissance des flux métaboliques cellulaires dans le développement du cancer du sein

La production de biomasse impose le flux des principales voies métaboliques des cellules en division. Pour pouvoir mieux connaitre la diffusion des espèces atomiques, la méthodologie présentée comprend l’utilisation de nutriments marqués en isotopes (²H et/ou ¹³C et/ou ¹⁵N) incorporées dans le développement de cultures cellulaires. La quantification de la production de biomasse correspondante est établie par l’utilisation de l’analyse élémentaire organique (analyse CHNO) et par l’analyse des rapports isotopiques correspondants. Cet ensemble d’outil analytique permet  non seulement de connaitre le devenir du nutriment enrichi en isotopes mais aussi d’obtenir un bilan quantifiable des macromolécules issues de la biomasse produite dans les différentes fractions cellulaires.

Contrairement à l’approche Métabolomique par spectrométrie de masse organique haute résolution, ces investigations basées sur la spectrométrie de masse des rapports isotopiques ne nécessitent pas de disposer de composés fortement marqués en isotopes grâce à la grande précision de mesure  de l’IRMS, tout en permettant l’analyse des macromolécules en plus des métabolites intermédiaires. De ce fait ces travaux se veulent complémentaires à la SM et aux approches immuno-enzymatiques classiques utilisés en biologie cellulaire. L’approche IRMS pourra donc constituer un nouvel outil pour la compréhension des dérégulations homéostatiques prenant place au sein des  cellules cancéreuses et d’apporter des informations sur les particularités métaboliques de différents types de cancer comme ceux existant au niveau de la glande mammaire.

La communication proposée montrera les premiers résultats obtenus à partir  des différentes  techniques isotopiques impliquées comprenant les couplages EA-IRMS, GC-C/P-IRMS et IC-co-IRMS et les perspectives de cette nouvelle méthodologie.

C-isotope fractionation during post-photosynthetic processes mainly during respiration has received increasing interest during the last two decades. We have shown that leaf-respired CO2 in the dark is in general 13C enriched in all plant types (C3, C4, herbs and woody species), while root-respired CO2 is 13C depleted compared with organic material of respective organs (except in roots of woody species). Data from literature have also shown a huge variability in C-isotope fractionation during plant respiration of up to 15 per mil among species and with environmental conditions. We investigated the metabolic origin of the isotopic signature of respired CO2 and its variability and demonstrated that for a given plant species, the heterogeneity in intra-molecular 13C distribution in hexose molecules, relative activities of different metabolic pathways associated with respiration mainly those fixing (enzyme PEPc activity via anaplerotic pathway) or releasing CO2 (pentose phosphate pathway, enzyme PDH reaction, and Krebs cycle), changes in respiratory pool sizes under different environmental conditions (drought, temperature, N-type nutrition, etc.) as well as the duration in the dark (beginning compared with end of the night, and mainly the light-to-dark transition time) are at the origin of the variability observed.

The unique properties of Graphene Related Materials (GRM) and CNT opened the door for brand new biochemical applications and industrial perspectives. The availability of materials or dispersions of consistent quality has increased. However their commercialization process is still at a relatively early stage and the determinant question of their safety is still pending.

Radiolabeling of CNTs/GRMs with a long life radioactive nucleus, such as carbon-14, offers a unique tool to assess their biodistribution over long periods in animals and plants. Our laboratory has recently developed two straightforward and efficient ¹⁴C-radiolabeling techniques. Using a catalytic chemical vapor deposition (CCVD) method, utilizing ¹⁴C-labeled benzene as carbon source,² CNTs/GRMs were successfully synthesized with high specific activities.

Toxicological studies have then been investigated showing the ability of MWCNTs to translocate in different organs and to cross the air-blood barrier. Further investigation on GRM showed biological persistence but without any translocations. Over 12 months, MWCNTs/GRM increasingly accumulate in these organs, indicating a bio-persistence of these nanoparticles. Such preliminary results may raise safety concerns for humans in working places.

1. D. Georgin, B. Czarny, M. Botquin, M. Mayne-L’Hermite, M. Pinault, B. Bouchet-Fabre, M. Carrière, J.-L. Poncy, Q. Chau, R. Maximilien, V. Dive, F. Taran J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 14658–14659.
2. (a) B. Czarny, D. Georgin, F. Berthon, G. Plastow, M. Pinault, G. Patriarche, A. Thuleau, M. Mayne-L’Hermite, F. Taran, V. Dive ACS Nano, 2014, 8, 5715–5724; (b) C. Larue, M. Pinault, B. Czarny, D. Georgin, D. Jaillard, N. Bendiab, M. Mayne-L’Hermite, F. Taran, V. Dive , M. Carrière Journal of Hazardous Materials, 2012, 227–228, 155–163.

Dans la nuit du 15 au 16 avril 2019, un incendie a détruit une partie de la toiture de Notre-Dame de Paris. La flèche, couverte de feuilles de plomb a été la première à être gagnée par les flammes. Puis l’incendie a gagné la toiture, couverte également de plomb. Les températures atteintes ont conduit à la vaporisation d’une partie de ce plomb. Les poussières de ces fumées sont retombées au sol dans et autour de la Cathédrale. Dans le cadre de nos travaux sur l’histoire des contaminations du bassin de la Seine, nous avons caractérisé différentes signatures de plomb en utilisant les rapports entre les concentrations en isotopes stables du plomb. Une grande quantité de plomb datant de la fin du XIX^ème siècle est stockée dans l’infrastructure parisienne. Nous avons aussi pu évaluer la contribution du plomb des additifs aux essences (interdits en 2000). Au long des siècles, les différentes sources de plomb se sont amalgamées, formant ce que nous avons appelé le "plomb urbain" dont nous retrouvons partout la signature. Jusqu’ici, la signature des plombs de la toiture de Notre-Dame n’a pas été identifiée.

De grandes quantités d’eau ont été utilisées pour éteindre l’incendie et, dans les mois suivants, pour évacuer les poussières contaminées en plomb dans les abords de la cathédrale. Les eaux usées domestiques et pluviales de Paris étant gérées en système unitaire, toutes ces eaux ont été acheminées vers la station de traitement Seine-Aval (Achères). Dans les jours et semaines suivant l’incendie, nous avons collecté différents échantillons environnementaux : des particules atmosphériques collectée sur filtre, des retombées totales, des sédiments issus des eaux usées. Nous mettrons les résultats des mesures des rapports des isotopes stables du plomb en perspectives avec les données déjà acquises pour le bassin de la Seine (sédiments de la Seine) et avec les données historiques pointant les sources potentielles de plomb pour les différentes époques de la construction de la toiture de Notre-Dame.

Pesticides in the environment is a worldwide issue of increasing concern. Determining pesticide fate in the field remains a challenge that may preclude adapted risk assessment and water resource management. Application of compound-specific isotope analysis (CSIA) to evaluate degradation of diffuse and low-concentration pesticides in surface hydrological contexts is mostly recent. The presentation focuses on the potential of pesticide CSIA for applications in agricultural catchments. It highlights current challenges associated with multi-isotopic analysis of pesticides in soil and water, and recent advances from mechanistic laboratory studies. Recent development and application of CSIA to track dissipation of widely used (and often chiral) anilide and alanine pesticides on the catchment scale are presented. For example, the applicability of CSIA to track pesticide degradation and export at the agricultural catchment scale has been recently demonstrated in stream discharge under dynamic hydrological contexts. Based on maximum shifts in carbon stable isotope signatures of 4.6 ± 0.5 ‰ for S-metolachlor, a widely used herbicide, we estimate maximum degradation to have reached 96 ± 3% two months after the first application. Maximum shifts in nitrogen isotope signatures were small and inverse, reaching -1.3 ± 0.6‰. This suggests secondary isotope effects during degradation. In combination with a mass balance approach including S-metolachlor main degradation products, total catchment non-destructive dissipation was estimated to have reached 8 ± 7% of the applied product. Pesticide CSIA can also be combined with physical modelling to identify drivers regulating pesticide fate in relation to climatic conditions. Taken together, pesticide CSIA bears great potential for source apportionment, identification of transformation reactions on a mechanistic level, and quantification of persistence/degradation on the catchment scale.

L’expansion récente de l’industrie du gaz non conventionnel en Amérique du Nord et son émergence en Europe a généré de fortes préoccupations du public quant à la protection des ressources en eau de surface et souterraines. Des contaminations possibles sont liées à des fuites de gaz, de fluides salins de formation et aux composés chimiques utilisés pour la fracturation hydraulique. La détermination de du font géochimique environnemental est à la fois un défi scientifique et un prérequis indispensable pour toute évaluation précise et quantitative de l’impact environnemental de l’exploitation de hydrocarbures non-conventionnels. Cette tâche est complexe car ce « fond environnemental » peut comprendre des contaminations naturelles et des pollutions antérieures. L’enjeu est notamment d’identifier les fuites potentielles de gaz et de fluides liés à la fracturation hydraulique et de les distinguer des émissions naturelles de gaz et des saumures. Dans le projet ANR-NSERC franco-canadien G-Baseline et le projet H2020 en cours SECURe, nous avons développé et appliqué un cortège de traceurs isotopiques, notamment les signatures des gaz (alcanes, CO₂,…) et des éléments chimiques dissous (C, S, O, N, Sr, B, Li, U, Cu, Zn,…) à des sites d'étude très divers de par le monde (Canada, Argentine, Danemark, France…), dans le but de fournir aux régulateurs et aux industriels des outils d’évaluation et de décision plus fiables .

Cette recherche a été cofinancée par l'Agence française de la recherche (subvention ANR-14-CE05-0050) et le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (subvention CRSNG n° 463605) ainsi que par le programme européen H2020 (subvention 764531 - SECURe).

Due to the prevalence of oxygen, much effort is being put into the development of analytical techniques allowing the study of oxygen environments, in view of elucidating key questions about the structure and reactivity of different systems. In particular, Nuclear magnetic Resonance (NMR) spectroscopy has progressively emerged as a technique capable of providing deep insight into the local structure around this element. However, NMR is highly challenging for oxygen, mainly because the NMR-active isotope, oxygen-17, has a very low natural abundance (0.04%), and hence a very poor sensitivity. Because of this, most ¹⁷O NMR studies require enriching the molecules and materials of interest in ¹⁷O. Unfortunately, the labeling schemes reported in the literature for ¹⁷O-isotopic enrichment generally suffer from several drawbacks, which makes them unattractive in terms of cost, time, and/or synthetic contraints.

Recently, we demonstrated that mechanochemistry techniques like ball milling can be used to enrich organic and inorganic precursors in ¹⁷O, by employing microliter-quantities of H₂¹⁷O during the grinding [1]. Reactions were performed under ambient conditions, in less than two hours, and for a total cost per synthesis ~10 euros, surpassing by far previous procedures.
Here, our new developments in this field will be presented, showing how we have expanded the range of compounds which can be labeled by this technique, and how this allows gaining new insight into their structure using ¹⁷O-NMR.[2]

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1- T.-X. Métro, D. Laurencin et al, Angew. Chem. 2017, 56, 6803.
2- Unpublished results.

Les matières premières aromatiques, dont les huiles essentielles, obtenues par hydrodistillation de la matière végétale, sont principalement utilisées en industrie agroalimentaire, en cosmétique et parfumerie, ainsi qu’en aromathérapie. Elles sont la cible de fraudes, notamment l’adultération avec d’autres produits naturels ou synthétiques moins coûteux. Le développement des méthodes analytiques et l’établissement de banque de données, sur des échantillons dont la traçabilité est connue, sont nécessaires, afin de déterminer si ces produits aromatiques sont bien authentiques, sans altération de leur pureté et de leur naturalité.

Les techniques classiques d’identification et de caractérisation ne permettent pas toujours de différencier une molécule naturelle issue de deux origines différentes, ou encore d’une molécule naturelle et de son équivalent de synthèse.

L’analyse isotopique est utilisée depuis de nombreuses années pour apporter une expertise de l’authentification de ces composés, en complémentarité de la mesure de l’activité du ¹⁴C garante de l’origine naturelle. Dans cette communication seront présentés les récents développements en analyse multi-isotopes (²H, ¹³C, ¹⁸O et ³⁴S), les résultats des investigations sur différentes huiles essentielles nouvellement investiguées en isotopie, et la mise en évidence de nouvelles fraudes et notamment celle liée à l’ajout de molécules de synthèse commerciales enrichies en ¹⁴C permettant de fabriquer des huiles essentielles conformes à cette approche analytique d’authentification.

The latest generation of instruments based on cavity ring-down spectroscopy (CRDS) permit concentration and isotopic composition measurements in a small instrument package and with high temporal resolution. Here we describe two novel developments in sample introduction that are aimed at expanding the application of CRDS instruments. We focus on the isotope analysis of carbon and oxygen in dissolved inorganic carbon (DIC) and in carbonate rocks. These are traditionally measured using discrete samples that must be transported to the lab and subjected to lengthy preparation steps. We present here two new analytical developments that reduce the time of preparation, increase spatial and temporal resolution, and permit such analyses to move from the lab to the field.

The first development is a novel automated method that enables the continuous online concentration and isotopic analysis of DIC. Our method uses a simple and commonly available gas–liquid separation apparatus for the continuous acidification and isolation of CO₂ from a sample or effluent stream. We employed CRDS instruments from two major manufacturers (Thermo Scientific and Picarro) to monitor the concentration and isotope composition of evolved CO₂. We demonstrate high fidelity and reproducibility of < 0.3‰ for δ¹³C and δ¹⁸O. We will present two field demonstrations, one in a tropical aquarium and one in a river monitoring station, that reveal carbon cycling in unprecedented temporal resolution.

The second development aims to enable C and O isotope analyses of carbonates directly in the field. CO₂ is produced by laser diode heating which induces the calcination reaction. We first tested this CO₂ production method in a specially constructed laser ablation cell subjected to primary vacum, then collected and analyzed the CO₂ produced. Data obtained using this method shows good agreement with data from classic measurements and bodes well for the future possibility of in-situ isotope measurements of solid carbonates in the field.

By storing CO₂, heat and nutrients, the deep ocean exerts a strong control on the climate system. The renewal of bottom waters is largely controlled by the vertical eddy mixing, a poorly constrained process. ²²⁷Ac (half-life = 21.7y) is produce by the decay of ²³¹Pa, a particles reactive element stored in the deep sea sediments. 227Ac is diffuse from the sediments into the in bottom water and then allows the vertical mixing to in the bottom water on decade scale. We aim to measure dissolved ²²⁷Ac in seawater. Concentrations are estimated from 0.5 ag/kg to 20ag/kg (Nozaki et al. 1987), and need between 30L and several  hundred liters for each analyse by alpha or gamma-ray spectrometry. In this study, we propose to analyse ²²⁷Ac by isotopic dilution with a spike of ²²⁵Ac “milked” from a solution of ²²⁹Th, greatly increasing the accuracy of the measurement and the protocol yield compared to previous studies by alpha or gamma spectrometry. We purify actinium by a succession of chromatography on anion exchange resin and then measured by mass spectrometry. This protocol was first apply to extract actinium from an uraninite (HU1) and produce a standard that we have calibrated with a known solution of ²²⁹Th. We have the determined the quantification limit of the MC-ICP-MS and the reproducibility of the measurement. Our method makes it possible to consider to analyse samples of only 10 to 30L of seawater, allowing dissolved actinium to be analysed more regularly, with a better precision than analyse made today by gamma-ray spectrometry. The protocol will be applied to seawater samples collected during the HYDROSED campaign in the China Sea. In particular, it will allow studying the remobilization of neodymium in ocean-continental interface areas.