Intracranial aneurysms (IA) are acquired cerebrovascular abnormalities characterized by a localized dilation and wall thinning in intracranial arteries. The main IA complication is the rupture, resulting in subarachnoid haemorrhage and possibly leading to severe outcome. IA pathogenesis is still largely unknown, with no reliable risk marker available so far. Here we have identified one rare nonsense variant (1617A>T) in the last exon of the GAIA-1 gene, shared by the 4 tested affected members from a large pedigree with multiple IA carriers. We have showed a 50% reduction of GAIA-1 serum concentration in heterozygous 1617A>T careers compared to their non-carrier relatives, and found that this reduction results from the inability of the truncated protein (K460*-GAIA-1) produced by the transcripts carrying the 1617A>T variant to be secreted. By extending our genetic screen, we then identified other rare missense or frameshift variants in GAIA-1, carried by 5 out of 94 additional index cases with familial IA. We observed a significant enrichment (p=0.0004) in rare coding variants within this gene in our population of 95 index cases with familial IA, compared to a reference population of 63,339 NFE individuals. In total, among the 6 families, 11 out of 12 (92%) family members carrying IA also carry such variants in GAIA-1, versus only 14 out of 41 (34%) unaffected ones (p=0.0048). We also noticed a higher rate of individuals with a history of high blood pressure among affected versus healthy carriers of GAIA-1 variants, suggesting that GAIA-1 could trigger lesions in the cerebral arterial wall when challenged by risk factors such as hypertension. Altogether, our results indicate that rare coding variants in GAIA-1 are causally related to familial forms of IA.

Dans le cadre des enjeux éthiques et psychologiques liées aux données secondaires (DS) issues du séquençage à haut débit (SHD), nous présentons les résultats de deux études distinctes. La première nommée SEQUAPRE avait comme objectif d’étudier les préférences et représentations des parents d’enfants atteints d’anomalies du développement vis-à-vis du SHD. Après un temps d’information dédié à la notion de résultats incertains et fortuits, 513 questionnaires basés sur des scénarios hypothétiques dans le cadre de la méthode des choix discrets (DCE) ont été recueillis. Ils ont montré que les parents valorisent globalement positivement la communication des résultats incertains et secondaires, ce qui est concordant avec les résultats de la littérature médicale sur le sujet.

La seconde étude, nommée PADAP, a convié des parents et des patients à une réflexion ouverte sur l’opportunité technologique d’accéder à des DS actionnables identifiées par SHD. Après une matinée d’information médicale sur le SHD et la liste des gènes actionnables proposée par l’ACMG, les participants ont été répartis dans 5 focus groupes animés par des psychologues cliniciens. L’objectif était de recueillir leurs avis concernant l’accès aux DS par analyse qualitative des verbatim. Le groupe 1 de parents d’enfants sans diagnostic a révélé une forte quête d’informations médicales exhaustives incluant la révélation de DS. Les 4 autres groupes de sujets concernés par l’annonce d’une prédisposition ont été constitués par type de pathologies : groupe 2 en oncogénétique,  groupe 3 en cardiogénétique, groupe 4 pour des maladies métaboliques et groupe 5 pour des sujets porteurs hétérozygotes d’une pathologie rare autosomique récessive. Les préférences ont été beaucoup plus ambivalentes que dans le groupe 1. Les arguments contre la recherche des DS concernaient le caractère anxiogène des surveillances médicales régulières et du statut de porteur asymptomatique, ainsi qu’un vécu traumatique de diagnostic en oncogénétique et cardiogénétique notamment. La notion d’utilité médicale a fait débat au regard de l’impact psychologique de tels diagnostics, de même que l’annonce de DS aux mineurs. Néanmoins, ont fait consensus : le fait de laisser le choix aux patients ; l’importance de ne pas retreindre l’information aux seuls aspects médicaux ; la pertinence d’un délai de réflexion; la nécessité d’un accompagnement psychologique ; et la prise en compte du moment auquel survient l’annonce au cours de la vie. Il est aussi apparu important de préciser la notion de gène actionnable dont l’impact psychique diffère suivant qu’il s’agit de l’annonce d’un risque, d’une prédisposition, de l’accès à de la prévention ou à des traitements.

En conclusion, les attentes et les représentations des personnes diffèrent selon qu’on se trouve en amont d’une annonce diagnostique ou dans l’après-coup, mettant en avant le caractère singulier de chaque situation tant du point de vue médical que du vécu psycho affectif.

The Aristaless-related homeobox (ARX) transcription factor is involved in the development of GABAergic and cholinergic neurons in the forebrain. ARX mutations have been associated with a wide spectrum of neurodevelopmental disorders in humans, among which the most frequent, a 24bp duplication in the protein polyalanine tract 2 (c.428_451dup24), gives rise to intellectual disability, fine motor defects with or without epilepsy.

To understand the functional consequences of this mutation, we generated a partially humanized mouse model carrying the c.428_451dup24 duplication (Arx^dup24/0) that we characterized at the behavior, neurological and molecular level. Arx^dup24/0 males presented with hyperactivity, enhanced stereotypies and altered contextual fear memory. In addition Arx^dup24/0 males had fine motor defects with alteration of reaching and grasping abilities, reminiscent of the very specific upper limb distal motor apraxia associated with a pathognomonic hand-grip observed in ARXdup24 patients. Transcriptome analysis of Arx^dup24/0 forebrains at E15.5 showed a down-regulation of genes specifically expressed in interneurons associated with an up-regulation of genes normally silenced in interneurons, suggesting abnormal interneuron development. Accordingly, interneuron migration was altered in the cortex and striatum between E15.5 and P0 with consequences in adults, illustrated by the defect in the inhibitory/excitatory balance in Arx^dup24/0 basolateral amygdala. Altogether, we showed that the c.428_451dup24 mutation disrupts Arx function with a direct consequence on interneuron development, leading to hyperactivity and defects in precise motor movement control and associative memory. Interestingly, we highlighted striking similarities between the mouse phenotype and a cohort of 33 male patients with ARX c.428_451dup24, suggesting that this new mutant mouse line is a good model for understanding the pathophysiology of this mutation and evaluation of treatment.

Introduction : Les ataxies congénitales (AC) sont définies cliniquement par des symptômes cérébelleux précoces dès les premiers mois de vie. Il s’agit habituellement d’une pathologie non progressive mais il est parfois difficile de distinguer ces AC des ataxies très lentement progressives à début très précoce (APDP). Cette entité clinique, comportant fréquemment une déficience intellectuelle et parfois d’autres signes neurologiques, épilepsie, syndrome pyramidal, neuropathie, correspond à un groupe hétérogène également sur le plan physiopathologique et génétique. En dehors du syndrome de Joubert, qui est une forme particulière d’AC, plus de 30 gènes impliquant des voies physiopathologiques variées ont été identifiés et mais de nombreux patients restent sans diagnostic génétique.

Objectif, patients et méthodes : Afin d’identifier de nouveaux gènes candidats, nous avons réalisé une analyse d’exome en solo chez 20 patients atteints d’AC issus d’union consanguine, ayant bénéficié d’une IRM, d’une SNP array et d’explorations initiales ne conduisant pas à un diagnostic syndromique, sélectionnés parmi 200 patients de notre cohorte. Les variants ont été filtrés en fonction de leur fréquence dans les bases de données, leur pathogénicité et la nature du gène candidat, en privilégiant d’une part les variants homozygotes, et d’autre part, les  variants situés dans l’un des gènes de notre liste de gènes connus (dominants et récessifs) impliqués dans les AC et les APDP. La cohorte de réplication a été utilisée pour rechercher une récurrence de variants pathogènes dans les  gènes nécessitant validation (nouveau phénotype, nouveau gène).

Résultats : Nous avons identifié des variants causals ou très probablement causals chez 15/20 des patients (75%) : chez 5 patients, il s’agit de variants pathogènes dans 4 gènes connus d’AC (3) et d’APDP (1); chez 8 patients, de variants pathogènes dans 5 gènes impliqués dans d’autres phénotypes neurologiques, dont 3 gènes responsables d’un tableau d’encéphalopathie épileptique précoce (STXBP1, CACNA2D2, BRAT1); chez 2 patients, de variants dans 2 nouveaux gènes candidats. Chez 3/15 patients, malgré la consanguinité, une mutation dominante de novo a été identifiée (gènes ITPR1, STXBP1). La cohorte de réplication a permis d’observer une récurrence pour 4 des 5 gènes nécessitant validation.

Conclusion : cette étude a permis l’identification du gène responsable de l’AC chez 75% de nos patients. Elle confirme la part non négligeable des mutations de novo dans les AC comme dans d’autres pathologies neurodéveloppementales, même en cas de consanguinité. Enfin, elle illustre l’importante hétérogénéité génétique des AC et permet d’établir un lien physiopathologique certain entre celles-ci et certaines formes d’encéphalopathies épileptiques.

La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie complexe avec une composante génétique importante. Des variants rares de TREM2, SORL1 et ABCA7 ont été récemment associés au risque de MA. Néanmoins, les analyses étaient restreintes en termes de variants, de catégories d’âge de début, ou de tailles d’échantillons.

Afin d’évaluer l’effet des variants rares de ces gènes sur le risque de MA, nous avons généré et analysé les données d’exomes (n=2106) et de génomes (n=955) d’ADES-FR, une étude collaborative comprenant les effectifs parmi les plus importants de cas (1779) – contrôles (1273) dans la MA. Les cas sont répartis selon l’âge de début précoce ( < 66 ans, n=852) et tardif (n=907). Nous avons réalisé une détection multi-échantillons des variants et des contrôles qualité extensifs, suivis d’une analyse d’association au niveau du gène par tests de charge (burden test) et de variance (SKAT), focalisée sur les gènes TREM2, SORL1 et ABCA7, et 3 gènes dont une association avec la MA a récemment été décrite mais reste controversée : PLD3, AKAP9 et UNC5C.

L’aggrégation des variants rares (MAF < 1%) disruptifs (non-sens, sites canoniques d’épissage, ou décalant le cadre de lecture) et faux sens prédits délétères par les 3 outils utilisés (strictement délétères, SD), a permis d’identifier une association significative à l’échelle de l’exome (p < 2,5e-6) entre le risque de MA précoce et TREM2 (OR (odds ratio)=6.3, 95% IC=[2.9-13.9], p=2.3e-7), SORL1 (OR=3.4 [2.1-5.6], p=1.6e-7) et ABCA7 (OR=2.5 [1.7-3.8], p=9.3e-7). L’association avec TREM2 était robuste à l’exclusion du variant p.R47H, rapporté comme associé avec le risque de MA. Aucun signal ne passait le seuil de significativité requis concernant les patients avec une MA à début tardif et une significativité de l’ordre de 10-6 était observée pour l’ensemble des patients pour les variants disruptifs et SD (DSD) de TREM2 (OR=4.8 [2.3-10.1], p=6.2e-6). Aucune association n’a été identifiée avec les variants rares de PLD3, UNC5C et AKAP9.

Avec une MAF cumulée de 0.63% parmi les contrôles et un OR de 6.3, les variants rares DSD de TREM2 expliquaient 1.17% de l’héritabilité de la MA précoce, ceux de SORL1 en expliquaient 1.42% (OR=3.4, MAF cumulée de 1.89%), et pour ABCA7, 1.33% (OR=2.5, MAF cumulée de 3.22%). En comparaison, 9.12% de l’héritabilité de la MA précoce était attribuable au facteur de risque commun à effet fort APOE4.

Notre étude confirme et élargit les résultats d’association au niveau du gène concernant TREM2, SORL1 et ABCA7, et précise les catégories de variants et de patients. Avec des échelles d’effets différentes (TREM2 > SORL1 > ABCA7) et des MAF cumulées inversement corrélées, les variants rares DSD des 3 gènes contribuent de manière similaire à l’héritabilité de la MA précoce. Ces résultats constituent une première étape vers un calcul de risque personnalisé permettant potentiellement une médecine génomique préventive dans la MA précoce, en plus des très rares formes autosomiques dominantes.

Les paraplégies spastiques héréditaires sont des maladies neurologiques rares, phénotypiquement et génétiquement très hétérogène, avec une prévalence estimée à 5/100 000 hab. en Europe. Ces pathologies se caractérisent principalement par la présence d’un syndrome pyramidal progressif et d’une spasticité des membres inférieurs dans les formes « pures », les formes « complexes » étant associées de façon variable à un ou plusieurs signes neurologiques ou extraneurologiques.. En plus d’une grande hétérogénéité clinique, ces pathologies sont également caractérisées par une diversité des modes de transmission (autosomique dominant ou récessif, lié à l’X, mitochondrial) et des gènes impliqués. A ce jour, des mutations ont été décrites dans plus d’une soixantaine de gènes. Nous avons récemment développé une stratégie de séquençage ciblé moyen débit permettant l’étude simultanée de 65 gènes. Depuis son utilisation en routine, plus de 800 patients ont pu être explorés dans le cadre d’un diagnostic moléculaire de paraplégie spastique. Pour 28% des patients explorés, il a été possible d’identifier le gène responsable de la pathologie, et pour 10% des cas, des études de ségrégation de variant(s) dans la famille sont encore nécessaires pour statuer définitivement. Si comme attendu le panel a permis d’identifier des mutations dans des gènes fréquemment mutés dans les paraplégies spastiques (ATL1/SPG3A, SPAST/SPG4, SPG7 et SPG11) il a également permis d’observer de nombreux cas de patients portant une mutation du gène KIF1A/SPG30. Le gène KIF1A avait initialement été décrit comme responsable de paraplégie spastique de forme complexe et de transmission autosomique récessive, mais plusieurs publications ont depuis montré son implication chez des patients présentant des paraplégies spastiques de transmission autosomique dominante avec des formes pures ou complexes. Notre grande série de patients présentant une mutation du gène KIF1A (plus de 30 patients) démontre[A1]  que ce gène est le 2^nd gène le plus fréquemment impliqué dans cette pathologie (après le gène SPAST/SPG4) et qu’il est très majoritairement associé à des formes dominantes ou de novo. Les mutations observées sont quasi exclusivement du type faux-sens et localisées dans le domaine moteur de la protéine qui appartient à la famille des kinésines. Une situation similaire est retrouvée pour le gène KIF5A qui code également pour une protéine de cette famille. .Ces observations tendent à soutenir l’hypothèse déjà développée que les mutations de ces 2 gènes seraient des mutations de type dominant négatif.

Les démences lobaires frontotemporales (DLFT), bien que considérées comme des maladies rares, représentent la seconde cause de démences dégénératives précoces après la maladie d’Alzheimer. Les DLFT sont caractérisées par des troubles du comportement ou une atteinte du langage. Une sclérose latérale amyotrophique liée à une atteinte des motoneurones est associée chez près de 15% des cas (DLFT-SLA).

Les formes familiales représentent près de 40% des DLFT. Les mutations de C9ORF72, GRN et MAPT expliquent la majorité de ces formes. En revanche il y a très peu de connaissances pour expliquer la variabilité de l’âge de début des symptômes. Ces derniers peuvent apparaitre durant la trentaine pour les formes les plus précoces jusqu’à des cas de pénétrances incomplètes chez des sujets âgés, en particulier dans les formes avec mutations C9ORF72 et GRN. Le but de ce travail est de caractériser les variations génétiques pouvant influencer l'âge de début des symptômes.

Notre étude est basée sur les données cliniques, généalogiques et génétiques d’une cohorte de 504 patients issus de 223 familles C9ORF72 (n=133) et GRN (n=90). L’objectif était de : 1) évaluer l’héritabilité de l’âge de début des symptômes; 2) analyser les profils de corrélations phénotypiques intrafamiliales; 3) identifier les loci responsables dans ces deux formes génétiques.

L’analyse des familles DLFT C9ORF72 nous a permis d’estimer à 42% (P = 1.10^e-4) et 62% (P = 8.10^e-5) l’héritabilité de l’âge de début des symptômes selon le mode début de la maladie considéré (DLFT et/ou SLA ou DLFT pure). L’analyse approfondie des profils particuliers de corrélations phénotypiques intrafamiliales a également permis de suggérer un lien entre de possibles modificateurs et le chromosome X. L’étude des familles DLFT GRN a révélé une estimation d’héritabilité moindre ainsi que de plus faibles niveaux de corrélations phénotypiques intrafamiliales.

Les analyses familiales de liaison et d’association entre paires d’apparentés avec des phénotypes concordants et discordants et mutés pour C9ORF72 ou GRN ont, entre autre, mis en évidence deux nouveaux loci candidats avec des scores suggestifs de liaison et d’association. Un des deux loci se situe sur le chromosome X incluant cinq gènes d’intérêt majeur. Des investigations supplémentaires sont en cours pour augmenter la taille de notre cohorte et mettre en évidence les variations impliquées.

L’ensemble de ce travail illustre l’intérêt d’utiliser des approches familiales dans une maladie rare pour mettre en évidence de nouveaux modificateurs génétiques. Malgré une cohorte de taille restreinte, cette méthodologie couplée à des données phénotypiques précises nous a permis d'émettre des hypothèses quant à la présence et la localisation d’éventuels modificateurs génétiques et de mettre en évidence des nouveaux loci qui n’auraient pas été obligatoirement détectés par des approches méthodologiques différentes de type cas-contrôles.

Soutenue par la Direction de l’Hospitalisation et de l’Organisation des Soins (DHOS), la technique d’Analyse Chromosomique sur Puce à ADN (ACPA) a été implantée dans les laboratoires de diagnostic dès 2007. Douze centres coordonnateurs, en relation avec 44 CHU ont été retenus permettant de couvrir l’ensemble du territoire national. Le réseau AChroPuce a été constitué en 2008 aux Assises de génétique à Lille avec pour objectifs principaux d’harmoniser les pratiques, rédiger un guide de bonnes pratiques, mettre en place un EEQ et favoriser les études collaboratives. En 10 ans, ces objectifs ont été atteints et même dépassés avec en plus le transfert en diagnostic de l’ACPA en période prénatale, un travail sur l’accréditation de l’ACPA, le partage de sondes pour les vérifications FISH, une réflexion éthique sur les données secondaires, une négociation des tarifs commerciaux au niveau national, l’organisation d’une base de données nationale de variations du nombre de copies (CNV) et plus de 100 publications scientifiques en collaboration.

Le nombre d’ACPA réalisé par an est passé de 500 à environ 21 000 en 10 ans. Dix ans plus tard et avec l’arrivée de la technique de Whole Genome Sequencing (WGS), dont le transfert en diagnostic pour les maladies rares et le cancer est prévu dans le cadre du plan France Médecine Génomique 2025 et qui se concrétisera par la mise en place d’ici fin 2018 des deux plateformes pilotes de séquençage à très haut débit, se pose la question des perspectives de ce réseau. En effet, les algorithmes d’analyse de variations du nombre de copies vont s’améliorer ainsi que ceux pour la détection de variations structurales équilibrées. De ce fait, dans 5 ans la technique de WGS sera capable de détecter des CNV de façon aussi fiable que l’ACPA. Néanmoins, les compétences pour analyser les CNV perdureront et devront même être renforcées puisque des CNV de plus petite taille pourront également être détectées. A l’avenir, la séparation entre génétique moléculaire et cytogénétique sera amenée à disparaître d’un point de vue technologique. Deux grandes options sont alors envisageables : soit former des spécialistes des variants structuraux équilibrés et déséquilibrés (SV) et des spécialistes des variants nucléotidiques (SNV) qui travailleront en synergie, soit former des spécialistes d’une thématique (déficience intellectuelle, infertilité...) qui analyseront aussi bien les CNV que les SNV. De toute manière, il sera indispensable de poursuivre la formation à la physiopathologie chromosomique, nécessaire au conseil génétique des réarrangements génomiques. Seront discutées les perspectives du réseau et les objectifs à atteindre eu égard i) à la question fondamentale de l’organisation future des laboratoires de génomique et ii) à la mise en place du réseau NGS-Diag, avec en perspective le Plan National Maladies Rares 3 et des liens avec le plan France Médecine Génomique 2025.

L’épilepsie est une maladie neurologique grave qui se caractérise par une récurrence non provoquée de crises convulsives. La biologie des systèmes et les analyses de réseaux de gènes constituent des approches puissantes pour étudier les voies moléculaires impliquées dans l’épilepsie. Elles ont aussi déjà permis de pointer de nouvelles cibles thérapeutiques.

Des données en accès libre issues de plusieurs types d’études ont été ré-analysées en utilisant des approches de génomique intégrative basées sur l’analyse des réseaux de gènes et de protéines. La nouvelle exploitation de ces données a permis l’identification du réseau M30. Le réseau M30 se compose de 320 gènes largement exprimés dans le cerveau humain sous un contrôle étroit pendant le développement. Ces gènes codent principalement pour des protéines qui interagissent entre elles et qui sont impliquées dans des processus synaptiques. L’altération fonctionnelle de M30 par des variations génétiques rares ou communes, et la diminution de son expression semblent constituer un mécanisme convergent influençant la susceptibilité à l’épilepsie et aux crises d’épilepsie en général.

En tirant profit des changements d’expression induits par des médicaments rapportés dans la base de données “Connectivity map” (CMap) pour 1,300 composés thérapeutiques, nous avons pu sélectionner les médicaments dont l’effet sur l’expression de M30 est d’inverser la diminution d’expression observée dans les cerveaux épileptiques. Les meilleurs résultats ont été obtenus pour l’acide valproïque (anti-épileptique plus connu sous le nom commercial de Depakine), apportant une nouvelle preuve de concept au paradigme de réversion de la signature transcriptionnelle comme stratégie thérapeutique. Le dépistage systématique de médicaments en fonction de leur effet mesuré sur l'expression des gènes a également prédit que la withaferine A (WFA) inverse les changements d'expression de M30 associés à l'épilepsie.

Au total, nos résultats suggèrent qu’en ciblant le réseau M30 on pourrait identifier de nouvelles molécules anti-épileptiques et développer de nouvelles stratégies thérapeutiques contre l’épilepsie (Genome Biology 2016, doi: https://doi.org/10.1186/s13059-016-1097-7).

Contexte

Les mutations des gènes BRCA1/2 et PALB2, recherchées en routine dans les contextes évocateurs de prédisposition aux cancers du sein ou de l‘ovaire, expliquent moins de 10% des histoires familiales. Or ces dernières années l’apport des technologies de séquençage haut débit a permis de rendre possible l’analyse simultanée d’un grand nombre de gènes (analyse en panel de gènes) pour lesquels un lien avec une augmentation des risques de ces cancers a été rapporté.

En France, en l’absence de référentiel, les pratiques diffèrent aussi bien pour la sélection des nouveaux gènes analysés en panel que pour la prise en charge des personnes chez qui une mutation germinale a été identifiée.

Ainsi le Groupe Génétique et Cancer GGC (UNICANCER) a constaté que l’utilité clinique de la recherche de mutation de ces nouveaux gènes était à préciser. Ceci a incité les acteurs du GGC à conduire un travail visant à définir le panel de gènes à analyser dans la prédisposition au cancer du sein ou de l’ovaire, et à établir des recommandations spécifiques à chaque gène expertisé pour la prise en charge clinique des familles.

Méthodologie

Une analyse critique de la littérature par un groupe de travail composé de membres du GGC a permis de retenir les données permettant des estimations de risque sans biais. Les gènes ont été reconnus d’utilité clinique lorsque le sur-risque de cancer du sein (ou de l’ovaire) était au moins 4 fois supérieur au risque en population générale (différentiel de risque permettant de proposer dans une famille des tests génétiques pré symptomatiques : Easton et al, N Engl J Med 2015 Gene-panel sequencing and the prediction of breast-cancer risk).

Résultats

En pratique, parmi les 18 gènes d’intérêt (en plus de BRCA1 et BRCA2) expertisés, le GGC retient un panel de 13 gènes d’utilité clinique confirmée qu’il recommande d’analyser devant tout contexte évocateur d’une prédisposition aux cancers du sein ou de l’ovaire : BRCA1, BRCA2, PALB2, TP53, CDH1, PTEN, RAD51C, RAD51D, MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 et EPCAM. Il dresse également l’argumentaire ayant conduit à ne pas retenir les 7 autres gènes (CHEK2, ATM, BARD1, BRIP1, NBN, RAD51B, STK11). De plus, grâce à ce travail, le groupe présente pour chaque gène expertisé les préconisations de dépistage, de prévention et de conseil génétique dans les familles, que les données scientifiques actuelles et les référentiels autorisent.

Perspectives

Les laboratoires d’oncogénétique s'organisent pour appliquer ce nouveau panel avec les critères de qualité et les réseaux d'expertises associés. De plus un protocole de recherche (TUMOSPEC), promu par UNICANCER, est actuellement mis en place pour estimer plus précisément les risques de cancer en relation avec un ensemble de gènes notamment ceux non retenus dans le panel actuel. Compte tenu de la rapidité d'évolution des connaissances, une mise à jour annuelle des données est prévue par le groupe de travail, avec une attention particulière pour les gènes ATM, CHEK2 et STK11.

La proprotéine convertase subtilisin kexin de stype 9 (PCSK9) est un régulateur majeur de l’homéostasie du cholestérol, en contrôlant l’expression du récepteur aux LDL (LDLR) au niveau du foie. Alors que les mutations gain de fonction (GOF) de PCSK9 sont associées à l’hypercholestérolémie autosomale dominante (ADH) et à une athérosclérose précoce, les mutations perte de fonction (LOF) ont un effet cardioprotecteur et peuvent conduire dans certain cas au développement d’une hypobétalipoprotéinémie familiale (FHBL). Bien que des traitements contre l’ADH ciblant PCSK9 sont disponibles, les modèles cellulaires actuels permettant de mieux comprendre les fonctions de PCSK9 sont limités.

Notre objectif a été de valider le modèle de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPS) générées à partir de cellules urinaires pour la modélisation de l’ADH et de la FHBL liées aux mutations de PCSK9.

Pour atteindre notre objectif, nous avons utilisé des échantillons d’urines de patients porteurs de différentes mutations de PCSK9, ou de sujets sains, comme source de cellules somatiques pour obtenir des cellules hiPS après reprogrammation via des vecteurs épisomaux. Les cellules hiPS ont ensuite été différenciées en hépatocytes afin d’en étudier le phénotype.

Comparés aux cellules contrôles, les hépatocytes portant la mutation GOF S127R secrètent moins de PCSK9 et montrent une diminution de 71% de l’internalisation des LDL, alors que les hépatocytes portant la double mutation hétérozygote LOF R104C/V114A présentent une forte décroissance de la sécrétion de PCSK9 et une augmentation de 106% de l’internalisation des LDL. Un traitement par statine (pravastatine) stimule l’expression génique du LDLR et de PCSK9, ainsi que la sécrétion de PCSK9 et l’internalisation des LDL à la fois dans les cellules contrôles et les cellules de patients hypercholestérolémiques portant la mutation GOF S127R. De plus, l’augmentation de l’internalisation du LDL de 2,19 ± 0,77 par les hépatocytes S127R traités par la pravastatine (versus 1,38 ± 0,49 pour les hépatocytes contrôles) reflète la bonne réponse clinique aux statines (-60,4% ; n=5) des patients portant cette même mutation.

En conclusion, les échantillons d’urines sont une source remarquable de cellules somatiques pouvant être reprogrammées en cellules hiPS et différenciées en hépatocytes pour l’étude de maladies métaboliques. Ce modèle va nous permettre de mieux comprendre les fonctions de PCSK9 dans la régulation du métabolisme les lipoprotéines telles que l’apolipoprotéine B ou l’énigmatique Lp(a). Enfin, nous entreprenons une différentiation des cellules hiPS en 3 dimensions dans un format 96 puits pour optimiser la fonctionnalité des hépatocytes et adapter leur utilisation en analyse en haut débit (high content screening) et plus largement en pharmacogénomique en collaboration avec l’entreprise HCS Pharma.

L’épidermolyse bulleuse dystrophique récessive (EBDR) est l’une des maladies génétiques cutanées les plus graves de l’enfant et de l’adulte jeune. L’EBDR est due à des mutations du gène COL7A1 entraînant une perte de fonction du collagène VII (C7). C7 est secrété localement par les kératinocytes épidermiques et les fibroblastes dermiques. Il est le composant principal des fibrilles d’ancrage, structures essentielles pour l'adhésion de l’épiderme au derme sous-jacent. Les sujets atteints d’EBDR présentent des bulles et des décollements cutanéo-muqueux secondaires à des traumatismes minimes, responsables de plaies chroniques et de nombreuses complications locales (pseudosyndactylies, contraction et fibrose cutanée, sténose oesophagienne) et systémiques (inflammation, dénutrition, anémie). La survenue de carcinomes épidermoïdes cutanés agressifs sur les plaies chroniques reste la première cause de décès de ces jeunes patients. Il n’existe pas à ce jour de traitement spécifique.

Les injections locales et systémiques de cellules stromales mésenchymateuses (CSM) allogéniques dérivées de la moelle osseuse ont montré leur potentiel pour réduire l'inflammation cutanée et améliorer la cicatrisation des plaies chez les patients EBDR. Ces améliorations cliniques sont cependant transitoires. Les mécanismes d'action des CSM dans l’EBDR et leur durée de vie après injection sont mal connus. Les CSM pourraient agir via leurs propriétés anti-inflammatoires, l'expression de C7 endogène par un effet paracrine et/ou l'expression de C7 par les CSM injectées. Dans cette étude, nous avons étudié l'expression de C7 par les CSM injectées par voie intradermique dans un modèle murin de xénogreffe EBDR. Ce modèle consiste en la greffe d’une peau reconstruite à partir de cellules de patients EBDR homozygotes pour une mutation nulle de COL7A1 sur des souris immunotolérantes. La persistance des cellules injectées et la durée d’expression de C7 ont été analysées.

Les CSM utilisées pour l’injection locale expriment in vitro une quantité d’ARNm de COL7A1 et de C7 comparable aux fibroblastes dermiques sains. L'injection intradermique d'une dose unique de CSM dans la peau EBDR reconstruite a permis de restaurer une expression de C7 humain normal produit par les cellules injectées. Le dépôt de C7 à la jonction dermo-épidermique est comparable au contrôle et persiste jusqu'à 6 mois après l'injection. La présence des CSM dans la peau reconstruite a été analysée par FISH et montre une persistance de celles-ci jusqu'à 4 mois après l'injection. Ces données montrent que les CSM injectées par voie intradermique ont le potentiel de restaurer l’expression de C7 normal in vivo de façon prolongée et d'améliorer l'adhésion dermo-épidermique de la peau EBDR.

Le nombre de grossesses gémellaires n’a cessé d’augmenter en France depuis plus de 25 ans pour atteindre 1,74% des naissances en 2014 (INED). Les algorithmes utilisés dans le calcul du risque de trisomie 21 dans le cadre du dépistage anténatal ne sont pas validés en cas de grossesse multiple. Face à l’absence d’un test de dépistage de la trisomie 21 fiable dans cette situation, l’Association des Cytogénéticiens de Langue Française préconise la réalisation d’un test de dépistage prénatal non invasif de la trisomie 21.

Les laboratoires Biomnis et du CHU de Lyon réalisent ce test dans cette indication respectivement depuis décembre 2014 et avril 2016. Tous deux utilisent une approche de séquençage génome entier à faible profondeur. Le laboratoire Biomnis utilise une technologie Illumina (Verinata puis VeriSeq) alors que le CHU de Lyon utilise un séquenceur semiconducteur Proton (Life Technologies) et analyse des données avec le logiciel WISECONDOR (protocole Consortium H+). Le CHU de Lyon ne réalise pas d’estimation de la fraction fœtale.

Sur un total de 20107 tests réalisés, 1697 l’ont été pour des grossesses gémellaires (8.4%). L’âge moyen au prélèvement était de 34,1 ans contre 35,7 ans pour les grossesses simples. Le terme moyen de grossesse était de 15,9 semaines d’aménorrhée (SA) contre 16,8 SA en cas de grossesse simple. Sur 1695 résultats rendus, 13 étaient en faveur d’une trisomie 21 (0.77%), 1682 étaient négatifs pour la trisomie 21. Lors de la confirmation par caryotype sur ponction de liquide amniotique, 9 patientes étaient effectivement porteuses d’un fœtus trisomique 21 (grossesses bichoriales biamniotiques) dont un cas de trisomie 21 libre en mosaïque à 12%. Deux patientes ayant reçu un résultat positif sont perdue de vue ou en cours d’étude. L’un des deux cas de résultat faussement positif est une grossesse gémellaire pour laquelle l’un des fœtus est décédé pendant la réalisation du test sans qu’une étude cytogénétique n’ait pu être menée. Par ailleurs, nous avons identifié 2 résultats faux négatifs (naissance d’un enfant trisomique 21) dont un pour lequel le résultat avait été rendu douteux sur un premier prélèvement. En ne considérant que les prélèvements pour lesquels l’issue de grossesse est connue ce jour (n=862) on peut établir sur notre série des valeurs prédictives positive et négative du test de 81.8% et 99.7 % respectivement. Il est à noter que 9 tests ont été réalisés pour des grossesses triples. Les résultats étaient tous négatifs.

Si l’ensemble des issues de grossesse n’est pas encore connu, nos résultats montrent les bonnes performances du test de dépistage prénatal non invasif de la trisomie 21 en cas de grossesses gémellaires. Ces performances sont en accord avec les rares données de la littérature et doivent faire l’objet d’une collaboration de plus grande ampleur.

Les techniques de cytogénétique moléculaire, comme l’Analyse Chromosomique sur Puce à ADN (ACPA) permettent la détection de grands réarrangements, pertes ou gains de matériel génétique de plus de 1kb, nommés CNV (Copy Number Variation).

Ces CNVs sont souvent identifiés et associés à des maladies génétiques comme les déficiences intellectuelles. Plus de 100 000 analyses ACPA ont été réalisées à ce jour dans les laboratoires de diagnostic du réseau AchroPuce, et cette activité est évaluée à environ 20 000 analyses par an en France. Les technologies de séquençage à haut débit (NGS) permettent également de détecter les CNVs. L’un des enjeux majeurs de ces analyses (ACPA et NGS) est l’interprétation permettant de classer un CNV en pathogène ou bénin. Malheureusement de nombreux CNVs sont encore classés comme "VOUS" (Variant Of Unknown Significance) rendant le conseil génétique difficile. Connaître leur fréquence, dépendante de l’origine ethnique des patients, permettrait d’aider à leur interprétation. Afin de colliger les données de CNVs au niveau national et permettre le partage des informations facilitant leur interprétation, nous avons développé BANCCO (https://bancco.fr).

BANCCO est un système sécurisé permettant le stockage des données génomiques et phénotypiques grâce à une base de données PostgreSQL. BANCCO propose une interface web sécurisée conviviale développée en HMTL5, PHP et JavaScript et a obtenu l’accord CNIL (2071658v1).

Les utilisateurs ont accès à différents modules de saisie des données phénotypiques, d’import des CNVs (avec système de conversion automatique des coordonnées génomiques entre les 3 dernières versions du génome), de recherche de patients ou de CNVs selon différents critères et un Genome Browser permettant une visualisation simplifiée de l’ensemble des informations de BANCCO.

La description phénotypique des patients se fait à l’aide de l’ontologie HPO (Human Phenotype Ontology) recommandée par l’IRDiRC. Une fiche CNV présente le nombre d’observations, le mode de transmission, la liste des gènes, l’ensemble des CNVs issus de base de données publiques (dbVar, DGV et Clingen), les patients porteurs du même CNV avec un lien vers le centre de référence associé afin de faciliter les échanges et les collaborations, et l’ensemble des CNVs de BANCCO chevauchant ce CNV avec le pourcentage de couverture commune.

Dans le but de faciliter l’interprétation de ces mutations, BANCCO est lié à la base RDVD (Rare Disease Variant Database – https://rdvd.fr) contenant des SNVs (Single Nucleotide Variation) couplés également à des données phénotypiques.

Plusieurs formats d’import ont été implémentés afin de centraliser les données précédemment collectées par l’ensemble des centres. A ce jour BANCCO rassemble 34 157 CNVs identifiés chez 18 849 patients issus de 12 centres du réseau AChroPuce. Le phénotype est décrit à l’aide de 2 267 termes HPO permettant ainsi de faciliter l’interprétation des CNVs et le Match Making.

Depuis l’implémentation  des séquenceurs haut débit (NGS) dans les laboratoires diagnostiques de génétique moléculaire et dans le contexte du plan National Médecine Génomique 2025, une des priorités est la maîtrise, standardisation et automatisation des pipelines bioinformatiques. L’INCa a initié le projet national « Structuration du séquençage de nouvelle génération à visée diagnostique en cancérologie». Dans ce cadre, notre équipe a développé des pipelines validés et automatiques ainsi qu’un outil interfacé de stockage et de manipulation de variants annotés. Cet outil répond à l’absence de solution gratuite suffisamment robuste et qualifiée pour le diagnostic. Actuellement, CanDiD est utilisé par les équipes partenaires et a permis de réaliser le diagnostic chez plus de 11000 patients en oncogénétique, en neurogénétique et en génétique des maladies métaboliques. CanDiD est en validation pour des applications en génétique somatique des cancers et en transfert vers d’autres centres de génétique.

CanDiD peut intégrer dans sa base de données (BDD) l’ensemble des variations et annotations issues des pipelines de NGS. Son système évolutif de type « clef-valeur » permet l’insertion dans la BDD de tout type de donnéesquel que soit le logiciel de « variant-calling » ou d’annotation utilisé. Après configuration de l’«application programming interface » (API) selon les besoins de chaque plateforme et type de diagnostic, les données sont mises à disposition, de manière sécurisée et standardisée, dans une interface graphique «utilisateur». Cette interface, en lien avec l’API, permet à l’utilisateur d’analyser les patients par série de validation personnalisable avec ses propres critères de filtration des variants. Il est possible (i) d’écrire des scenarii de validation linéaire afin de standardiser les analyses, optionnellement avec la création de sous jeux de données (augmentation des performances d’accès) et (ii) d’explorer à façon l’ensemble du jeu de données en accès complet avec la BDD via un moteur de requête graphique. CanDiD permet le calcul de la fréquence des variants et d’enregistrer des annotations privées de variants directement dans l’interface. L’utilisateur peut créer et organiser les annotations privées, notamment la classification en cinq classes selon les recommandations de l’ACMG, afin de conserver la mémoire de ces annotations et de garantir l’homogénéité d’interprétation des variants au fil du temps. Enfin, la gestion des droits permet, une fois le travail du généticien moléculaire terminé, de verrouiller en modification la série et d’exporter les données sous forme de rapport. Des liens contextuels vers les logiciels de navigation sur le génome sont paramétrés et les interfaces vers un système de gestion de laboratoire possibles. Les sources informatiques sont rendues librement disponibles sur un dépôt public localisé en France. https://gitlab.normandy-genomic-medicine.fr/

La famille des protéines de liaison au chromodomaine hélicase de l’ADN (CHD) est essentielle  au remodelage de la chromatine et utilise l’énergie issue de l’hydrolyse de l’ATP pour réguler la structure de la chromatine, modulant ainsi l’expression des gènes. Plusieurs gènes codant pour des protéines de cette famille ont été impliqués en pathologie humaine (CHD2, CHD7, CHD8) mais jamais CHD3  jusqu’à présent. Nous rapportons ici une série internationale de 33 patients, constituée grâce à GeneMatcher, porteurs de variants de novo dans CHD3, identifiés par NGS. Tous  les patients ont un retard de développement avec une hypotonie fréquente, une déficience intellectuelle légère à sévère et une atteinte marquée du langage. Les troubles du comportement sont fréquents. La plupart sont macrocéphales  avec une dysmorphie reconnaissable avec un front haut et large, un hypertélorisme, un épicanthus, un œdème sus orbitaire, des fentes palpébrales étroites et un menton pointu.  La plupart des variants sont des faux-sens et se situent dans le domaine ATPase/helicase ou à proximité. L’étude de l’impact fonctionnel de plusieurs de ces variants à l’aide de modèles cellulaires montre pour certains un impact sur l’activité ATPase. En conclusion, les variants du gène CHD3 sont responsables d’un nouveau syndrome neuro-développemental reconnaissable.

La déficience intellectuelle (DI) touche 1 enfant sur 250, de causes génétiques, acquises et/ou environnementales. Alors que les formes sévères sont le plus souvent d’origine monogénique, les formes moyennes et modérées sont souvent liées à une conjonction de facteurs génétiques et environnementaux. Les causes génétiques en sont multiples avec un vaste ensemble de maladies rares ou exceptionnelles. Plus de 500 gènes OMIM sont associés à des DI isolées et près de 2000 gènes à des DI syndromiques. Au cours de ces dernières années, les nouvelles technologies de séquençage haut-débit pan-génomique ont largement prouvé leur efficacité à identifier les bases moléculaires des pathologies rares avec une grande hétérogénéité clinique et génétique. Cependant, de nombreux résultats demeurent non-concluants car les corrélations génotype-phénotype sont limitées par la rareté de la récurrence de la maladie. La mise en place d’un réseau de partage des données internationales a permis d’augmenter les chances d’identifier d’autres patients avec un phénotype similaire et de mettre en évidence de nouveaux syndromes.

Dans cette étude, nous rapportons le cas d’une patiente présentant une DI associée à une microcéphalie, une dysmorphie faciale, une brachydactylie, des pieds courts, ainsi qu’une hypoplasie du corps calleux. Un séquençage haut débit d’exome en trio a permis de mettre en évidence une mutation tronquante de novo, dans le gène HNRNPR. Trois patients additionnels ont été identifiés à la suite du partage des données par le réseau GeneMatcher. L’étude phénotypique a permis de retrouver des caractéristiques communes chez ces patients présentant tous une mutation tronquante sporadique du gène HNRNPR.

HNRNPR code pour une protéine de la superfamille des ribonucleo-protéines nucléaires (hnRNP) impliquées dans le métabolisme des acides nucléiques incluant le processus d’épissage, la stabilisation des ARNm ainsi que dans la régulation de la transcription et de la traduction. HNRNPR semble interagir spécifiquement avec les ARNm et impliqué dans des processus post-traductionnels. Le métabolisme des ARNm est particulièrement important pour le bon fonctionnement et la formation des synapses, ce qui explique que de nombreux gènes impliqués dans ce métabolisme sont associés à la DI. Les études fonctionnelles en cours sur les lignées cellulaires des patients permettront de mieux caractériser la fonction de la protéine HNRNPR et d’analyser l’impact des mutations tronquantes du gène HNRNPR dans le métabolisme des ARNm.

En conclusion, nous avons identifié un nouveau gène impliqué dans le métabolisme des ARNm, responsable de DI syndromique avec microcéphalie et agénésie/hypoplasie du corps calleux.

L’arhinie-microphtalmie (syndrome de Bosma, BAMS) est une anomalie de développement extrêmement rare et frappante caractérisée par l’absence complète de nez avec ou sans  anomalie ophtalmologique.  Nous rapportons ici des mutations faux-sens du gène SMCHD1 (Structural Maintenance of Chromosomes flexible Hinge Domain containing 1) dans la totalité de 14 cas sporadiques d’arhinie-microphtalmie recrutés dans 6 pays. De manière remarquable, ces mutations sont confinées aux exons de SMCHD1 codant pour le domaine ATP-ase élargi de ce régulateur épigénétique aux rôles pléiotropiques : inactivation du chromosome X, mécanismes d’empreinte génomique et réparation de cassures d’ADN double brin. Sans exception ces mutations sont survenues de novo chaque fois que les ADNs parentaux ont pu être testés.

Des analyses biochimiques et des tests dans le modèle d’embryons de Xénope suggèrent fortement que les mutations BAMS se comportent comme des allèles gain de fonction. Elles s’opposent ainsi à d’autres mutations SMCHD1 identifiées dans la myopathie facio-scapulo-humérale de type 2 (FSHD2) faisant de cette situation un cas d’expansion phénotypique assez extrême (CT Gordon et al. Nat Genet 2017).

Nos résultats permettent d’établir que SMCHD1 est un acteur majeur du développement de la pyramide nasale et ont un impact sur la recherche de ses gènes cibles essentiels dans la régulation de la formation cranio-faciale, malgré la très petite fenêtre développementale de la placode nasale et de la vésicule optique. Par le biais de la pathologie moléculaire, ils contribuent aussi à une meilleure connaissance de cette protéine, notamment de sa fonction GHKL-ATPase, et des propriétés enzymatiques qui pourraient être, à rebours, exploitées dans le développement de traitements innovants de la myopathie facio-scapulo-humérale de type 2. 

Des mutations gain-de-fonction de FGFR3 (fibroblast growth factor receptor 3) sont responsables de plusieurs formes de nanisme telles que l'achondroplasie, forme la plus fréquente; ainsi que la forme létale, le nanisme thanatophore. L'activation constitutive de FGFR3 perturbe le processus normal de croissance des os du squelette. Dans les ciliopathies squelettiques, caractérisées par des anomalies des protéines ciliaires, on retrouve également des anomalies de la croissance osseuse. L'impact des mutations gain-de–fonction FGFR3 sur le cil primaire dans les chondrocytes de la plaque de croissance est inconnu dans l’achondroplasie et le nanisme thanatophore.

Nous avons étudié le cil primaire dans des chondrocytes humain et murin porteurs de mutations FGFR3. Nous démontrons que dans les chondrocytes de la plaque de croissance dans l’achondroplasie, le nanisme thanatophore et les souris Fgfr3^Y367C/+, la longueur du cil primaire était réduite et que la protéine IFT20 était anormalement localisée à la base du cil lorsque FGFR3 était activé. Nous montrons que l'inhibition de FGFR3 avec un inhibiteur des récepteurs tyrosine kinase (PD173074) rétablissait la longueur du cil primaire et la localisation de IFT20 au niveau de l’axonème du cil. Nous avons également étudié l'impact de la rapamycine, un inhibiteur de la voie mTOR, sur le cil primaire. L'inhibition de mTOR corrige positivement la longueur du cil primaire et la localisation intraciliaire d’IFT20. L’ensemble de ces résultats suggère que la désorganisation de la plaque de croissance observée dans l’achondroplasie et le nanisme thanatophore due au FGFR3 activé pourrait potentiellement être attribuée au cil primaire. En conclusion, les chondrodysplasies liées à des mutations FGFR3 semblent être une nouvelle forme de pathologie squelettique avec une ciliogenèse défectueuse.

Les RASopathies est un groupe de pathologies autosomiques dominantes dues à des mutations des gènes de la voie RAS/MAPK. Ce mécanisme moléculaire commun est à l’origine d’une continuité phénotypique entre les RASopathies. Le syndrome de Noonan (SN) est la RASopathie la plus fréquente (1/1000 à 1/2500). Le syndrome cardio-facio-cutané (CFC) et le syndrome de Costello (SC) sont des RASopathies moins fréquentes mais plus sévères.

En Tunisie, les caractéristiques cliniques et génétiques des RASopathies sont peu étudiées.

L’objectif de notre travail était d’analyser le profil clinique et génétique des RASopathies chez une série de patients tunisiens et d’établir une corrélation génotype-phénotype.

Nous avons mené une étude descriptive rétrospective des patients suivis pour SN, syndrome CFC et SC au service des Maladies Congénitales et Héréditaires de l’hôpital Charles Nicolle de Tunis sur une période de 10 ans (2006 à 2016). Les critères d’inclusion étaient cliniques basés sur des scores objectifs. L’étude moléculaire a été réalisée par séquençage de type Sanger et par séquençage de nouvelle génération (NGS) des gènes impliqués dans les RASopathies.

Vingt-sept patients atteints de Rasopathies ont été inclus dans notre étude dont 25 cas sporadiques et un cas familial. La majorité des patients (21/27) avaient un SN. 5/27 patients avaient un syndrome CFC et 1/27 patient avait un SC. L’âge moyen des patients au moment du diagnostic était de 10 ans. Tous les signes cardinaux des Rasopathies ont été retrouvés à savoir : le retard statural postnatal (85%), la dysmorphie faciale typique (85%), la cardiopathie (81%) avec une prédominance de la sténose pulmonaire valvulaire, les atteintes cutanées (85%), les malformations typiques du sternum (48%) et le retard psychomoteur (63%). Des signes moins fréquents ont été retrouvés à savoir : la cryptorchidie (5/10 des patients de sexe masculin), le retard pubertaire (4/7 adultes), la scoliose (4/27), le strabisme (4/27), la myopie (5/27) et la surdité (1/27). Aucun patient n’a développé de tumeur maligne ni bénigne.

L’étude moléculaire a confirmé le diagnostic chez 17/21 patients testés : 13/17 cas de SN dont un cas de syndrome de Noonan avec lentigines multiples, 3/3 cas de CFC, 1/1 cas de SC. Les gènes mutés étaient par ordre de fréquence : PTPN11 (6/17), SOS1 (3/17), RIT1 (2/17), MEK1 (2/17), RAF1 (1/17), BRAF (1/17), NRAS (1/17) et HRAS (1/17).

Chez 2/21 patients testés des mutations nouvelles ont été identifiées dans des gènes récemment décrits dans le SN : LZTR1 et KAT6B. Dans les 2 cas restants, aucune mutation n’a été identifiée.

Le spectre clinique et génétique des RASopathies dans notre population sont similaires à ceux des autres populations. Une meilleure connaissance de ces pathologies et l’application des techniques de NGS dans le diagnostic de routine permettront un diagnostic rapide des RASopathies, une prise en charge adaptée et un conseil génétique adéquat.