Introduction : Les dystrophies rétiniennes sévères et précoces (DRSP) sont la première cause de cécité incurable de l’enfant. Elles sont homogènes dans leur présentation clinique initiale, mais variables dans leur évolution et peuvent s’accompagner d’atteintes extra-oculaires touchant principalement le système nerveux, le rein et le squelette. Ces affections sont très majoritairement récessives autosomiques, et de très nombreux gènes sont reconnus. Les formes isolées relèvent de mutations affectant diverses fonctions rétiniennes, incluant le trafic le long du cil connecteur des photorécepteurs tandis que les atteintes syndromiques relèvent toujours de dysfonctions ciliaires pluri-systémiques. Bien que très nombreux, les gènes reconnus à ce jour ne couvrent que 70% des cas de la maladie. L’objectif des travaux présentés ici étaient l’identification du ou des gènes responsables d’une forme syndromique non encore rapportée d’ACL avec surdité de perception précoce.

Familles et méthodes : Trois cas sporadiques et un cas familial de surdicécité avec transmission mère-fils et surdité tardive isolée chez la grand-mère maternelle, ont été inclus. L’étude présentée a consisté en un séquençage de l’exome en trio à la recherche de variants dominants ou récessifs ultra-rares potentiellement délétères, une analyse haut débit ciblée de la séquence du gène le plus candidat et d’études fonctionnelles dans un modèle cellulaire COS7 et des fibroblastes des patients.

Résultats : Deux mutations monoalléiques faux-sens touchant un acide aminé unique ont été identifiées dans un gène non encore lié à une maladie et sans rapport avec les fonctions ciliaires. Dans le cas familial, la mutation présente dans l’ADN de la mère et de son fils, était également retrouvée en mosaique chez la grand-mère maternelle sourde (29%). De même, dans l’un des trois cas sporadiques, la mutation du cas index était retrouvée en mosaïque dans l’ADN maternel (13%). Les examens audio-ophtalmologiques étaient sans particularité chez cette femme. Dans les deux derniers cas sporadiques, la mutation n’a pas été retrouvée dans l’ADN parental, suggérant une survenue de novo. La surexpression des protéines mutantes et sauvage dans un modèle cellulaire, de même que l’analyse des fibroblastes de patients, ont démontré l’effet délétère des mutations sur la fonction du gène et confirmé l’absence d’anomalie de la ciliogenèse et du trafficking intra-flagellaire.

Conclusion : Nous rapportons ici une nouvelle forme d’ACL syndromique et l’identification du gène responsable. Cette maladie contraste avec les autres formes syndromiques par sa présentation clinique purement neurosensorielle, un mode de transmission dominant et l’implication d’une fonction sans rapport avec le métabolisme ciliaire. Cette étude démontre que malgré trois décennies de recherches intenses sur l’ACL, cette maladie est loin d’avoir livré tous ses secrets.

Les maladies génétiques sont souvent associées à des variations dans des séquences codantes. Pourtant, de nombreuses pathologies sont dues à une expression anormale d’un gène, suite à l’altération d’un de ses éléments de régulation. Ainsi, il a été mis en lumière l’implication d’anomalies de régions régulatrices à distance d’un gène dans plusieurs maladies génétiques. Il a été proposé le terme de ‘cis-ruption disorder ’ pour décrire les pathologies dont l’origine provient d’un dysfonctionnement d’un élément cis-régulateur. Ces nouvelles données dévoilent l’importance de la compréhension des éléments de régulation du génome pour prédire leurs potentiels rôles pathogéniques.

Notre laboratoire travaille depuis 20 ans sur les gènes responsables de la  polykystose autosomique dominante (PKAD). La PKAD est la plus fréquente des maladies génétiques rénales avec une incidence de 1/400 à 1/2000. Dans 75 à 80% des cas, la mutation est située sur le gène PKD1 (Polycystic Kidney Disease 1) et dans 10 à 15% des cas sur PKD2. Malgré l’identification de plus de 1400 mutations (ADPKD Mutation Database, http://pkdb.mayo.edu/), les mutations de 5 à 10% de patients n’ont pas été décrites. Il existe également une variabilité phénotypique importante de la pathologie entre les patients, même au sein de famille.  

C’est pourquoi dernièrement, notre équipe s’est intéressée à l’impact de régulation à distance sur le gène PKD2. L’organisation spatiale d’une région d’environ 670 kb recouvrant le gène PKD2, a été analysée dans des cultures primaires de cellules épithéliales rénales par la technique de Copie Conforme de 3C (5C). Les interactions entre les régions de ce locus et le promoteur PKD2 ont été étudiées par séquençage nouvelle génération sur Ion PGM™.

Cette étude a permis d’identifier plusieurs régions interagissant fortement avec le promoteur PKD2. Grace à des tests d’activité d’expression, nous avons pu démontrer le rôle enhancer de trois de ces régions et décrivons ainsi pour la première fois l’implication de régulation à distance et l’importance de l’organisation chromatinienne d’un gène lié aux PKAD.

Des variations dans ces éléments de régulation, pourraient élucider des cas de patients chez qui la mutation causale n’a pas été identifiée et expliquer des phénotypes atypiques. 

La variation du nombre de copies (en anglais, Copy Number Variation, CNV) est un des contributeurs principaux à la pathogenèse des syndromes génétiques rares, mais aussi des maladies multifactorielles fréquentes. Sur le bras court du chromosome 16, les CNVs de la région distale BP2-BP3 de longueur 220 Kb conduisent à un effet miroir entre sous-poids et obésité sévère, et micro/macrocéphalies, et ils sont aussi associés avec l'autisme et la schizophrénie. Des phénotypes similaires ont été précédemment observés sur la même bande chromosomique (16p11.2) pour des délétions et duplications proximales dans la région BP4-BP5 (600 Kb). Les régions BP2-BP3 et BP4-BP5 présentent des contacts chromatiniens réciproques, confirmés avec succès par différentes techniques (4C-seq, FISH, co-régulation dans l’expression des gènes, et des données Hi-C), indiquant une relation fonctionnelle entre les gènes de ces régions qui pourraient être pertinentes pour le pathomécanisme. La modélisation de la duplication de la région BP2-BP3 dans le poisson-zèbre a révélé que la surexpression du gène LAT (en anglais, Linker for Activation of T-cells) diminue la prolifération des cellules dans le cerveau et des neurones post-mitotiques dans le cerveau antérieur ainsi que le nombre des axones entre les tecta optiques, au début du développement embryonaire. Dans les stades suivants du développement, nous observons une microcéphalie chez les larves de poissons zèbre au stade 5 jours. La modélisation de la délétion par suppression de l'orthologue de LAT dans le poisson zèbre par CRISPR/Cas9 induit une augmentation de cette prolifération et la macrocéphalie. Ces phénotypes ne sont pas uniques au poisson zèbre; les souris knock-out pour le gène Lat montrent aussi des changements volumétriques cérébraux. Conformément à l'hypothèse selon laquelle le dosage de LAT est important pour la pathologie du CNV, nous avons observé des effets similaires sur les progéniteurs neuronaux avec la surexpression des gènes CD247 et ZAP70, qui sont deux membres du même signalosome dont LAT fait partie. KCTD13, MVP et MAPK3 sont situés dans la région BP4-BP5 et, sont, respectivement, un gène majeur et deux gènes modificateurs des anomalies de la taille de la tête liées à cette région. Nous avons ensuite réalisé des expériences d’interaction génique et nous avons observés que la surexpression combinée de ces trois gènes et LAT augmente, de manière additive, la sévérité de la microcéphalie ; cette sévérité accrue a pu être observée chez des individus avec un grand réarrangement de 1,7 Mb de la région BP1-BP5, incluant les deux CNVs (BP2-BP3 et BP4-BP5). L’ensemble de ces données soutiennent notre hypothèse d'une interaction physique et fonctionnelle entre les gènes majeurs de ces deux CNVs et indiquent que LAT, en plus de sa fonction reconnue dans le développement des lymphocytes T, est le gène majeur des phénotypes neuro-développementaux associés aux délétions et duplications de la région 16p11.2 BP2-BP3.

Le très large spectre tumoral du syndrome de Li Fraumeni (LFS), prédisposition au cancer causée par une mutation du gène TP53, rend complexe la prise en charge des porteurs. Le protocole multicentrique national LIFSCREEN avait pour objectif principal de comparer les performances diagnostiques de 2 schémas pour le dépistage de cancers dans cette population.

Méthodes : Etait éligible tout porteur de mutation délétère de TP53, > 5 et < 75 ans, avec ou sans antécédent de cancer. Un tirage au sort déterminait le bras de surveillance standard (SS) (examen clinique, échographie abdominopelvienne, IRM cérébrale, NFS, IRM mammaire et échographie mammaire pour les femmes dès 20 ans) ou « IRM CE » (SS + IRM corps entier de diffusion). Les examens étaient répétés annuellement pendant au moins 3 ans (M0, M12, M24). A chaque étape, l’acceptabilité et le retentissement psychologique étaient évalués (auto-questionnaires, entretiens).

Résultats : 105 participants (pts) (moyenne d’âge 33 ans [5-66]) ont été randomisés. Jusqu’au 31/12/2016, 11pts ont réalisé 1 seule étape, 14pts 2, 35pts 3, 20pts 4, 18pts 5. Au total, 25pts ont présenté 36 évènements carcinologiques (13 prévalents): 31 nouveaux primitifs (6 cancers du sein (CS), 5 du poumon, 4 tumeurs du système nerveux central, 3 sarcomes, 3 leucémies aigues, 3 carcinomes basocellulaires, 1 voies urinaires, 1 corticosurrénalome, 1 carcinome rénal, 1 pancréas, 1 myélome, 1 colon bifocal, 1 choriocarcinome) et 5 récidives (3 CS, 1 sarcome, 1 basocellulaire). 20 primitifs ont été détectés dans le bras SS et 11 dans le bras IRM CE. 27 biopsies ont été réalisées dans le bras SS et 20 dans le bras IRM CE. La relecture centralisée de 141 IRM CE a montré 44 discordances. Il n’y avait pas de différence en survie globale entre les 2 bras (logrank p=0.90). Sur les 24 pts avec nouveau cancer, 8 sont décédés dans un délai médian de 13 mois (4 dans chaque bras). Seuls 10 sont sortis volontairement de l’étude. Le volet psychologique a noté un ajustement adapté des pts, sans différence notable entre les 2 bras.

Discussion : LIFSCREEN  est la seule étude randomisée dans le domaine, avec l’un des effectifs de patients LFS le plus important rapporté à ce jour. Elle montre que le suivi régulier est faisable et acceptable. Le spectre tumoral est inattendu (peu de sarcomes, nombreux cancers du poumon). L’IRM CE était  bien tolérée. Elle a généré  peu de biopsies inutiles. Bien que son usage n’apportait pas de bénéfice en survie globale et que son interprétation pouvait être difficile, l’IRM CE pourrait être ajoutée au schéma de surveillance des familles LFS, notamment pour la surveillance pulmonaire. Nos résultats suggèrent que le protocole lourd, préconisé par certaines équipes nord-américaines, doit être considéré avec précaution. En outre, malgré le dépistage, la survie à court terme après le diagnostic de cancer était mauvaise. Une optimisation des moyens de prévention et des traitements est nécessaire.

Le syndrome de Marfan (MFS) est une maladie génétique rare (1/5000 sujets), à transmission autosomique dominante, principalement dû à des mutations dans le gène codant pour la fibrilline 1 (FBN1), situé sur le chromosome 15. L’atteinte est plurisystémique touchant, entre autre, le système cardio-vasculaire (anévrisme de l’aorte thoracique ascendante avec risque de dissection aortique). Ce syndrome est caractérisé par une très grande variabilité clinique, inter- et intrafamiliale, concernant aussi bien l’âge d’apparition des symptômes que l’évolution, la gravité ou le nombre de systèmes atteints. A ce jour, aucun facteur modificateur ni aucune relation génotype/phénotype (en dehors de mutations faux-sens dans les exons 24 à 32 à l’origine des formes rares de MFS néonatal) ne peuvent expliquer de cette variabilité.

De plus, des résultats antérieurs ont montré, qu’en plus de cette variabilité phénotypique, il existe une variabilité d’expression du gène FBN1  d’un facteur 4 observée aussi bien chez des contrôles que chez  des sujets MFS porteurs d’une mutation tronquante dans le gène FBN1.

Pour identifier les facteurs génétiques modificateurs sous-jacents de la variabilité phénotypique, plusieurs études pangénomiques ont été réalisées chez 1070 patients MFS porteurs d’une mutation dans le gène FBN1. A partir de cette cohorte, une analyse eQTL (expression Quantitative Trait Loci) chez 80 sujets MFS porteurs d’une mutation tronquante dans le gène FBN1 a été réalisée. Cette analyse a permis d’identifier un locus statistiquement associé à l'expression de FBN1 (p-valeur = 6.10^-8), situé sur le chromosome 11. Une étude portant sur les gènes situés au plus proche de ce locus n’a pas permis de mettre en évidence de corrélation entre l’expression de ces gènes et la régulation de l’expression du gène FBN1.

En revanche, le croisement de ces résultats avec ceux d’autres études génomiques sur la variabilité a permis d’élargir la région d’étude de ce locus et de mettre en évidence un cluster de métalloprotéinases (MMP), situé à proximité du trans-eQTL. Le rôle des MMPs dans l’équilibre de la matrice extracellulaire mais également l’implication de certains MMPs dans la physiopathologie des anévrismes de l’aorte thoracique font de ces gènes de bons candidats comme facteurs génétiques modificateurs. Des études quantitatives de corrélation (dosages sériques, quantification allèlique) ont permis de mettre en évidence des mécanismes de régulations impliquant certaines MMPs. Ces résultats et la compréhension de mécanismes sous-jacent pourraient nous permettre d’identifier les facteurs à l’origine de la variabilité phénotypique.

Cerebellar atrophy and hypoplasia are two frequently observed neurological features in various pathological conditions such as Congenital Disorders of Glycosylation (CDG) and Pontocerebellar hypoplasia (PCH). The former is mainly associated with defects in protein N-glycosylation pathway, suggesting the importance of this modification in cerebellar development. Among various CDG cases, patients with SRD5A3 mutations are frequently affected with a severe atrophic and/or hypoplastic cerebellar phenotype. PCH is characterized by the incomplete development of brain stem and cerebellum with the implication of various pathways, mainly involved in RNA maturation.

Recent advances in induced pluripotent stem cells (iPSCs) technology, has opened up new avenues in disease modeling, allowing access to an unlimited supply of disease relevant cell types. Particularly, iPSCs become an attractive source for neurological disorders, as it offers the possibility to generate otherwise inaccessible human brain cells. 

To better understand the role of protein N-glycosylation in cerebellar development, we previously developed a cerebellum-specific Srd5a3 conditional KO (cKO) mouse. Consistent with the human phenotype, our mouse model showed cerebellar hypoplasia with abnormal N-glycosylation patterns and impaired cerebellar functioning. Using a glycoprotemic approach, we could identify the immunoglobulin superfamily cell adhesion molecules (IgSF-CAMs) as being specifically sensitive to the defect. Then, using in vitro live cell imaging analysis we could identify a clear defect in neural extension resulting from a significant decrease in IgSF-CAM-dependent cell adhesion. In order to extend our conclusions to a human cell model, we undertook an iPSC-based approach, where we generated SRD5A3 KO hiPSC lines using genome editing. We further differentiate them into neural progenitor cells (NPCs) and mature neurons. The characterization of these NPCs  allowed us to recapitulate the mouse neuron-specific N-glycosylation defect.

We are also developing an iPSC-based modeling strategy in order to identify new potential molecular defects related to cerebellar atrophy and hypoplasia in the context of PCH disorders. We previously identified a consanguineous family with a unique type of PCH suggesting a new underlying molecular defect. For this project, we are using PCH patient-derived iPSCs lines to assess the proliferation and differentiation capacity of the induced neurons. We will study neurite dynamics and cell survival rate during the course of differentiation.

In conclusion, our attempts in modeling neurodevelopmental cerebellar defects with human iPSCs already allowed us to validate some previous biochemical mouse findings, in the context of CDG. It provides a promising strategy to extend some previous observations to human cells and to unravel new molecular mechanisms implicated in hypoplasia and childhood-onset atrophy of the cerebellum.

Les erreurs innées du métabolisme (EIM) constituent un groupe de maladies génétiques dont l’origine est un déficit d’une voie biochimique. Elles se caractérisent par une grande hétérogénéité clinique. Les explorations biochimiques (dosages des métabolites, activités enzymatiques…) demeurent la technique de référence pour le diagnostic de ces maladies. L’analyse moléculaire n’intervient le plus souvent que dans un second temps en fonction de l’orientation clinico-biochimique pour l’identification des mutations causales, indispensable à la confirmation diagnostique et le conseil génétique. Néanmoins, le rendement diagnostique de ces techniques standards reste faible (0.8 à 14% selon la présentation clinique). Dans cette étude, nous évaluons l’apport du séquençage d’exome dans le diagnostic des EIM dans une série de 550 patients après un premier bilan étiologique non contributif. Ces patients étaient adressés pour avis diagnostique devant une présentation aspécifique d’encéphalopathie, de déficience intellectuelle, d’atteinte neurosensorielle et/ou de malformations congénitales. Un diagnostic moléculaire a été possible chez 177 patients. 11% des diagnostics étaient des EIM, identifiées chez 20 cas index, dont un nouveau phénotype lié au gène SLC13A5. Les patients étaient de tous âges, dont deux fœtus atteints de Niemann Pick C et de déficit en ALDH18A1 respectivement. On rapporte 2 cas de CLN1 et deux autres de CLN3 dont un adulte suivi pour rétinite pigmentaire sans épilepsie. Deux diagnostics ont permis la mise en place de thérapeutiques ciblées : les déficits en GLUT1 et en Sepiapterine réductase. Deux diagnostics précoces de mannosidose ont été possibles devant une surdité modérée et des difficultés d’apprentissage sans signe évident de surcharge. D’autres déficits du métabolisme des molécules complexes ont été identifiés, dont un déficit en GM3 synthétase, une gangliosidose à GM2, des déficits de synthèse du GPI-anchor et de la déglycosylation des protéines. Enfin, on note deux cas de déficits mitochondriaux (en co-enzyme Q10 et de la fission mitochondriale). Ces différents diagnostics n’avaient pas été évoqués spécifiquement lors du bilan initial principalement à cause de l’atypie ou de l’aspécificité des symptômes ou à une présentation plus modérée. A noter que parmi ces 20 patients, 11 se présentaient avec une déficience intellectuelle et une épilepsie de sévérité variable, phénotype fréquent chez les patients porteurs d’EIM dans cette série. De plus, dans au moins 9 maladies, aucun biomarqueur spécifique sanguin ou urinaire n’était disponible rendant impossible le diagnostic biochimique par simple screening métabolique. Au total, cette étude souligne l’intérêt de l’exome dans le diagnostic des EIM avec un rendement de 3.6% et ce malgré l’absence d’élément clinico-biologique évocateur d’EIM et des phénotypes aspécifiques. En effet,  le rendement rapporté de la stratégie standard n’était que de 0.8% dans ces mêmes indications

L’épilepsie est un ensemble de pathologies neurologiques qui touche 0,7% de la population mondiale. Les encéphalopathies épileptiques constituent un groupe hétérogène de pathologies sévères, débutant généralement dans la petite enfance et dont l’évolution est souvent défavorable. Dans ce contexte, un diagnostic génétique précoce peut être important pour la prise en charge, le pronostic et le conseil génétique.

Méthode : Une collaboration entre les équipes de Lyon et de Paris (La Pitié-Salpêtrière), a permis la mise au point d’un panel de 90 gènes dont les mutations sont responsables d’épilepsies monogéniques. L’analyse a été réalisée avec la technologie  de capture SeqCapEZ de Roche®. Le séquençage a été réalisé sur une flow-cell « mid output » (Illumina®) sur un Miseq ou un Nextseq (Illumina®) en multiplexant les échantillons par 24. La profondeur moyenne de lecture était de 300X et plus de 99% des bases étaient couvertes à plus de 30X. Patients : L’ADN de 700 patients évalués au préalable par des neuropédiatres et des généticiens a été analysé.

Résultats : Des variants pathogènes ont été identifiés chez 196/700 patients (28% des cas), il s’agissait de mutations autosomiques dominantes, principalement de novo, dans 142 cas (72%), de mutations récessives dans 18 cas (10%) et de mutations sur le chromosome X dans 36 cas (18%).

Les gènes les plus fréquemment mutés étaient SCN1A (n=31), KCNQ2 (n=22), SCN2A (n=13), SCN8A (n=11), KCNT1 (n=9), CDKL5 (n=9), ATP1A3 (n=8), PCDH19 (n=7), SYNGAP1 (n=6), GRIN2A (n=6), STXBP1 (n=6) et WWOX (n=6). Le taux de diagnostic était beaucoup plus élevé en cas de début néonatal (45% de diagnostic en cas de début avant 1 mois) ou de début précoce (40% de diagnostic en cas de début entre 1 et 3 mois) ou chez les patients présentant un syndrome de Dravet ou une épilepsie sensible à la fièvre (47% de diagnostic). Au contraire, le taux de diagnostics était faible chez les patients ayant un syndrome de West (14% de diagnostic) ou une épilepsie débutant après 2 ans (14% de diagnostic).

Par ailleurs, le Séquençage à haut débit, dans nos conditions expérimentales qui assuraient une bonne couverture des régions d’intérêt, a permis la mise en évidence de délétions ou duplications d’exons dans 8 cas et de variants pathogènes en mosaïque chez 7 patients, dont certains présentaient un phénotype atténué.

Conclusion : L’analyse des gènes de ce panel permet d’augmenter le taux diagnostique des épilepsies monogéniques (28% de diagnostic), notamment lorsque les crises débutent au cours des premiers mois. L’identification de la mutation responsable de l’épilepsie permet d’améliorer le conseil génétique et, dans certains cas, la prise en charge thérapeutique. L’identification d’une mutation homozygote dans le gène PNPO chez une patiente ayant une épilepsie néonatale pharmacorésistante a permis d’adapter le traitement (Phosphate de Pyridoxal), ce qui a entrainé un contrôle satisfaisant de l’épilepsie et une reprise du développement psychomoteur.

Les données cumulées issues de l’analyse de nos panels ciblés de gènes de déficience intellectuelle (DI)(275, 450 puis 520 gènes) sur les 1028 diagnostics rendus à Strasbourg permettent de dresser une cartographie des causes moléculaires de DI sans orientation clinique évidente et d’envisager les prochaines étapes pour améliorer la qualité du diagnostic et de la prise en charge de ces familles en France. Le diagnostic moléculaire a été établi avec certitude dans 24% des cas de notre cohorte: 246 variations de classe 4 et 5 ont été rendues par notre laboratoire. Des mutations de classe 3 ont également été identifiées dans 9% des cas, 8 d’entre elles sont en cours de reclassification car fortement suspects de pathogénicité. Ce taux de diagnostic est significativement plus important chez les filles (31%), en cas de DI avec troubles du sommeil (30%) ou en cas de DI avec un retard de croissance postnatale (31%). Il est moins important pour les garçons (21%) et les DI légères (16%). Le taux ne semble pas être modifié par les éléments suivants : épilepsie, micro ou macrocéphalie, retard de langage, TSA, troubles de l’attention,  hypotonie, RCIU, ou IRM normal ou anormale.

Le Top 10 des gènes les plus fréquemment mutés dans notre cohorte regroupe TCF4, GRIN2B, SHANK3, KMT2A, DDX3X, KAT6B, ANKRD11, ARID1B, DYRK1A, MECP2. De nouveaux gènes ont rejoint le groupe des gènes de DI confirmés  (BPRF1, MYT1L, POGZ, AUTS2) et d’autres sont en cours de caractérisation (AGO1). On observe une transmission AD dans 66 % des cas et liée à l’X dans 25 % des cas. Très peu de mutations dans des gènes à transmission AR ont été identifiés (ST3GAL5, TRAPCC9, MED23). Le taux de double diagnostic est également faible (1 seul cas avéré) ainsi que les découvertes incidentes (5 cas). Des variations dans des gènes à pénétrance incomplète commencent à émerger (ANKRD11, KANSL1, DYNC1H1, KAT6A, MBD5). Le taux de néomutation reste très élevé (70%). L’analyse par trio (en simplex ou en pool) semble donc particulièrement efficiente vu le débit attendu de l’analyse (performance d’identification du variant, vérification du trio, délai de rendu). Pour ces familles, un DPN est fréquemment réalisé malgré le faible risque de récurrence. Une approche universelle, non invasive, basée sur une capture de l’ADN plasmatique maternel est en cours de mise en place pour éviter ces ponctions fœtales sur faible risque.

Ces avancées permettent d’améliorer le diagnostic des patients atteints de DI sans orientation clinique : d’un taux initial de 15-20 % (ACPA + analyse ciblée de gènes), le taux cumulé atteint 40-45 % avec notre panel. Si l’analyse de l’exome en trio permet de gagner clairement encore 10-15 % supplémentaire, l’évaluation de l’approche génome entier semble constituer la prochaine étape pouvant permettre de faire un gain significatif dans le cadre de ce diagnostic de par sa capacité à identifier d’autres mécanismes chromosomiques inaccessibles à des techniques basées sur une capture préalable.

Introduction : Les déficiences intellectuelles (DI) et les troubles du spectre autistique (TSA) sont des pathologies génétiquement et cliniquement hétérogènes, souvent associées car 60% des patients avec TSA présente aussi une DI. Ces pathologies  représentent le premier motif de consultation au sein du service de Génétique Clinique de l’Hôpital Necker (environ 400 patients par an). Les stratégies de WES/WGS ont montré leur efficacité pour l’identification des causes génétiques des DI et des TSA. Elles sont cependant couteuses, et entrainent la détection de variants incidents ou non sollicités. Pour ces raisons, la question de la pertinenece de leur application dans le contexte de diagnostic génétique hospitalier se pose.
Méthodes: Nous avons séquencé par NGS ciblé sur 253 gènes associés aux DI, 413 patients présentant une DI et/ou un TSA (379 singleton et 34 trios patient-parents, 246 garçons et 167 filles, âge moyen 12 ans).
Résultats: Pour tous les individus, la couverture des régions ciblées était > 99.8%. Nous avons identifié des variants pathogènes ou probablement pathogènes chez 22% des patients avec une majorité de variants survenus de novo (18%). Des variants de signification inconnue ont été mis en évidence chez 9% des patients. Le rendement diagnostique était plus élevé chez les patients avec DI syndromique (30%) et atteints d’épilepsie (32%) ; il était plus faible pour les patients issus de couples consanguins (9%). Cette approche a permis l’identification de délétions exoniques et de variants présents en taux faible de mosaïque.
Conclusions: Avec un rendement diagnostic de 22% dans une cohorte de 413 patient étudiés sur la période 2015-2017, la stratégie de NGS ciblé optimise le screening moléculaire des DI et des TSA. Cette approche « ciblé » réduit les côuts et le nombre de résultats incertains ou fortuits par rapport au WES et est préferable chez les patients avec DI/TSA syndromique. Une stratégie par WES pourrait par contre être plus pertinente chez les patients atteints de DI/TSA non syndromiques.

La déficience intellectuelle (DI) touche 1 à 3% de la population générale. Les techniques de séquençage de nouvelle génération (NGS) ont considérablement amélioré son diagnostic, notamment avec la mise en œuvre de séquençage de panels de gènes ciblés (panels DI44, DI275, DI459) et de séquençage d’exome entier (WES). Au CHU de Rennes, nous avons choisi une approche intermédiaire : l’exome médical, qui consiste à séquencer les exons de 5500 gènes OMIM à l’aide d’un kit de capture (Focused Exome Agilent).

Nous rapportons ici les résultats issus de l’analyse de 140 familles sur la période 2015-2017. Le modèle d’étude privilégié était le trio (enfant et parents).

Grâce à cette approche, nous avons mis en évidence 31% de variants de classes 5 et 4 (délétères et probablement délétères), 22% de classe 3 (VUS ou variants de signification clinique inconnue) et 47% de classes 2 et 1 (probables polymorphismes et polymorphismes reconnus).

Le panel ciblé DI44 n’aurait permis d’identifier que 14% de variants de classes 5 et 4, l’exome médical nous a donc permis de doubler le rendement diagnostique.

Les gènes impliqués sont très variés. Hormis les gènes du panel DI44, ADNP et POGZ sont ceux où le maximum de récurrence est observé même si celle-ci est faible.

L’implication définitive de certains variants peut requérir la mise en œuvre de tests fonctionnels :

1/ quand il s’agit de variants faux-sens dans un gène dont les variants reconnus délétères sont des variants non-sens ou frameshift (par exemple MEF2C),

2/ quand il s’agit de variants prédits délétères dans des gènes non formellement reconnus comme étant impliqués dans la DI à ce jour (par exemple KMT5B).

L’utilisation de l’exome médical dans le diagnostic étiologique de la DI constitue un bon compromis entre les panels ciblés et le WES : avec une nécessité de stockage informatique moins importante que le WES, une interprétation moins délicate (en évitant des variants dans des gènes totalement inconnus) et un prix plus abordable, il offre un rendement diagnostique très satisfaisant actuellement.

Plus de 1000 gènes sont connus dans la déficience intellectuelle (DI) et de nouveaux sont découverts très régulièrement. En raison de cette grande hétérogénéité génétique, les méthodes diagnostiques ciblées ont un intérêt souvent limité tandis que le Séquençage de Nouvelle Génération (NGS) a apporté un bénéfice considérable.

L’objectif de notre étude était d’évaluer le taux de diagnostic réalisé grâce au WES en trio dans la DI et de le comparer à celui obtenu avec un grand panel utilisé précédemment au laboratoire.

Patients et méthodes:

600 cas index, atteints de DI, ont été recrutés via la consultation de génétique. Tous avaient eu précédemment un bilan négatif incluant une ACPA et un X-fragile ainsi que pour certains des études ciblées. 263 patients, ont été initialement séquencés avec le panel TruSightOne (TS1) d’Illumina, commercialisé en 2015, comprenant les 4813 gènes impliqués en pathologie référencés dans OMIM. Pour les 373 patients suivants, nous avons réalisé un  WES avec le kit MedExome de Roche. 36 patients ont été analysés successivement avec les 2 techniques. Les analyses ont été réalisées en trio ou en quatuor dans 348 cas et en duo (lorsque l’ADN d’un parent n’était pas disponible) dans 25 cas.

Résultats:

Notre taux diagnostique (variants classe 4 et 5) est de 21% (55/263) avec le TS1 et de 43% (159/373) avec le WES. 55% des diagnostics réalisés en WES concernent des gènes absents du TS1 car décrits depuis moins de 3 ans dans la DI. Chez les patients négatifs en TS1 puis analysés en WES, notre taux diagnostique est de 30% (11/36). De plus, 21 variants probablement pathogènes ont été identifiés en WES dans des gènes non encore publiés et qui font actuellement l’objet de collaborations internationales.

Lorsque l’analyse des parents n’était pas possible, notre taux diagnostique tombe à 20% (5/25) contre 44% (154/348) lorsque nous avons pu faire les analyses en trio.

Les 159 diagnostics en WES ont été faits dans 117 gènes différents, dont seulement 26 sont mutés chez au moins 2 cas index, témoignant de la grande hétérogénéité génétique de la DI. Les gènes les plus fréquemment mutés dans notre série sont DDX3X, ADNP, KCNA2 et TCF20 (n=4 pour chaque gène). Tous les variants pathogènes ont été validés lors de réunions de concertation pluridisciplinaire clinico-biologique.

Conclusion:

Plus de la moitié de nos diagnostics en WES n’auraient pas été réalisés avec le TS1, qui comprenait pourtant en théorie tous les gènes connus de DI lors de sa commercialisation. Cela s’explique par la découverte très rapide de nouveaux gènes dans la DI durant ces 3 dernières années, ce qui rend vite obsolète un panel de gènes, même exhaustif au moment de son design. C’est également probablement la raison de notre taux diagnostique légèrement supérieur à ceux de la littérature (30-40%). Cela donne un intérêt particulier au WES dans la DI qui, sans besoin de nouveau design, reste toujours à jour et voit son taux diagnostique augmenter avec les avancées scientifiques.

La déficience intellectuelle (DI) a une prévalence estimée à 1% de la population. Aujourd’hui, plus de 1500 gènes ont été décrits comme responsables de DI. Dans un cadre diagnostic, certains gènes étant plus fréquemment mutés, la stratégie française prédominante consiste actuellement à analyser des panels composés de quelques dizaines à plusieurs centaines de gènes. Le séquençage de l’exome est une autre stratégie qui, au-delà de répondre à la problématique de l’hétérogénéité génétique, permet une analyse mise à jour régulièrement et un amincissement de la frontière avec la recherche. Au CHU de Nantes, nous avons fait le choix du séquençage de l’exome en solo dans le diagnostic de la DI, pour un nombre limité de patients, en sélectionnant les patients les plus sévères et les familles en demande d’un conseil génétique. Depuis fin 2015, nous avons analysé 164 cas index et avons établi un diagnostic certain ou probable pour 75 cas (45,7%). Certains patients ont pu être intégrés dans une cohorte décrivant un nouveau gène responsable de DI (OTUD6B, EBF3), et certains présentent des mutations de novo dans des gènes candidats (KMT2C, SPTBN1, TENM2, DSCAM, PPP3CB). Parallèlement à l’exome, le plan « France médecine génomique » promet un accès à court terme au séquençage du génome entier. Dans un cadre de recherche, nous avons obtenu un financement par la fondation maladies rares permettant le séquençage du génome en trio de 7 patients, recrutés après un exome trio négatif (projet HUGODIMS, recrutement du centre de référence CLAD-Ouest). Les premiers résultats ont montré (1) une translocation équilibrée de novo avec des points de cassure intergéniques dont la pathogénicité reste incertaine, (2) une inversion de novo de 2,1Mb impliquant le gène FOXP1, (3) deux patients avec des mutations de novo dans le gène H3F3A, dans un exon non couvert par exome, pour lequel une cohorte est en cours de publication et (4) une mutation de novo dans le gène TFE3, pour lequel une publication est également en cours. Au total, un diagnostic certain a pu être établi chez 4 patients. En conclusion, bien que l’exome apporte un rendement diagnostic déjà important, l’accès aux variants structuraux et la couverture plus homogène de la grande majorité des gènes de DI font certainement du séquençage du génome entier la future méthode de choix pour le diagnostic de la DI.

Intracranial aneurysms (IA) are acquired cerebrovascular abnormalities characterized by a localized dilation and wall thinning in intracranial arteries. The main IA complication is the rupture, resulting in subarachnoid haemorrhage and possibly leading to severe outcome. IA pathogenesis is still largely unknown, with no reliable risk marker available so far. Here we have identified one rare nonsense variant (1617A>T) in the last exon of the GAIA-1 gene, shared by the 4 tested affected members from a large pedigree with multiple IA carriers. We have showed a 50% reduction of GAIA-1 serum concentration in heterozygous 1617A>T careers compared to their non-carrier relatives, and found that this reduction results from the inability of the truncated protein (K460*-GAIA-1) produced by the transcripts carrying the 1617A>T variant to be secreted. By extending our genetic screen, we then identified other rare missense or frameshift variants in GAIA-1, carried by 5 out of 94 additional index cases with familial IA. We observed a significant enrichment (p=0.0004) in rare coding variants within this gene in our population of 95 index cases with familial IA, compared to a reference population of 63,339 NFE individuals. In total, among the 6 families, 11 out of 12 (92%) family members carrying IA also carry such variants in GAIA-1, versus only 14 out of 41 (34%) unaffected ones (p=0.0048). We also noticed a higher rate of individuals with a history of high blood pressure among affected versus healthy carriers of GAIA-1 variants, suggesting that GAIA-1 could trigger lesions in the cerebral arterial wall when challenged by risk factors such as hypertension. Altogether, our results indicate that rare coding variants in GAIA-1 are causally related to familial forms of IA.

Dans le cadre des enjeux éthiques et psychologiques liées aux données secondaires (DS) issues du séquençage à haut débit (SHD), nous présentons les résultats de deux études distinctes. La première nommée SEQUAPRE avait comme objectif d’étudier les préférences et représentations des parents d’enfants atteints d’anomalies du développement vis-à-vis du SHD. Après un temps d’information dédié à la notion de résultats incertains et fortuits, 513 questionnaires basés sur des scénarios hypothétiques dans le cadre de la méthode des choix discrets (DCE) ont été recueillis. Ils ont montré que les parents valorisent globalement positivement la communication des résultats incertains et secondaires, ce qui est concordant avec les résultats de la littérature médicale sur le sujet.

La seconde étude, nommée PADAP, a convié des parents et des patients à une réflexion ouverte sur l’opportunité technologique d’accéder à des DS actionnables identifiées par SHD. Après une matinée d’information médicale sur le SHD et la liste des gènes actionnables proposée par l’ACMG, les participants ont été répartis dans 5 focus groupes animés par des psychologues cliniciens. L’objectif était de recueillir leurs avis concernant l’accès aux DS par analyse qualitative des verbatim. Le groupe 1 de parents d’enfants sans diagnostic a révélé une forte quête d’informations médicales exhaustives incluant la révélation de DS. Les 4 autres groupes de sujets concernés par l’annonce d’une prédisposition ont été constitués par type de pathologies : groupe 2 en oncogénétique,  groupe 3 en cardiogénétique, groupe 4 pour des maladies métaboliques et groupe 5 pour des sujets porteurs hétérozygotes d’une pathologie rare autosomique récessive. Les préférences ont été beaucoup plus ambivalentes que dans le groupe 1. Les arguments contre la recherche des DS concernaient le caractère anxiogène des surveillances médicales régulières et du statut de porteur asymptomatique, ainsi qu’un vécu traumatique de diagnostic en oncogénétique et cardiogénétique notamment. La notion d’utilité médicale a fait débat au regard de l’impact psychologique de tels diagnostics, de même que l’annonce de DS aux mineurs. Néanmoins, ont fait consensus : le fait de laisser le choix aux patients ; l’importance de ne pas retreindre l’information aux seuls aspects médicaux ; la pertinence d’un délai de réflexion; la nécessité d’un accompagnement psychologique ; et la prise en compte du moment auquel survient l’annonce au cours de la vie. Il est aussi apparu important de préciser la notion de gène actionnable dont l’impact psychique diffère suivant qu’il s’agit de l’annonce d’un risque, d’une prédisposition, de l’accès à de la prévention ou à des traitements.

En conclusion, les attentes et les représentations des personnes diffèrent selon qu’on se trouve en amont d’une annonce diagnostique ou dans l’après-coup, mettant en avant le caractère singulier de chaque situation tant du point de vue médical que du vécu psycho affectif.

The Aristaless-related homeobox (ARX) transcription factor is involved in the development of GABAergic and cholinergic neurons in the forebrain. ARX mutations have been associated with a wide spectrum of neurodevelopmental disorders in humans, among which the most frequent, a 24bp duplication in the protein polyalanine tract 2 (c.428_451dup24), gives rise to intellectual disability, fine motor defects with or without epilepsy.

To understand the functional consequences of this mutation, we generated a partially humanized mouse model carrying the c.428_451dup24 duplication (Arx^dup24/0) that we characterized at the behavior, neurological and molecular level. Arx^dup24/0 males presented with hyperactivity, enhanced stereotypies and altered contextual fear memory. In addition Arx^dup24/0 males had fine motor defects with alteration of reaching and grasping abilities, reminiscent of the very specific upper limb distal motor apraxia associated with a pathognomonic hand-grip observed in ARXdup24 patients. Transcriptome analysis of Arx^dup24/0 forebrains at E15.5 showed a down-regulation of genes specifically expressed in interneurons associated with an up-regulation of genes normally silenced in interneurons, suggesting abnormal interneuron development. Accordingly, interneuron migration was altered in the cortex and striatum between E15.5 and P0 with consequences in adults, illustrated by the defect in the inhibitory/excitatory balance in Arx^dup24/0 basolateral amygdala. Altogether, we showed that the c.428_451dup24 mutation disrupts Arx function with a direct consequence on interneuron development, leading to hyperactivity and defects in precise motor movement control and associative memory. Interestingly, we highlighted striking similarities between the mouse phenotype and a cohort of 33 male patients with ARX c.428_451dup24, suggesting that this new mutant mouse line is a good model for understanding the pathophysiology of this mutation and evaluation of treatment.

Introduction : Les ataxies congénitales (AC) sont définies cliniquement par des symptômes cérébelleux précoces dès les premiers mois de vie. Il s’agit habituellement d’une pathologie non progressive mais il est parfois difficile de distinguer ces AC des ataxies très lentement progressives à début très précoce (APDP). Cette entité clinique, comportant fréquemment une déficience intellectuelle et parfois d’autres signes neurologiques, épilepsie, syndrome pyramidal, neuropathie, correspond à un groupe hétérogène également sur le plan physiopathologique et génétique. En dehors du syndrome de Joubert, qui est une forme particulière d’AC, plus de 30 gènes impliquant des voies physiopathologiques variées ont été identifiés et mais de nombreux patients restent sans diagnostic génétique.

Objectif, patients et méthodes : Afin d’identifier de nouveaux gènes candidats, nous avons réalisé une analyse d’exome en solo chez 20 patients atteints d’AC issus d’union consanguine, ayant bénéficié d’une IRM, d’une SNP array et d’explorations initiales ne conduisant pas à un diagnostic syndromique, sélectionnés parmi 200 patients de notre cohorte. Les variants ont été filtrés en fonction de leur fréquence dans les bases de données, leur pathogénicité et la nature du gène candidat, en privilégiant d’une part les variants homozygotes, et d’autre part, les  variants situés dans l’un des gènes de notre liste de gènes connus (dominants et récessifs) impliqués dans les AC et les APDP. La cohorte de réplication a été utilisée pour rechercher une récurrence de variants pathogènes dans les  gènes nécessitant validation (nouveau phénotype, nouveau gène).

Résultats : Nous avons identifié des variants causals ou très probablement causals chez 15/20 des patients (75%) : chez 5 patients, il s’agit de variants pathogènes dans 4 gènes connus d’AC (3) et d’APDP (1); chez 8 patients, de variants pathogènes dans 5 gènes impliqués dans d’autres phénotypes neurologiques, dont 3 gènes responsables d’un tableau d’encéphalopathie épileptique précoce (STXBP1, CACNA2D2, BRAT1); chez 2 patients, de variants dans 2 nouveaux gènes candidats. Chez 3/15 patients, malgré la consanguinité, une mutation dominante de novo a été identifiée (gènes ITPR1, STXBP1). La cohorte de réplication a permis d’observer une récurrence pour 4 des 5 gènes nécessitant validation.

Conclusion : cette étude a permis l’identification du gène responsable de l’AC chez 75% de nos patients. Elle confirme la part non négligeable des mutations de novo dans les AC comme dans d’autres pathologies neurodéveloppementales, même en cas de consanguinité. Enfin, elle illustre l’importante hétérogénéité génétique des AC et permet d’établir un lien physiopathologique certain entre celles-ci et certaines formes d’encéphalopathies épileptiques.

La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie complexe avec une composante génétique importante. Des variants rares de TREM2, SORL1 et ABCA7 ont été récemment associés au risque de MA. Néanmoins, les analyses étaient restreintes en termes de variants, de catégories d’âge de début, ou de tailles d’échantillons.

Afin d’évaluer l’effet des variants rares de ces gènes sur le risque de MA, nous avons généré et analysé les données d’exomes (n=2106) et de génomes (n=955) d’ADES-FR, une étude collaborative comprenant les effectifs parmi les plus importants de cas (1779) – contrôles (1273) dans la MA. Les cas sont répartis selon l’âge de début précoce ( < 66 ans, n=852) et tardif (n=907). Nous avons réalisé une détection multi-échantillons des variants et des contrôles qualité extensifs, suivis d’une analyse d’association au niveau du gène par tests de charge (burden test) et de variance (SKAT), focalisée sur les gènes TREM2, SORL1 et ABCA7, et 3 gènes dont une association avec la MA a récemment été décrite mais reste controversée : PLD3, AKAP9 et UNC5C.

L’aggrégation des variants rares (MAF < 1%) disruptifs (non-sens, sites canoniques d’épissage, ou décalant le cadre de lecture) et faux sens prédits délétères par les 3 outils utilisés (strictement délétères, SD), a permis d’identifier une association significative à l’échelle de l’exome (p < 2,5e-6) entre le risque de MA précoce et TREM2 (OR (odds ratio)=6.3, 95% IC=[2.9-13.9], p=2.3e-7), SORL1 (OR=3.4 [2.1-5.6], p=1.6e-7) et ABCA7 (OR=2.5 [1.7-3.8], p=9.3e-7). L’association avec TREM2 était robuste à l’exclusion du variant p.R47H, rapporté comme associé avec le risque de MA. Aucun signal ne passait le seuil de significativité requis concernant les patients avec une MA à début tardif et une significativité de l’ordre de 10-6 était observée pour l’ensemble des patients pour les variants disruptifs et SD (DSD) de TREM2 (OR=4.8 [2.3-10.1], p=6.2e-6). Aucune association n’a été identifiée avec les variants rares de PLD3, UNC5C et AKAP9.

Avec une MAF cumulée de 0.63% parmi les contrôles et un OR de 6.3, les variants rares DSD de TREM2 expliquaient 1.17% de l’héritabilité de la MA précoce, ceux de SORL1 en expliquaient 1.42% (OR=3.4, MAF cumulée de 1.89%), et pour ABCA7, 1.33% (OR=2.5, MAF cumulée de 3.22%). En comparaison, 9.12% de l’héritabilité de la MA précoce était attribuable au facteur de risque commun à effet fort APOE4.

Notre étude confirme et élargit les résultats d’association au niveau du gène concernant TREM2, SORL1 et ABCA7, et précise les catégories de variants et de patients. Avec des échelles d’effets différentes (TREM2 > SORL1 > ABCA7) et des MAF cumulées inversement corrélées, les variants rares DSD des 3 gènes contribuent de manière similaire à l’héritabilité de la MA précoce. Ces résultats constituent une première étape vers un calcul de risque personnalisé permettant potentiellement une médecine génomique préventive dans la MA précoce, en plus des très rares formes autosomiques dominantes.

Les paraplégies spastiques héréditaires sont des maladies neurologiques rares, phénotypiquement et génétiquement très hétérogène, avec une prévalence estimée à 5/100 000 hab. en Europe. Ces pathologies se caractérisent principalement par la présence d’un syndrome pyramidal progressif et d’une spasticité des membres inférieurs dans les formes « pures », les formes « complexes » étant associées de façon variable à un ou plusieurs signes neurologiques ou extraneurologiques.. En plus d’une grande hétérogénéité clinique, ces pathologies sont également caractérisées par une diversité des modes de transmission (autosomique dominant ou récessif, lié à l’X, mitochondrial) et des gènes impliqués. A ce jour, des mutations ont été décrites dans plus d’une soixantaine de gènes. Nous avons récemment développé une stratégie de séquençage ciblé moyen débit permettant l’étude simultanée de 65 gènes. Depuis son utilisation en routine, plus de 800 patients ont pu être explorés dans le cadre d’un diagnostic moléculaire de paraplégie spastique. Pour 28% des patients explorés, il a été possible d’identifier le gène responsable de la pathologie, et pour 10% des cas, des études de ségrégation de variant(s) dans la famille sont encore nécessaires pour statuer définitivement. Si comme attendu le panel a permis d’identifier des mutations dans des gènes fréquemment mutés dans les paraplégies spastiques (ATL1/SPG3A, SPAST/SPG4, SPG7 et SPG11) il a également permis d’observer de nombreux cas de patients portant une mutation du gène KIF1A/SPG30. Le gène KIF1A avait initialement été décrit comme responsable de paraplégie spastique de forme complexe et de transmission autosomique récessive, mais plusieurs publications ont depuis montré son implication chez des patients présentant des paraplégies spastiques de transmission autosomique dominante avec des formes pures ou complexes. Notre grande série de patients présentant une mutation du gène KIF1A (plus de 30 patients) démontre[A1]  que ce gène est le 2^nd gène le plus fréquemment impliqué dans cette pathologie (après le gène SPAST/SPG4) et qu’il est très majoritairement associé à des formes dominantes ou de novo. Les mutations observées sont quasi exclusivement du type faux-sens et localisées dans le domaine moteur de la protéine qui appartient à la famille des kinésines. Une situation similaire est retrouvée pour le gène KIF5A qui code également pour une protéine de cette famille. .Ces observations tendent à soutenir l’hypothèse déjà développée que les mutations de ces 2 gènes seraient des mutations de type dominant négatif.

Les démences lobaires frontotemporales (DLFT), bien que considérées comme des maladies rares, représentent la seconde cause de démences dégénératives précoces après la maladie d’Alzheimer. Les DLFT sont caractérisées par des troubles du comportement ou une atteinte du langage. Une sclérose latérale amyotrophique liée à une atteinte des motoneurones est associée chez près de 15% des cas (DLFT-SLA).

Les formes familiales représentent près de 40% des DLFT. Les mutations de C9ORF72, GRN et MAPT expliquent la majorité de ces formes. En revanche il y a très peu de connaissances pour expliquer la variabilité de l’âge de début des symptômes. Ces derniers peuvent apparaitre durant la trentaine pour les formes les plus précoces jusqu’à des cas de pénétrances incomplètes chez des sujets âgés, en particulier dans les formes avec mutations C9ORF72 et GRN. Le but de ce travail est de caractériser les variations génétiques pouvant influencer l'âge de début des symptômes.

Notre étude est basée sur les données cliniques, généalogiques et génétiques d’une cohorte de 504 patients issus de 223 familles C9ORF72 (n=133) et GRN (n=90). L’objectif était de : 1) évaluer l’héritabilité de l’âge de début des symptômes; 2) analyser les profils de corrélations phénotypiques intrafamiliales; 3) identifier les loci responsables dans ces deux formes génétiques.

L’analyse des familles DLFT C9ORF72 nous a permis d’estimer à 42% (P = 1.10^e-4) et 62% (P = 8.10^e-5) l’héritabilité de l’âge de début des symptômes selon le mode début de la maladie considéré (DLFT et/ou SLA ou DLFT pure). L’analyse approfondie des profils particuliers de corrélations phénotypiques intrafamiliales a également permis de suggérer un lien entre de possibles modificateurs et le chromosome X. L’étude des familles DLFT GRN a révélé une estimation d’héritabilité moindre ainsi que de plus faibles niveaux de corrélations phénotypiques intrafamiliales.

Les analyses familiales de liaison et d’association entre paires d’apparentés avec des phénotypes concordants et discordants et mutés pour C9ORF72 ou GRN ont, entre autre, mis en évidence deux nouveaux loci candidats avec des scores suggestifs de liaison et d’association. Un des deux loci se situe sur le chromosome X incluant cinq gènes d’intérêt majeur. Des investigations supplémentaires sont en cours pour augmenter la taille de notre cohorte et mettre en évidence les variations impliquées.

L’ensemble de ce travail illustre l’intérêt d’utiliser des approches familiales dans une maladie rare pour mettre en évidence de nouveaux modificateurs génétiques. Malgré une cohorte de taille restreinte, cette méthodologie couplée à des données phénotypiques précises nous a permis d'émettre des hypothèses quant à la présence et la localisation d’éventuels modificateurs génétiques et de mettre en évidence des nouveaux loci qui n’auraient pas été obligatoirement détectés par des approches méthodologiques différentes de type cas-contrôles.

Soutenue par la Direction de l’Hospitalisation et de l’Organisation des Soins (DHOS), la technique d’Analyse Chromosomique sur Puce à ADN (ACPA) a été implantée dans les laboratoires de diagnostic dès 2007. Douze centres coordonnateurs, en relation avec 44 CHU ont été retenus permettant de couvrir l’ensemble du territoire national. Le réseau AChroPuce a été constitué en 2008 aux Assises de génétique à Lille avec pour objectifs principaux d’harmoniser les pratiques, rédiger un guide de bonnes pratiques, mettre en place un EEQ et favoriser les études collaboratives. En 10 ans, ces objectifs ont été atteints et même dépassés avec en plus le transfert en diagnostic de l’ACPA en période prénatale, un travail sur l’accréditation de l’ACPA, le partage de sondes pour les vérifications FISH, une réflexion éthique sur les données secondaires, une négociation des tarifs commerciaux au niveau national, l’organisation d’une base de données nationale de variations du nombre de copies (CNV) et plus de 100 publications scientifiques en collaboration.

Le nombre d’ACPA réalisé par an est passé de 500 à environ 21 000 en 10 ans. Dix ans plus tard et avec l’arrivée de la technique de Whole Genome Sequencing (WGS), dont le transfert en diagnostic pour les maladies rares et le cancer est prévu dans le cadre du plan France Médecine Génomique 2025 et qui se concrétisera par la mise en place d’ici fin 2018 des deux plateformes pilotes de séquençage à très haut débit, se pose la question des perspectives de ce réseau. En effet, les algorithmes d’analyse de variations du nombre de copies vont s’améliorer ainsi que ceux pour la détection de variations structurales équilibrées. De ce fait, dans 5 ans la technique de WGS sera capable de détecter des CNV de façon aussi fiable que l’ACPA. Néanmoins, les compétences pour analyser les CNV perdureront et devront même être renforcées puisque des CNV de plus petite taille pourront également être détectées. A l’avenir, la séparation entre génétique moléculaire et cytogénétique sera amenée à disparaître d’un point de vue technologique. Deux grandes options sont alors envisageables : soit former des spécialistes des variants structuraux équilibrés et déséquilibrés (SV) et des spécialistes des variants nucléotidiques (SNV) qui travailleront en synergie, soit former des spécialistes d’une thématique (déficience intellectuelle, infertilité...) qui analyseront aussi bien les CNV que les SNV. De toute manière, il sera indispensable de poursuivre la formation à la physiopathologie chromosomique, nécessaire au conseil génétique des réarrangements génomiques. Seront discutées les perspectives du réseau et les objectifs à atteindre eu égard i) à la question fondamentale de l’organisation future des laboratoires de génomique et ii) à la mise en place du réseau NGS-Diag, avec en perspective le Plan National Maladies Rares 3 et des liens avec le plan France Médecine Génomique 2025.

L’épilepsie est une maladie neurologique grave qui se caractérise par une récurrence non provoquée de crises convulsives. La biologie des systèmes et les analyses de réseaux de gènes constituent des approches puissantes pour étudier les voies moléculaires impliquées dans l’épilepsie. Elles ont aussi déjà permis de pointer de nouvelles cibles thérapeutiques.

Des données en accès libre issues de plusieurs types d’études ont été ré-analysées en utilisant des approches de génomique intégrative basées sur l’analyse des réseaux de gènes et de protéines. La nouvelle exploitation de ces données a permis l’identification du réseau M30. Le réseau M30 se compose de 320 gènes largement exprimés dans le cerveau humain sous un contrôle étroit pendant le développement. Ces gènes codent principalement pour des protéines qui interagissent entre elles et qui sont impliquées dans des processus synaptiques. L’altération fonctionnelle de M30 par des variations génétiques rares ou communes, et la diminution de son expression semblent constituer un mécanisme convergent influençant la susceptibilité à l’épilepsie et aux crises d’épilepsie en général.

En tirant profit des changements d’expression induits par des médicaments rapportés dans la base de données “Connectivity map” (CMap) pour 1,300 composés thérapeutiques, nous avons pu sélectionner les médicaments dont l’effet sur l’expression de M30 est d’inverser la diminution d’expression observée dans les cerveaux épileptiques. Les meilleurs résultats ont été obtenus pour l’acide valproïque (anti-épileptique plus connu sous le nom commercial de Depakine), apportant une nouvelle preuve de concept au paradigme de réversion de la signature transcriptionnelle comme stratégie thérapeutique. Le dépistage systématique de médicaments en fonction de leur effet mesuré sur l'expression des gènes a également prédit que la withaferine A (WFA) inverse les changements d'expression de M30 associés à l'épilepsie.

Au total, nos résultats suggèrent qu’en ciblant le réseau M30 on pourrait identifier de nouvelles molécules anti-épileptiques et développer de nouvelles stratégies thérapeutiques contre l’épilepsie (Genome Biology 2016, doi: https://doi.org/10.1186/s13059-016-1097-7).

Contexte

Les mutations des gènes BRCA1/2 et PALB2, recherchées en routine dans les contextes évocateurs de prédisposition aux cancers du sein ou de l‘ovaire, expliquent moins de 10% des histoires familiales. Or ces dernières années l’apport des technologies de séquençage haut débit a permis de rendre possible l’analyse simultanée d’un grand nombre de gènes (analyse en panel de gènes) pour lesquels un lien avec une augmentation des risques de ces cancers a été rapporté.

En France, en l’absence de référentiel, les pratiques diffèrent aussi bien pour la sélection des nouveaux gènes analysés en panel que pour la prise en charge des personnes chez qui une mutation germinale a été identifiée.

Ainsi le Groupe Génétique et Cancer GGC (UNICANCER) a constaté que l’utilité clinique de la recherche de mutation de ces nouveaux gènes était à préciser. Ceci a incité les acteurs du GGC à conduire un travail visant à définir le panel de gènes à analyser dans la prédisposition au cancer du sein ou de l’ovaire, et à établir des recommandations spécifiques à chaque gène expertisé pour la prise en charge clinique des familles.

Méthodologie

Une analyse critique de la littérature par un groupe de travail composé de membres du GGC a permis de retenir les données permettant des estimations de risque sans biais. Les gènes ont été reconnus d’utilité clinique lorsque le sur-risque de cancer du sein (ou de l’ovaire) était au moins 4 fois supérieur au risque en population générale (différentiel de risque permettant de proposer dans une famille des tests génétiques pré symptomatiques : Easton et al, N Engl J Med 2015 Gene-panel sequencing and the prediction of breast-cancer risk).

Résultats

En pratique, parmi les 18 gènes d’intérêt (en plus de BRCA1 et BRCA2) expertisés, le GGC retient un panel de 13 gènes d’utilité clinique confirmée qu’il recommande d’analyser devant tout contexte évocateur d’une prédisposition aux cancers du sein ou de l’ovaire : BRCA1, BRCA2, PALB2, TP53, CDH1, PTEN, RAD51C, RAD51D, MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 et EPCAM. Il dresse également l’argumentaire ayant conduit à ne pas retenir les 7 autres gènes (CHEK2, ATM, BARD1, BRIP1, NBN, RAD51B, STK11). De plus, grâce à ce travail, le groupe présente pour chaque gène expertisé les préconisations de dépistage, de prévention et de conseil génétique dans les familles, que les données scientifiques actuelles et les référentiels autorisent.

Perspectives

Les laboratoires d’oncogénétique s'organisent pour appliquer ce nouveau panel avec les critères de qualité et les réseaux d'expertises associés. De plus un protocole de recherche (TUMOSPEC), promu par UNICANCER, est actuellement mis en place pour estimer plus précisément les risques de cancer en relation avec un ensemble de gènes notamment ceux non retenus dans le panel actuel. Compte tenu de la rapidité d'évolution des connaissances, une mise à jour annuelle des données est prévue par le groupe de travail, avec une attention particulière pour les gènes ATM, CHEK2 et STK11.

La proprotéine convertase subtilisin kexin de stype 9 (PCSK9) est un régulateur majeur de l’homéostasie du cholestérol, en contrôlant l’expression du récepteur aux LDL (LDLR) au niveau du foie. Alors que les mutations gain de fonction (GOF) de PCSK9 sont associées à l’hypercholestérolémie autosomale dominante (ADH) et à une athérosclérose précoce, les mutations perte de fonction (LOF) ont un effet cardioprotecteur et peuvent conduire dans certain cas au développement d’une hypobétalipoprotéinémie familiale (FHBL). Bien que des traitements contre l’ADH ciblant PCSK9 sont disponibles, les modèles cellulaires actuels permettant de mieux comprendre les fonctions de PCSK9 sont limités.

Notre objectif a été de valider le modèle de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPS) générées à partir de cellules urinaires pour la modélisation de l’ADH et de la FHBL liées aux mutations de PCSK9.

Pour atteindre notre objectif, nous avons utilisé des échantillons d’urines de patients porteurs de différentes mutations de PCSK9, ou de sujets sains, comme source de cellules somatiques pour obtenir des cellules hiPS après reprogrammation via des vecteurs épisomaux. Les cellules hiPS ont ensuite été différenciées en hépatocytes afin d’en étudier le phénotype.

Comparés aux cellules contrôles, les hépatocytes portant la mutation GOF S127R secrètent moins de PCSK9 et montrent une diminution de 71% de l’internalisation des LDL, alors que les hépatocytes portant la double mutation hétérozygote LOF R104C/V114A présentent une forte décroissance de la sécrétion de PCSK9 et une augmentation de 106% de l’internalisation des LDL. Un traitement par statine (pravastatine) stimule l’expression génique du LDLR et de PCSK9, ainsi que la sécrétion de PCSK9 et l’internalisation des LDL à la fois dans les cellules contrôles et les cellules de patients hypercholestérolémiques portant la mutation GOF S127R. De plus, l’augmentation de l’internalisation du LDL de 2,19 ± 0,77 par les hépatocytes S127R traités par la pravastatine (versus 1,38 ± 0,49 pour les hépatocytes contrôles) reflète la bonne réponse clinique aux statines (-60,4% ; n=5) des patients portant cette même mutation.

En conclusion, les échantillons d’urines sont une source remarquable de cellules somatiques pouvant être reprogrammées en cellules hiPS et différenciées en hépatocytes pour l’étude de maladies métaboliques. Ce modèle va nous permettre de mieux comprendre les fonctions de PCSK9 dans la régulation du métabolisme les lipoprotéines telles que l’apolipoprotéine B ou l’énigmatique Lp(a). Enfin, nous entreprenons une différentiation des cellules hiPS en 3 dimensions dans un format 96 puits pour optimiser la fonctionnalité des hépatocytes et adapter leur utilisation en analyse en haut débit (high content screening) et plus largement en pharmacogénomique en collaboration avec l’entreprise HCS Pharma.

L’épidermolyse bulleuse dystrophique récessive (EBDR) est l’une des maladies génétiques cutanées les plus graves de l’enfant et de l’adulte jeune. L’EBDR est due à des mutations du gène COL7A1 entraînant une perte de fonction du collagène VII (C7). C7 est secrété localement par les kératinocytes épidermiques et les fibroblastes dermiques. Il est le composant principal des fibrilles d’ancrage, structures essentielles pour l'adhésion de l’épiderme au derme sous-jacent. Les sujets atteints d’EBDR présentent des bulles et des décollements cutanéo-muqueux secondaires à des traumatismes minimes, responsables de plaies chroniques et de nombreuses complications locales (pseudosyndactylies, contraction et fibrose cutanée, sténose oesophagienne) et systémiques (inflammation, dénutrition, anémie). La survenue de carcinomes épidermoïdes cutanés agressifs sur les plaies chroniques reste la première cause de décès de ces jeunes patients. Il n’existe pas à ce jour de traitement spécifique.

Les injections locales et systémiques de cellules stromales mésenchymateuses (CSM) allogéniques dérivées de la moelle osseuse ont montré leur potentiel pour réduire l'inflammation cutanée et améliorer la cicatrisation des plaies chez les patients EBDR. Ces améliorations cliniques sont cependant transitoires. Les mécanismes d'action des CSM dans l’EBDR et leur durée de vie après injection sont mal connus. Les CSM pourraient agir via leurs propriétés anti-inflammatoires, l'expression de C7 endogène par un effet paracrine et/ou l'expression de C7 par les CSM injectées. Dans cette étude, nous avons étudié l'expression de C7 par les CSM injectées par voie intradermique dans un modèle murin de xénogreffe EBDR. Ce modèle consiste en la greffe d’une peau reconstruite à partir de cellules de patients EBDR homozygotes pour une mutation nulle de COL7A1 sur des souris immunotolérantes. La persistance des cellules injectées et la durée d’expression de C7 ont été analysées.

Les CSM utilisées pour l’injection locale expriment in vitro une quantité d’ARNm de COL7A1 et de C7 comparable aux fibroblastes dermiques sains. L'injection intradermique d'une dose unique de CSM dans la peau EBDR reconstruite a permis de restaurer une expression de C7 humain normal produit par les cellules injectées. Le dépôt de C7 à la jonction dermo-épidermique est comparable au contrôle et persiste jusqu'à 6 mois après l'injection. La présence des CSM dans la peau reconstruite a été analysée par FISH et montre une persistance de celles-ci jusqu'à 4 mois après l'injection. Ces données montrent que les CSM injectées par voie intradermique ont le potentiel de restaurer l’expression de C7 normal in vivo de façon prolongée et d'améliorer l'adhésion dermo-épidermique de la peau EBDR.

Le nombre de grossesses gémellaires n’a cessé d’augmenter en France depuis plus de 25 ans pour atteindre 1,74% des naissances en 2014 (INED). Les algorithmes utilisés dans le calcul du risque de trisomie 21 dans le cadre du dépistage anténatal ne sont pas validés en cas de grossesse multiple. Face à l’absence d’un test de dépistage de la trisomie 21 fiable dans cette situation, l’Association des Cytogénéticiens de Langue Française préconise la réalisation d’un test de dépistage prénatal non invasif de la trisomie 21.

Les laboratoires Biomnis et du CHU de Lyon réalisent ce test dans cette indication respectivement depuis décembre 2014 et avril 2016. Tous deux utilisent une approche de séquençage génome entier à faible profondeur. Le laboratoire Biomnis utilise une technologie Illumina (Verinata puis VeriSeq) alors que le CHU de Lyon utilise un séquenceur semiconducteur Proton (Life Technologies) et analyse des données avec le logiciel WISECONDOR (protocole Consortium H+). Le CHU de Lyon ne réalise pas d’estimation de la fraction fœtale.

Sur un total de 20107 tests réalisés, 1697 l’ont été pour des grossesses gémellaires (8.4%). L’âge moyen au prélèvement était de 34,1 ans contre 35,7 ans pour les grossesses simples. Le terme moyen de grossesse était de 15,9 semaines d’aménorrhée (SA) contre 16,8 SA en cas de grossesse simple. Sur 1695 résultats rendus, 13 étaient en faveur d’une trisomie 21 (0.77%), 1682 étaient négatifs pour la trisomie 21. Lors de la confirmation par caryotype sur ponction de liquide amniotique, 9 patientes étaient effectivement porteuses d’un fœtus trisomique 21 (grossesses bichoriales biamniotiques) dont un cas de trisomie 21 libre en mosaïque à 12%. Deux patientes ayant reçu un résultat positif sont perdue de vue ou en cours d’étude. L’un des deux cas de résultat faussement positif est une grossesse gémellaire pour laquelle l’un des fœtus est décédé pendant la réalisation du test sans qu’une étude cytogénétique n’ait pu être menée. Par ailleurs, nous avons identifié 2 résultats faux négatifs (naissance d’un enfant trisomique 21) dont un pour lequel le résultat avait été rendu douteux sur un premier prélèvement. En ne considérant que les prélèvements pour lesquels l’issue de grossesse est connue ce jour (n=862) on peut établir sur notre série des valeurs prédictives positive et négative du test de 81.8% et 99.7 % respectivement. Il est à noter que 9 tests ont été réalisés pour des grossesses triples. Les résultats étaient tous négatifs.

Si l’ensemble des issues de grossesse n’est pas encore connu, nos résultats montrent les bonnes performances du test de dépistage prénatal non invasif de la trisomie 21 en cas de grossesses gémellaires. Ces performances sont en accord avec les rares données de la littérature et doivent faire l’objet d’une collaboration de plus grande ampleur.

Les techniques de cytogénétique moléculaire, comme l’Analyse Chromosomique sur Puce à ADN (ACPA) permettent la détection de grands réarrangements, pertes ou gains de matériel génétique de plus de 1kb, nommés CNV (Copy Number Variation).

Ces CNVs sont souvent identifiés et associés à des maladies génétiques comme les déficiences intellectuelles. Plus de 100 000 analyses ACPA ont été réalisées à ce jour dans les laboratoires de diagnostic du réseau AchroPuce, et cette activité est évaluée à environ 20 000 analyses par an en France. Les technologies de séquençage à haut débit (NGS) permettent également de détecter les CNVs. L’un des enjeux majeurs de ces analyses (ACPA et NGS) est l’interprétation permettant de classer un CNV en pathogène ou bénin. Malheureusement de nombreux CNVs sont encore classés comme "VOUS" (Variant Of Unknown Significance) rendant le conseil génétique difficile. Connaître leur fréquence, dépendante de l’origine ethnique des patients, permettrait d’aider à leur interprétation. Afin de colliger les données de CNVs au niveau national et permettre le partage des informations facilitant leur interprétation, nous avons développé BANCCO (https://bancco.fr).

BANCCO est un système sécurisé permettant le stockage des données génomiques et phénotypiques grâce à une base de données PostgreSQL. BANCCO propose une interface web sécurisée conviviale développée en HMTL5, PHP et JavaScript et a obtenu l’accord CNIL (2071658v1).

Les utilisateurs ont accès à différents modules de saisie des données phénotypiques, d’import des CNVs (avec système de conversion automatique des coordonnées génomiques entre les 3 dernières versions du génome), de recherche de patients ou de CNVs selon différents critères et un Genome Browser permettant une visualisation simplifiée de l’ensemble des informations de BANCCO.

La description phénotypique des patients se fait à l’aide de l’ontologie HPO (Human Phenotype Ontology) recommandée par l’IRDiRC. Une fiche CNV présente le nombre d’observations, le mode de transmission, la liste des gènes, l’ensemble des CNVs issus de base de données publiques (dbVar, DGV et Clingen), les patients porteurs du même CNV avec un lien vers le centre de référence associé afin de faciliter les échanges et les collaborations, et l’ensemble des CNVs de BANCCO chevauchant ce CNV avec le pourcentage de couverture commune.

Dans le but de faciliter l’interprétation de ces mutations, BANCCO est lié à la base RDVD (Rare Disease Variant Database – https://rdvd.fr) contenant des SNVs (Single Nucleotide Variation) couplés également à des données phénotypiques.

Plusieurs formats d’import ont été implémentés afin de centraliser les données précédemment collectées par l’ensemble des centres. A ce jour BANCCO rassemble 34 157 CNVs identifiés chez 18 849 patients issus de 12 centres du réseau AChroPuce. Le phénotype est décrit à l’aide de 2 267 termes HPO permettant ainsi de faciliter l’interprétation des CNVs et le Match Making.

Depuis l’implémentation  des séquenceurs haut débit (NGS) dans les laboratoires diagnostiques de génétique moléculaire et dans le contexte du plan National Médecine Génomique 2025, une des priorités est la maîtrise, standardisation et automatisation des pipelines bioinformatiques. L’INCa a initié le projet national « Structuration du séquençage de nouvelle génération à visée diagnostique en cancérologie». Dans ce cadre, notre équipe a développé des pipelines validés et automatiques ainsi qu’un outil interfacé de stockage et de manipulation de variants annotés. Cet outil répond à l’absence de solution gratuite suffisamment robuste et qualifiée pour le diagnostic. Actuellement, CanDiD est utilisé par les équipes partenaires et a permis de réaliser le diagnostic chez plus de 11000 patients en oncogénétique, en neurogénétique et en génétique des maladies métaboliques. CanDiD est en validation pour des applications en génétique somatique des cancers et en transfert vers d’autres centres de génétique.

CanDiD peut intégrer dans sa base de données (BDD) l’ensemble des variations et annotations issues des pipelines de NGS. Son système évolutif de type « clef-valeur » permet l’insertion dans la BDD de tout type de donnéesquel que soit le logiciel de « variant-calling » ou d’annotation utilisé. Après configuration de l’«application programming interface » (API) selon les besoins de chaque plateforme et type de diagnostic, les données sont mises à disposition, de manière sécurisée et standardisée, dans une interface graphique «utilisateur». Cette interface, en lien avec l’API, permet à l’utilisateur d’analyser les patients par série de validation personnalisable avec ses propres critères de filtration des variants. Il est possible (i) d’écrire des scenarii de validation linéaire afin de standardiser les analyses, optionnellement avec la création de sous jeux de données (augmentation des performances d’accès) et (ii) d’explorer à façon l’ensemble du jeu de données en accès complet avec la BDD via un moteur de requête graphique. CanDiD permet le calcul de la fréquence des variants et d’enregistrer des annotations privées de variants directement dans l’interface. L’utilisateur peut créer et organiser les annotations privées, notamment la classification en cinq classes selon les recommandations de l’ACMG, afin de conserver la mémoire de ces annotations et de garantir l’homogénéité d’interprétation des variants au fil du temps. Enfin, la gestion des droits permet, une fois le travail du généticien moléculaire terminé, de verrouiller en modification la série et d’exporter les données sous forme de rapport. Des liens contextuels vers les logiciels de navigation sur le génome sont paramétrés et les interfaces vers un système de gestion de laboratoire possibles. Les sources informatiques sont rendues librement disponibles sur un dépôt public localisé en France. https://gitlab.normandy-genomic-medicine.fr/

La famille des protéines de liaison au chromodomaine hélicase de l’ADN (CHD) est essentielle  au remodelage de la chromatine et utilise l’énergie issue de l’hydrolyse de l’ATP pour réguler la structure de la chromatine, modulant ainsi l’expression des gènes. Plusieurs gènes codant pour des protéines de cette famille ont été impliqués en pathologie humaine (CHD2, CHD7, CHD8) mais jamais CHD3  jusqu’à présent. Nous rapportons ici une série internationale de 33 patients, constituée grâce à GeneMatcher, porteurs de variants de novo dans CHD3, identifiés par NGS. Tous  les patients ont un retard de développement avec une hypotonie fréquente, une déficience intellectuelle légère à sévère et une atteinte marquée du langage. Les troubles du comportement sont fréquents. La plupart sont macrocéphales  avec une dysmorphie reconnaissable avec un front haut et large, un hypertélorisme, un épicanthus, un œdème sus orbitaire, des fentes palpébrales étroites et un menton pointu.  La plupart des variants sont des faux-sens et se situent dans le domaine ATPase/helicase ou à proximité. L’étude de l’impact fonctionnel de plusieurs de ces variants à l’aide de modèles cellulaires montre pour certains un impact sur l’activité ATPase. En conclusion, les variants du gène CHD3 sont responsables d’un nouveau syndrome neuro-développemental reconnaissable.

La déficience intellectuelle (DI) touche 1 enfant sur 250, de causes génétiques, acquises et/ou environnementales. Alors que les formes sévères sont le plus souvent d’origine monogénique, les formes moyennes et modérées sont souvent liées à une conjonction de facteurs génétiques et environnementaux. Les causes génétiques en sont multiples avec un vaste ensemble de maladies rares ou exceptionnelles. Plus de 500 gènes OMIM sont associés à des DI isolées et près de 2000 gènes à des DI syndromiques. Au cours de ces dernières années, les nouvelles technologies de séquençage haut-débit pan-génomique ont largement prouvé leur efficacité à identifier les bases moléculaires des pathologies rares avec une grande hétérogénéité clinique et génétique. Cependant, de nombreux résultats demeurent non-concluants car les corrélations génotype-phénotype sont limitées par la rareté de la récurrence de la maladie. La mise en place d’un réseau de partage des données internationales a permis d’augmenter les chances d’identifier d’autres patients avec un phénotype similaire et de mettre en évidence de nouveaux syndromes.

Dans cette étude, nous rapportons le cas d’une patiente présentant une DI associée à une microcéphalie, une dysmorphie faciale, une brachydactylie, des pieds courts, ainsi qu’une hypoplasie du corps calleux. Un séquençage haut débit d’exome en trio a permis de mettre en évidence une mutation tronquante de novo, dans le gène HNRNPR. Trois patients additionnels ont été identifiés à la suite du partage des données par le réseau GeneMatcher. L’étude phénotypique a permis de retrouver des caractéristiques communes chez ces patients présentant tous une mutation tronquante sporadique du gène HNRNPR.

HNRNPR code pour une protéine de la superfamille des ribonucleo-protéines nucléaires (hnRNP) impliquées dans le métabolisme des acides nucléiques incluant le processus d’épissage, la stabilisation des ARNm ainsi que dans la régulation de la transcription et de la traduction. HNRNPR semble interagir spécifiquement avec les ARNm et impliqué dans des processus post-traductionnels. Le métabolisme des ARNm est particulièrement important pour le bon fonctionnement et la formation des synapses, ce qui explique que de nombreux gènes impliqués dans ce métabolisme sont associés à la DI. Les études fonctionnelles en cours sur les lignées cellulaires des patients permettront de mieux caractériser la fonction de la protéine HNRNPR et d’analyser l’impact des mutations tronquantes du gène HNRNPR dans le métabolisme des ARNm.

En conclusion, nous avons identifié un nouveau gène impliqué dans le métabolisme des ARNm, responsable de DI syndromique avec microcéphalie et agénésie/hypoplasie du corps calleux.

L’arhinie-microphtalmie (syndrome de Bosma, BAMS) est une anomalie de développement extrêmement rare et frappante caractérisée par l’absence complète de nez avec ou sans  anomalie ophtalmologique.  Nous rapportons ici des mutations faux-sens du gène SMCHD1 (Structural Maintenance of Chromosomes flexible Hinge Domain containing 1) dans la totalité de 14 cas sporadiques d’arhinie-microphtalmie recrutés dans 6 pays. De manière remarquable, ces mutations sont confinées aux exons de SMCHD1 codant pour le domaine ATP-ase élargi de ce régulateur épigénétique aux rôles pléiotropiques : inactivation du chromosome X, mécanismes d’empreinte génomique et réparation de cassures d’ADN double brin. Sans exception ces mutations sont survenues de novo chaque fois que les ADNs parentaux ont pu être testés.

Des analyses biochimiques et des tests dans le modèle d’embryons de Xénope suggèrent fortement que les mutations BAMS se comportent comme des allèles gain de fonction. Elles s’opposent ainsi à d’autres mutations SMCHD1 identifiées dans la myopathie facio-scapulo-humérale de type 2 (FSHD2) faisant de cette situation un cas d’expansion phénotypique assez extrême (CT Gordon et al. Nat Genet 2017).

Nos résultats permettent d’établir que SMCHD1 est un acteur majeur du développement de la pyramide nasale et ont un impact sur la recherche de ses gènes cibles essentiels dans la régulation de la formation cranio-faciale, malgré la très petite fenêtre développementale de la placode nasale et de la vésicule optique. Par le biais de la pathologie moléculaire, ils contribuent aussi à une meilleure connaissance de cette protéine, notamment de sa fonction GHKL-ATPase, et des propriétés enzymatiques qui pourraient être, à rebours, exploitées dans le développement de traitements innovants de la myopathie facio-scapulo-humérale de type 2. 

Des mutations gain-de-fonction de FGFR3 (fibroblast growth factor receptor 3) sont responsables de plusieurs formes de nanisme telles que l'achondroplasie, forme la plus fréquente; ainsi que la forme létale, le nanisme thanatophore. L'activation constitutive de FGFR3 perturbe le processus normal de croissance des os du squelette. Dans les ciliopathies squelettiques, caractérisées par des anomalies des protéines ciliaires, on retrouve également des anomalies de la croissance osseuse. L'impact des mutations gain-de–fonction FGFR3 sur le cil primaire dans les chondrocytes de la plaque de croissance est inconnu dans l’achondroplasie et le nanisme thanatophore.

Nous avons étudié le cil primaire dans des chondrocytes humain et murin porteurs de mutations FGFR3. Nous démontrons que dans les chondrocytes de la plaque de croissance dans l’achondroplasie, le nanisme thanatophore et les souris Fgfr3^Y367C/+, la longueur du cil primaire était réduite et que la protéine IFT20 était anormalement localisée à la base du cil lorsque FGFR3 était activé. Nous montrons que l'inhibition de FGFR3 avec un inhibiteur des récepteurs tyrosine kinase (PD173074) rétablissait la longueur du cil primaire et la localisation de IFT20 au niveau de l’axonème du cil. Nous avons également étudié l'impact de la rapamycine, un inhibiteur de la voie mTOR, sur le cil primaire. L'inhibition de mTOR corrige positivement la longueur du cil primaire et la localisation intraciliaire d’IFT20. L’ensemble de ces résultats suggère que la désorganisation de la plaque de croissance observée dans l’achondroplasie et le nanisme thanatophore due au FGFR3 activé pourrait potentiellement être attribuée au cil primaire. En conclusion, les chondrodysplasies liées à des mutations FGFR3 semblent être une nouvelle forme de pathologie squelettique avec une ciliogenèse défectueuse.

Les RASopathies est un groupe de pathologies autosomiques dominantes dues à des mutations des gènes de la voie RAS/MAPK. Ce mécanisme moléculaire commun est à l’origine d’une continuité phénotypique entre les RASopathies. Le syndrome de Noonan (SN) est la RASopathie la plus fréquente (1/1000 à 1/2500). Le syndrome cardio-facio-cutané (CFC) et le syndrome de Costello (SC) sont des RASopathies moins fréquentes mais plus sévères.

En Tunisie, les caractéristiques cliniques et génétiques des RASopathies sont peu étudiées.

L’objectif de notre travail était d’analyser le profil clinique et génétique des RASopathies chez une série de patients tunisiens et d’établir une corrélation génotype-phénotype.

Nous avons mené une étude descriptive rétrospective des patients suivis pour SN, syndrome CFC et SC au service des Maladies Congénitales et Héréditaires de l’hôpital Charles Nicolle de Tunis sur une période de 10 ans (2006 à 2016). Les critères d’inclusion étaient cliniques basés sur des scores objectifs. L’étude moléculaire a été réalisée par séquençage de type Sanger et par séquençage de nouvelle génération (NGS) des gènes impliqués dans les RASopathies.

Vingt-sept patients atteints de Rasopathies ont été inclus dans notre étude dont 25 cas sporadiques et un cas familial. La majorité des patients (21/27) avaient un SN. 5/27 patients avaient un syndrome CFC et 1/27 patient avait un SC. L’âge moyen des patients au moment du diagnostic était de 10 ans. Tous les signes cardinaux des Rasopathies ont été retrouvés à savoir : le retard statural postnatal (85%), la dysmorphie faciale typique (85%), la cardiopathie (81%) avec une prédominance de la sténose pulmonaire valvulaire, les atteintes cutanées (85%), les malformations typiques du sternum (48%) et le retard psychomoteur (63%). Des signes moins fréquents ont été retrouvés à savoir : la cryptorchidie (5/10 des patients de sexe masculin), le retard pubertaire (4/7 adultes), la scoliose (4/27), le strabisme (4/27), la myopie (5/27) et la surdité (1/27). Aucun patient n’a développé de tumeur maligne ni bénigne.

L’étude moléculaire a confirmé le diagnostic chez 17/21 patients testés : 13/17 cas de SN dont un cas de syndrome de Noonan avec lentigines multiples, 3/3 cas de CFC, 1/1 cas de SC. Les gènes mutés étaient par ordre de fréquence : PTPN11 (6/17), SOS1 (3/17), RIT1 (2/17), MEK1 (2/17), RAF1 (1/17), BRAF (1/17), NRAS (1/17) et HRAS (1/17).

Chez 2/21 patients testés des mutations nouvelles ont été identifiées dans des gènes récemment décrits dans le SN : LZTR1 et KAT6B. Dans les 2 cas restants, aucune mutation n’a été identifiée.

Le spectre clinique et génétique des RASopathies dans notre population sont similaires à ceux des autres populations. Une meilleure connaissance de ces pathologies et l’application des techniques de NGS dans le diagnostic de routine permettront un diagnostic rapide des RASopathies, une prise en charge adaptée et un conseil génétique adéquat.